毡毛青霉dz-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用
阅读说明：本技术 毡毛青霉dz-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用 (Penicillium lanuginosum DZ-9-67 and application thereof in total flavone extraction of eucommia ulmoides leaves ) 是由 陈虹 张建芬 柯薇 陆胤 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种毡毛青霉DZ-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用,杜仲叶粉中加入无菌蔗糖水溶液,接种毡毛青霉DZ-9-67孢子,于28–30℃发酵2–3d,发酵物加入50％–70％乙醇水溶液中浸提后,再进行超声提取,抽滤,滤液浓缩后,获得浓缩物,真空干燥,获得杜仲叶总黄酮粗提物。本发明提供的杜仲叶总黄酮提取方法,较不采用发酵预处理的超声乙醇提取法相比,杜仲叶总黄酮的提取得率可以提高34.2％。(The invention discloses penicillium felterii DZ-9-67 and application thereof in total flavonoids extraction of eucommia leaves. Compared with an ultrasonic ethanol extraction method without fermentation pretreatment, the extraction yield of the total flavonoids in the eucommia ulmoides leaves provided by the invention can be improved by 34.2%.)
(一)
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株毡毛青霉DZ-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用。
(二)
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物。杜仲在我国栽培已有两千多年的历史。我国第一部药书汉代的《神农本草经》就记载了杜仲树皮的药效，并将杜仲列为上品。明代李时珍著作《本草纲目》中更为详细的记述了杜仲药名的由来和药效。2020年版中国药典一部药材和饮片中收录了杜仲(Eucommiae Cortex)和杜仲叶(Eucommiae Folium)。药典记载杜仲的功能与主治为：补肝肾，强筋骨，安胎。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安；杜仲叶的功能与主治为：补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。
杜仲叶含有多种生物活性成分，包括木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类等化合物，其中，黄酮类化合物含量较高，如钟淑娟的分析表明：杜仲皮、叶、雄花、籽的总黄酮平均含量分别为1.33％、9.02％、3.02％和1.22％[钟淑娟,杨欣,李静,等.杜仲不同部位总黄酮含量及抗氧化活性研究.中国药房,2017,28(13):1787-1790]。黄酮类化合物在抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防动脉粥样硬化及保护心脑血管、防癌、抗癌等方面效果良好，在辅助药物和保健食品领域都有广泛的应用。杜仲叶黄酮含量丰富，是提取黄酮的良好原料。
目前，国内有较多的关于杜仲叶总黄酮的提取方法报道，方法主要有水提法、有机溶剂提取法、超声波或微波辅助提取法、CO2超临界萃取法、酶辅助提取法和半仿生提取法等。不同的提取方法有各自的优缺点，总黄酮得率也差异较大。水提法成本低，但总黄酮得率较低；有机溶剂提取法的总黄酮得率有显著提高，但需要大量有机溶剂；超声或微波辅助提取法在有机溶剂提取法的基础上，增加超声波或微波处理，促进总黄酮溶出，提取得率有一定的提高；CO2超临界萃取法可以获得较高的提取得率和产品纯度，但设备要求比较高；酶辅助提取法的提取条件温和、活性物质不易失活，但商品化的纯酶成本较高；半仿生提取法工艺复杂，高温煎煮容易破坏黄酮的结构。几种方法相比之下，超声波辅助溶剂提取有一定的优势。
为了提高杜仲叶总黄酮的提取得率，本发明对杜仲叶总黄酮超声波辅助提取工艺进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，可以显著提高杜仲叶总黄酮的提取得率。
(三)
发明内容
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67，及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用，能够显著提高杜仲叶总黄酮的提取得率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株用于杜仲叶总黄酮提取的发酵预处理微生物菌株—毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述毡毛青霉DZ-9-67，是从杜仲叶的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述毡毛青霉DZ-9-67的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃培养3d，菌落初期为灰白色细短绒毛状，后逐渐变为绿色至橄榄绿色，中部隆起而其他部分平坦，菌丝较短，表面产生大量粉状分生孢子。气生菌丝顶端产生分生孢子梗，梗的顶端1–4个分枝，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成典型的帚状分生孢子穗；分生孢子呈球形或近似球形，直径2.5–3.0μm，绿色。毡毛青霉DZ-9-67在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
所述的毡毛青霉DZ-9-67的rDNA核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述毡毛青霉DZ-9-67在杜仲叶总黄酮提取中的应用，所述应用的方法为：杜仲叶粉中加入无菌蔗糖水溶液，接种毡毛青霉DZ-9-67孢子，于28–30℃发酵1.5–3d，发酵物加入乙醇水溶液中浸提后再进行超声提取，抽滤，滤液浓缩后，获得浓缩物，真空干燥，获得杜仲叶总黄酮粗提物。
进一步，所述的无菌蔗糖水溶液浓度为3–5g/L，经高压蒸汽121℃灭菌15min，无菌蔗糖水溶液体积用量以杜仲叶粉重量计为1.0–1.5mL/g，所述毡毛青霉DZ-9-67孢子接种量以杜仲叶粉重量计为5×107–7×107个/g；所述杜仲叶粉是将成熟的绿色杜仲叶烘干粉碎后过20目筛获得。
