一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法及应用 (Preparation method and application of aldehyde group modified agarose medium ) 是由 董垚 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法,步骤如下：琼脂糖小球与多聚甲醛修饰剂进行反应,得到醛基修饰的琼脂糖介质；进一步将醛基修饰的琼脂糖介质与乙二胺或三聚氰胺偶联,得到交联的琼脂糖醛基介质。本发明采用多聚甲醛和乙二胺/三聚氰胺偶联在琼脂糖凝胶表面和内部,使琼脂糖之间的高分子链增多,提高了琼脂糖空间结合能力和机械强度,从而避免了蛋白或化学物质会紧贴琼脂糖的表面,空间位阻遮蔽的现象发生。本发明制备方法简单,增加了交联后液体流速,且纯化速度和效果得到很大提升。(The invention provides a preparation method of an aldehyde group modified agarose medium, which comprises the following steps: reacting the agarose beads with a paraformaldehyde modifier to obtain an aldehyde group modified agarose medium; and further coupling the aldehyde group modified agarose medium with ethylenediamine or melamine to obtain the cross-linked agarose aldehyde medium. The invention adopts paraformaldehyde and ethylenediamine/melamine to be coupled on the surface and inside of the agarose gel, so that the macromolecular chains among the agarose are increased, and the spatial binding capacity and the mechanical strength of the agarose are improved, thereby avoiding the phenomenon that protein or chemical substances are attached to the surface of the agarose and are shielded by steric hindrance. The preparation method is simple, the flow rate of the crosslinked liquid is increased, and the purification speed and the purification effect are greatly improved.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法及应用。
背景技术
生物医药和检测领域会用到大量的纯化介质，纯化介质中最常使用的生物材料是琼脂糖。琼脂糖链依靠分子内和分子间氢键及其它力的作用使其相互盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶，具有很好的生物相容性及多孔性。
琼脂糖材料作为载体，在其分子表面通过化学反应连接活性分子，使其具有相应的功能。第一种常用的化学修饰有阴离子(磺酸基团)，阳离子(季铵盐)，使其在不同酸碱环境下带有正负电荷，来吸附需要的化学或者有机大分子。还可以连接上芳香烃类，使其变成疏水结合能力的介质。第二种常用修饰为具有偶联能力的分子，可以和羟基(OH-)、氨基(NH2-)、巯基(SH-)形成稳定的共价键结合，把被偶联的分子，蛋白等物质固定在介质表面。
现有技术中，常采用高碘酸氧化琼脂糖生成醛来结合氨基球生产琼脂糖球的方法，上述方法修饰的醛基团只有一个C链长度，所绑定的蛋白或化学物质会紧贴琼脂糖的表面，会导致空间位阻遮蔽，影响抗体或蛋白的结合，导致纯化效果差。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种纯化效果好、纯化速度快的一种新型醛基修饰的琼脂糖介质的生产方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂；
S2，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中进行反应，得到多聚甲醛修饰的琼脂糖介质。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1中，多聚甲醛修饰剂以体积百分比为100％计算，包括10-30％甲醇，3-8％多聚甲醛，1-3％pH值为1.5-3.5的酸性缓冲液，余量为水；
在以上技术方案的基础上，优选的，多聚甲醛修饰剂的制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，琼脂糖小球的制备方法为：将粒径为90-120μm，体积浓度为4-8％的琼脂糖小球用体积浓度为1-3％pH值为1.5-3.5的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2的反应过程为：将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在60-70℃条件下水浴反应30-40min，然后将反应液温度降至4-10℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:(0.5-3)。
在以上技术方案的基础上，优选的，还包括步骤S3，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖小球，得到多聚甲醛修饰的琼脂糖介质。
