阅读说明：本技术 一种碳量子点荧光探针、试纸及其在桑色素检测中的应用 (Carbon quantum dot fluorescent probe, test paper and application of carbon quantum dot fluorescent probe and test paper in morin detection ) 是由 吴玉清 于旭 李洪伟 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：一种碳量子点荧光探针、试纸及其在桑色素检测中的应用,属于荧光探针技术领域。是用二次蒸馏水配制8～15mM的聚乙烯亚胺溶液；随后,取1mL、8～15mM的聚乙烯亚胺溶液与9mL二次蒸馏水混合,并将它们转移到水热反应釜中,150～180℃下反应8～15h；反应结束后,将反应产物冷却到室温,随后转移到离心管中,得到碳量子点荧光探针溶液。进一步,取一张双圈定性滤纸放在玻璃片上,取碳量子点荧光探针溶液浸润滤纸,随后自然晾干,即得到碳量子点荧光试纸。本发明具有响应时间快、操作简单、灵敏度较高、不需要任何检测仪器的特点,对桑色素的相关代谢研究以及在食品样品中检测桑色素具有重要意义。(A carbon quantum dot fluorescent probe, test paper and application thereof in morin detection belong to the technical field of fluorescent probes. Preparing 8-15 mM polyethyleneimine solution by using secondary distilled water; then, mixing 1mL of 8-15 mM polyethyleneimine solution with 9mL of secondary distilled water, transferring the mixture into a hydrothermal reaction kettle, and reacting for 8-15 h at 150-180 ℃; after the reaction is finished, cooling the reaction product to room temperature, and then transferring the reaction product to a centrifugal tube to obtain the carbon quantum dot fluorescent probe solution. And further, placing a piece of double-circle qualitative filter paper on a glass sheet, soaking the filter paper in the carbon quantum dot fluorescent probe solution, and naturally airing to obtain the carbon quantum dot fluorescent test paper. The method has the characteristics of quick response time, simple operation, higher sensitivity and no need of any detection instrument, and has important significance for relevant metabolism research of morin and morin detection in food samples.)

一种碳量子点荧光探针、试纸及其在桑色素检测中的应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种碳量子点荧光探针、试纸及其在桑色素检测中的应用。

背景技术

桑色素是一种天然多酚。它广泛存在于桑科植物的叶子、果实、茎和枝中，对多种人类疾病起到一定的治疗作用，包括糖尿病、癌症、细菌感染、高血压、低血糖等。此外，桑色素还可以在不干扰药物正常发挥作用的情况下，降低它们的副作用。它自身的毒性也较低，能够被应用于长期给药。因此，桑色素检测方法的构建有利于监测桑色素在食物中的含量以及在人体内的代谢情况，对桑色素在人体中的应用起到积极作用。目前已有的检测方法液相色谱法和气相色谱法，耗时长，检测灵敏度低。

碳量子点是一种新型荧光碳基零维材料。由于它具有高稳定性、良好的导电率、低毒性、环境友好性、合成方法简单等特性，吸引了研究者的广泛关注。它最重要的性质就是具有优良的荧光性能，且发光位置可调。因此，它可以被应用于生物医学、光电子学、催化和传感等领域中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碳量子点荧光探针、试纸及其在桑色素检测中的应用。

本发明利用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)合成碳量子点，其合成过程示意图如图1所示。由文献(Chem.Commun.,2012,48,10889-10891)报道可知，碳量子点具有一个石墨烯结构的核，图1中黑色核代表石墨烯结构核。它还存在一个高分子链朝向碳核的外侧，图1中灰色链状结构代表高分子链。这个高分子链是反应物(即聚合物)未碳化的部分。

本发明所述的碳量子点，其粒径分布为2.0～7.0nm，发光范围为400～600nm，是聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)在水热反应中被碳化后的产物。反应时间的增长和反应温度的升高，碳量子点的平均粒径会有所增大，外侧高分子链的长度会有所缩短。

在实际应用过程中，我们一般购买分子量为8000～12000的聚乙烯亚胺来制备碳量子点，制备的碳量子点要避光冷藏保存。

我们利用聚乙烯亚胺来合成碳量子点，具体过程参照Chem.Commun.,2012,48,10889-10891所述合成方法，略有修改(详见实施例1)。首先，用二次蒸馏水配制8～15mM的PEI溶液；随后，取1mL、8～15mM的PEI溶液与9mL二次蒸馏水混合，并将它们转移到水热反应釜中，150～180℃下反应8～15h；反应结束后，将反应产物冷却到室温，随后转移到离心管中，得到碳量子点荧光探针溶液，4℃下避光保存；其中碳量子点的粒径分布为2.0～7.0nm，发光范围为400～600nm。

我们利用合成出的碳量子点荧光探针溶液对桑色素进行检测。取制备的碳量子点荧光探针溶液，利用pH＝7.4的HEPES溶液与体积百分数1％的胎牛血清配作为缓冲溶液，配制0.1mg/mL浓度的碳量子点荧光探针溶液；再向该溶液中加入终浓度范围为0～25μM的桑色素，由于桑色素与碳点表面的基团可以发生相互作用，形成了在490nm和550nm的双荧光发射峰，在波长为550nm处的发射峰有所增强，在波长为490nm处的碳量子点的荧光发射峰有所淬灭；利用在550nm处荧光强度与在490nm处荧光强度的比值作为纵坐标(即比例型荧光探针)，以桑色素浓度为横坐标，绘制标准曲线，即可以实现对桑色素的检测(详见实施例3、4)。