进一步，所述毡毛青霉DZ-9-67孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板培养基，于28–30℃恒温培养1.5–2d后，加入无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108–7×108个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，所述浓缩物的制备方法为：所述的发酵物加入体积浓度50％–70％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于60–70℃水浴中浸提2–4h，然后转入50℃的超声波清洗机中，200–300W超声提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，将滤液45℃减压浓缩至原体积的1/15–1/25，获得浓缩物；所述乙醇水溶液用量以发酵前杜仲叶粉重量计为15–25mL/g。
进一步，所述真空干燥条件为：50℃、0.1MPa条件下真空干燥至恒重。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在杜仲叶超声乙醇提取总黄酮前，增加了毡毛青霉DZ-9-67的发酵预处理。毡毛青霉DZ-9-67是从杜仲叶的微生物富集物培养物中筛选，并经诱变选育而获得的优良菌株，在杜仲叶粉中适度生长而产生多糖水解酶，水解杜仲叶纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得杜仲叶结构组织疏松，在超声乙醇提取时，黄酮化合物更容易溶出。本发明提供的杜仲叶总黄酮提取方法，较不采用发酵预处理的超声乙醇提取法相比，杜仲叶总黄酮的提取得率可以提高34.2％。
(四)
附图说明
图1毡毛青霉DZ-9-67的菌落形态照片。
图2分光光度法测定总黄酮的标准曲线(以芦丁为标准品)。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的杜仲叶为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥叶，中药材的拉丁学名为Eucommiae Folium，在夏秋二季枝叶茂盛时采收，晒干或低温烘干。杜仲叶粉是干燥的杜仲叶经粉碎后过20目筛的细粉。
实施例1：发酵菌株的分离和筛选
发酵杜仲叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选：
(1)250-mL三角瓶中加入约5g的杜仲叶粉，再加入5mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株14株，各菌株的编号见表1。
(2)14个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/mL，即为各菌株的孢子液。
(3)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10mL的浓度为3g/L无菌蔗糖水溶液，再接种1mL上述步骤(2)各菌株的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下发酵培养3d。
(4)步骤(3)经发酵的全部杜仲叶粉，加入150mL的体积浓度为50％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提2h，然后转入50℃的超声波清洗机中，200W超声提取30min。超声醇提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，HPLC法测定滤液中总黄酮含量。
同样条件下，以不接种霉菌孢子液作未经发酵的杜仲叶粉对照。杜仲叶粉经不同菌株发酵后，总黄酮的提取得率见表1。
表1不同菌株发酵杜仲叶后总黄酮的提取得率
由表1数据可以看出，杜仲叶粉经菌株DZ-9发酵后，较未经发酵的对照相比，总黄酮的提取得率提高的幅度最高，达到了16.6％，本发明选定该菌株作为提高杜仲叶总黄酮提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的杜仲叶总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：5.0mL杜仲叶总黄酮提取液(视样品中总黄酮浓度高低适当调整取样量，控制测定A510＝0.2–0.7之间，固体总黄酮粗提物用60％的乙醇水溶液溶解)，于25-mL比色管中，加入质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO2)水溶液1.0mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝[Al(NO3)3]水溶液1.5mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠(NaOH)水溶液4mL，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至25mL，摇匀，放置15min，于510nm处测定吸光度(A510)，由芦丁标准曲线计算得样品中总黄酮含量，再由含量乘以测定样品的体积得总黄酮质量。
芦丁标准曲线的绘制：用体积浓度60％乙醇水溶液配制浓度为0.2g/L的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL比色管中，用体积浓度60％的乙醇水溶液补充至5.0mL，加入质量浓度5％亚硝酸钠水溶液1.0mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝水溶液1.5mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠水溶液4mL，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至25-mL，摇匀，放置15min，在510nm处测定吸光度(A510)。以芦丁浓度为横坐标，A510为纵坐标绘制标准曲线(图2)。
所述的杜仲叶总黄酮提取得率按以下公式计算：
实施例2：发酵菌株DZ-9的诱变选育
对菌株DZ-9进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株DZ-9经PDA平板培养基28℃活化培养2d后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡20min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1×108个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取2.0mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养1.5d，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。经过2轮筛选，从85个菌株中筛选获得一株编号为DZ-9-67的菌株，对提高杜仲叶总黄酮提取得率的发酵性能最好。用该菌株发酵杜仲叶后，总黄酮的提取得率为9.72％，较出发菌株DZ-9的8.56％提高了13.6％，较未经发酵对照的7.34％提高了32.4％。DZ-9-67菌株经过转接传代5次，每代发酵杜仲叶后的总黄酮提取得率波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
实施例3：菌株DZ-9-67的分类鉴定
菌株DZ-9-67接种在PDA平板培养基上，28℃培养3d，菌落初期为灰白色细短绒毛状，后逐渐变为绿色至橄榄绿色，中部隆起而其他部分平坦，菌丝较短，表面产生大量粉状分生孢子。气生菌丝顶端产生分生孢子梗，梗的顶端1–4个分枝，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成典型的帚状分生孢子穗；分生孢子呈球形或近似球形，直径2.5–3.0μm，绿色。毡毛青霉DZ-9-67在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