在以上技术方案的基础上，优选的，还包括步骤S4：将步骤S2制备的多聚甲醛修饰的琼脂糖介质加入多氨基化合物中，经偶联反应后得到交联氨基的琼脂糖介质。
在以上技术方案基础上，优选的，所述多氨基化合物为乙二胺或三聚氰胺。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述偶联反应包括如下步骤：
S41，用水冲洗多聚甲醛修饰的琼脂糖介质，并将其加入多氨基化合物中，在2-5℃条件下偶联反应10-12h；
S42，偶联反应结束后，加入硼氢化钠还原反应20-40min；
S43，还原反应结束后，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖介质，得到交联氨基的琼脂糖介质。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S41中琼脂糖介质和多氨基化合物的质量比为琼脂糖介质:多氨基化合物＝1:(0.001-0.1)。
另一方面，本发明还提供了一种醛基修饰的琼脂糖介质，由上述的制备方法制备得到。
再者，本发明还提供了一种醛基修饰的琼脂糖介质在血液透析或蛋白质纯化或抗体/抗原亲和层析中的应用。
本发明的一种醛基修饰的琼脂糖介质的生产方法相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明在60-70℃对琼脂糖进行多聚甲醛修饰，此时琼脂糖内部单链琼脂链状分子相对不完全分开，外观上琼脂介质不会融化，但是其结构开始松散，向琼脂糖内部加入多聚甲醛，再缓慢冷却后，聚甲醛分子会掺入到聚集的琼脂糖内部形成甲醛缠绕的琼脂糖介质。
(2)本发明通过加入适量的乙二胺或者三聚氰胺进行交联，得到双交联或多交联的琼脂糖醛基介质，相对于高碘酸氧化琼脂糖形成的未交联琼脂糖基介质，改善了琼脂糖介质的刚性，提高了交联后液体流速，纯化速度和效果得到很大提升。
(3)本发明的琼脂糖介质的交联后液体流速达到550-603cm/h，且一次就将血液抗体基本纯化干净。
(4)本发明的琼脂糖介质链接免疫球蛋白结合蛋白A、G和L后形成可以特异性结合血液igG和igM的亲和功能柱，用于抗体纯化，抗体药物生产方面。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例的醛基琼脂糖介质洗脱抗体图；
图2为对比例高碘酸氧化琼脂糖介质洗脱抗体图；
图3为实施例与对比例的SDS-page胶染色图；
图4为实施例与对比例的琼脂糖介质空间结合能力图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明中酸性缓冲液为醋酸缓冲液，柠檬酸-磷酸缓冲液，柠檬酸-醋酸缓冲液，磷酸缓冲液中的一种，所述上述缓冲液的制备方法为现有技术，现不做说明。用NaOH和HCl调节酸性缓冲液的pH值为1.5-3.5。
实施例一
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括10％甲醇，3％多聚甲醛，1％pH值为1.5的柠檬酸缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为90μm，体积浓度为4％的琼脂糖小球用体积浓度为1％pH值为1.5的柠檬酸缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在60℃条件下水浴反应30min，然后将反应液温度降至4℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:0.5。
S4，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖小球，得到多聚甲醛修饰的琼脂糖介质。
实施例二
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括20％甲醇，5％多聚甲醛，2％pH值为2.5的酸性缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为100μm，体积浓度为6％的琼脂糖小球用体积浓度为2％pH 值为2.5的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在65℃条件下水浴反应35min，然后将反应液温度降至10℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:1。
S4，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖小球，得到多聚甲醛修饰的琼脂糖介质。
实施例三
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括30％甲醇，8％多聚甲醛，3％pH值为3.5的酸性缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为120μm，体积浓度为8％的琼脂糖小球用体积浓度为3％pH 值为3.5的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在70℃条件下水浴反应40min，然后将反应液温度降至6℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:3。
S4，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖小球，得到多聚甲醛修饰的琼脂糖介质。
实施例四
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括15％甲醇，4％多聚甲醛，1％pH值为2的酸性缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为100μm，体积浓度为5％的琼脂糖小球用体积浓度为1％pH2 的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球。
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在65℃条件下水浴反应30min，然后将反应液温度降至8℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:2。