将菌株DZ-9-67交由生工生物工程(上海)有限公司测得其核糖体ITS区rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与5株已知的毡毛青霉(Penicillium velutinum)有大于99％的同源性。根据菌株DZ-9-67菌落特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株DZ-9-67的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，青霉属(Penicillium)，毡毛青霉(Penicillium velutinum)。
ITS区rDNA序列为：
TCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCTCTGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCAATTAGCTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCTTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGACAACAATCAATCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT。
综上，从杜仲叶粉的微生物富集物中分离的菌株DZ-9，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株DZ-9-67，即毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取
毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养2d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10mL的浓度为3g/L无菌蔗糖水溶液，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度为5×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2d，得发酵物。
(3)步骤(2)全部发酵物，加入150mL的体积浓度50％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于60℃的水浴中浸提2h，然后转入50℃超声波清洗机中，200W超声提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10mL，获得总黄酮浓缩物。
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1MPa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物3.91g，总黄酮含量为24.6％，即得到杜仲叶总黄酮0.963g，提取得率为9.63％，产品为深棕色粉状物。
实施例5：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取
毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养1.5d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为6×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加12.5mL的浓度为4g/L无菌蔗糖水溶液，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度为6×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2.5d，得发酵物。
(3)步骤(2)全部发酵物转入500-mL的三角瓶中，加入200mL的体积浓度60％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于65℃的水浴中浸提3h，然后转入50℃超声波清洗机中，250W超声提取45min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10mL，获得总黄酮浓缩物。
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1MPa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物3.37g，总黄酮含量为29.3％，即得到杜仲叶总黄酮0.988g，提取得率为9.88％，产品为深棕色粉状物。
实施例6：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取
毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养1.5d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为7×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加15mL的浓度为5g/L无菌蔗糖水溶液，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度为7×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d，得发酵物。
(3)步骤(2)全部发酵物转入500-mL的三角瓶中，加入250mL的体积浓度70％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于70℃的水浴中浸提4h，然后转入50℃超声波清洗机中，300W超声提取60min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10mL，获得总黄酮浓缩物。
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1MPa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物2.86g，总黄酮含量为36.4％，即得到杜仲叶总黄酮1.04g，提取得率为10.4％，产品为深棕色粉状物。
如不经本实施例步骤(1)和步骤(2)的发酵过程，其他步骤按本实施例方法，10g的杜仲叶粉可提取获得杜仲叶总黄酮粗提物2.43g，总黄酮含量为31.9％，即得到杜仲叶总黄酮0.775g，提取得率为7.75％，产品为深棕色粉状物。可见，在杜仲叶总黄酮超声乙醇提取前，增加了毡毛青霉DZ-9-67的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，杜仲叶总黄酮的提取得率可以提高34.2％。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 毡毛青霉DZ-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 505
<212> DNA
<213> 毡毛青霉(Penicillium velutinum)
<400> 1
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