S4，水浴反应结束后，用水冲洗琼脂糖介质，并将其加入10μmol/ml乙二胺中，在2℃条件下偶联反应10h；琼脂糖介质和乙二胺质量比为琼脂糖介质: 乙二胺＝1:0.3。
S5，偶联反应结束后，加入50mmol/L硼氢化钠还原反应20min，琼脂糖介质和硼氢化钠质量比为琼脂糖介质:硼氢化钠＝1:0.001。
S6，还原反应结束后，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖介质，得到交联氨基的琼脂糖介质。
实施例五
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括25％甲醇，6％多聚甲醛，3％pH值为3的酸性缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为110μm，体积浓度为7％的琼脂糖小球用体积浓度为3％pH 值为3的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在65℃条件下水浴反应40min，然后将反应液温度降至5℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:2。
S4，水浴反应结束后，用水冲洗琼脂糖介质，并将其加入20μmol/ml三聚氰胺中，在5℃条件下偶联反应12h；琼脂糖介质和三聚氰胺的质量比为琼脂糖介质:三聚氰胺＝1:0.1。
S5，偶联反应结束后，加入50mmol/L硼氢化钠还原反应40min，琼脂糖介质和硼氢化钠的质量比为琼脂糖介质:硼氢化钠＝1:5；
S6，还原反应结束后，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖介质，得到交联氨基的琼脂糖介质。
实施例六
一种醛基修饰的琼脂糖介质的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制多聚甲醛修饰剂，以体积百分比为100％计算，多聚甲醛修饰剂包括25％甲醇，4％多聚甲醛，3％pH值为3.5的酸性缓冲液，余量为水；制备方法为：将多聚甲醛溶于水中，然后依次加入甲醇和酸性缓冲液，搅拌均匀后得到多聚甲醛修饰剂。
S2，将粒径为95μm，体积浓度为5％的琼脂糖小球用体积浓度为3％pH值为3.5的酸性缓冲液冲洗，去除保存液乙醇，得到干净的琼脂糖小球；
S3，将琼脂糖小球加入多聚甲醛修饰剂中，在70℃条件下水浴反应30min，然后将反应液温度降至7℃；其中琼脂糖小球和多聚甲醛修饰剂的质量比为琼脂糖:多聚甲醛修饰剂＝1:1。
S4，水浴反应结束后，用水冲洗琼脂糖介质，并将其加入10-20μmol/ml三聚氰胺中，在3℃条件下偶联反应11h；琼脂糖介质和三聚氰胺的质量比为琼脂糖介质:三聚氰胺＝1:0.01。
S5，偶联反应结束后，加入50mmol/L硼氢化钠还原反应30min；琼脂糖介质和硼氢化钠的质量比为琼脂糖介质:硼氢化钠＝1:4。
S6，还原反应结束后，用10％甲醇水溶液冲洗反应后的琼脂糖介质，得到交联氨基的琼脂糖介质。
对比例
以高碘酸氧化琼脂糖为对比例来验证本发明的技术效果：
高碘酸氧化琼脂糖的制备方法包括如下步骤：称取高碘酸钠加水溶解，配置浓度为0.05-0.4mol/l的高碘酸盐溶液，然后加入洗涤干净的琼脂糖凝胶中混匀，琼脂糖凝胶与高碘酸盐溶液的质量比为1:0.5，在4-50℃条件下搅拌或摇床反应1-10h，然后用大量水洗涤，除去未反应的高碘酸钠，抽干得到含有醛基的琼脂糖凝胶。
实验方法一
以柱层析验证本发明琼脂糖介质的刚性，以上述实施例和对比例的琼脂糖介质装柱，检测条件：层析柱16mm*300mm，柱床高15cm，25℃，流动相为 0.1mol/l NaCl，检测结果如下：
表1本发明琼脂糖介质的刚性特性
流速(cm/h)
耐压(MPa)
实施例一
522
0.320
实施例二
525
0.325
实施例三
536
0.324
实施例四
560
0.385
实施例五
603
0.413
实施例六
583
0.396
对比例
23
0.011
由表1可知，本发明实施例制备的醛基琼脂糖介质具有较快的流速和较高的耐压强度。其中实施例五的流速和强度最高，表明多聚甲醛和乙二胺/三聚氰胺偶联在琼脂糖凝胶表面和内部，琼脂糖之间的高分子链增多，提高了琼脂糖空间结合能力和机械强度，从而避免了蛋白或化学物质会紧贴琼脂糖的表面，空间位阻遮蔽的现象发生。
实验方法二
将实施例和对比例的琼脂糖介质与免疫球蛋白结合蛋白偶联，形成可以特异性集合血液igG和igM的亲和功能柱。以琼脂糖介质链接蛋白A形成可以特异性结合血液igG亲和功能柱为例，验证本发明琼脂糖的纯化效果。
使用蛋白A柱纯化小鼠血液中单抗igG，10ml血清使用2ml柱料进行纯化，血清流穿后使用PBS冲洗50ml，使用甘氨酸PH5.0冲洗得到A峰收集样品，使用甘氨酸PH2.5冲洗得到B峰收集样品，样品通过SDS-page胶染色鉴定纯度。抗体igG通过醛基偶联的proA柱纯化结果见图1-3。
图1为本发明实施例琼脂糖介质纯化抗体结果，10ml血清纯化出95mg igG 抗体；图2为对比例琼脂糖介质纯化抗体结果，10ml血清纯化出55mg igG抗体。表明本发明实施例制备的琼脂糖介质纯化率高，纯化效果好。
图3为本发明实施例和对比例的纯化效果图，图3-Ⅰ表明采用甘氨酸PH5.0 冲洗一次就可将血液抗体纯化干净；图3-Ⅱ可以看出冲洗一次后依然可以看见抗体，表明对比例琼脂糖的纯化效果较差，需要经过一次以上的冲洗才能将抗体纯化干净。
本发明采用多聚甲醛偶联制备的醛基修饰琼脂糖，其长度有10-20个C-O 链，提高了琼脂糖的醛基团的C链长度，也提高了琼脂糖偶联蛋白的空间结合能力(见图4-A)。对比例高碘酸产生的醛基琼脂糖，其基团在球介质表面，使得琼脂糖介质上绑定的蛋白或化学物质紧贴琼脂糖的表面，导致空间位阻遮蔽，降低了琼脂糖的空间结合能力(见图4-B)。
上述实验表明，本发明制备的琼脂糖介质在流速和耐压方面远高于常规醛基琼脂糖介质；且具有纯化效果好，纯化速度快的优点，适用于蛋白质纯化、抗体/抗原纯化和血液透析领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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