取一张whatman公司生产的双圈定性滤纸(型号为：12.5CM(中速))放在一个玻璃片上，取5mL制备好的碳量子点荧光探针溶液浸润滤纸，随后自然晾干，即得到本发明所述的碳量子点试纸；向碳量子点试纸中滴加10μL、0～0.4μM浓度的桑色素溶液，就能在紫外灯下显示不同的颜色。在紫外灯下，利用荧光强度与颜色的对照就能够检测样品中桑色素的含量(详见实施例6、7)。

本发明利用了聚乙烯亚胺制备的碳量子点具有合成容易、稳定性强、对桑色素的响应灵敏度高等特点。碳量子点可以作为桑色素的一个比例型(即利用550nm处的荧光强度与490nm处荧光强度的比值作为纵坐标)荧光探针。并且我们基于碳量子点制备出了碳量子点试纸，同样能实现对桑色素的检测。这两种方法具有响应时间快、操作简单、灵敏度较高、不需要任何检测仪器的特点，对桑色素的相关代谢研究以及在食品样品中检测桑色素具有重要意义。

附图说明

图1：利用PEI制备碳量子点的制备过程示意图；

配制8～15mM的PEI溶液；随后，取1mL、8～15mM的PEI溶液与9mL二次蒸馏水混合，并将它们转移到水热反应釜中，150～180℃下反应8～15h，即可以得到碳量子点(CDs)溶液；

图2：PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)的荧光强度随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM)的变化曲线；

图3：PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)在550nm与490nm处的荧光强度的比值随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM)的变化曲线；

图4：PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)在550nm与490nm处的荧光强度的比值随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75μM)的线性变化；

图5：在1％(体积百分比)的胎牛血清中，PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)的荧光强度随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM)的变化曲线；

图6：在1％(体积百分比)的胎牛血清中，PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)在550nm与490nm处的荧光强度的比值随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM)的变化曲线；

图7：在1％(体积百分比)的胎牛血清中，在1％(体积百分比)的胎牛血清中，PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)在550nm与490nm处的荧光强度的比值随着桑色素浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4μM)的线性变化；；

图8：PEI制备的碳量子点荧光探针溶液(0.1mg/mL)与桑色素(10μM)、芹菜素(10μM)、茶多酚(10μM)、槲皮素(10μM)、杨梅素(10μM)作用后在550nm与490nm处的荧光强度的比值柱形图。

图9：在紫外灯照射下，制备的碳量子点试纸对不同浓度(2.0、4.0、6.0、8.0、10、30、50、75、100μM)的桑色素的响应照片。

具体实施方式

本发明使用的所有药品均可被购买。其中，分子量为10000的聚乙烯亚胺(PEI)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氢氧化钠(NaOH)、桑色素均购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，胎牛血清购买自澳大利亚Gibco公司，二次蒸馏水来自于Millipore超纯水系统，双圈定性滤纸(型号为：12.5CM(中速))购买自whatman公司。

实施例1

聚乙烯亚胺碳量子点的制备：首先，称取PEI 100mg，将它溶解到10mL二次蒸馏水中，配制成10mg/mL的PEI溶液；取配制的溶液10mL，将反应体系转移到聚四氟乙烯水热釜中，反应温度为160℃，反应时间为6小时；利用锡纸包裹离心管，以便控制内部环境为避光环境；反应完成后，将反应体系转移到带有锡纸的离心管中，放在4℃冰箱中保存，反应体系不需要进一步纯化。以PEI的浓度计量碳量子点荧光探针溶液的浓度。

实施例2

HEPES缓冲溶液的配制：称取HEPES 4.766g，加入1L蒸馏水，即配制成了20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液。

实施例3

在pH＝7.4的HEPES缓冲液中利用碳量子点荧光探针检测桑色素：取实施例1中制备的碳量子点荧光探针溶液10μL，加入990μL pH＝7.4的HEPES缓冲液，即配制成0.1mg/mL的碳量子点荧光探针溶液，向每1mL稀释后的碳量子点荧光探针溶液中，分别加入桑色素的母液，使体系中桑色素的终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM，此时，利用荧光光谱仪测试碳量子点荧光探针溶液对桑色素响应的荧光发射光谱(激发线为345nm)。如图2所示，随着桑色素的不断加入，在490nm处的发射峰不断减弱，在550nm处的发射峰不断增强。与此同时，如图3所示，我们绘制了在550nm处发射峰与在490nm处发射峰荧光强度的比值。如图4所示，随着桑色素的不断加入，在浓度在0～0.75μM，桑色素浓度与550nm与490nm处的荧光强度的比值呈现出良好的线性关系。因此，本发明制备的碳量子点体系可以用于对桑色素的检测，由公式L＝K*Sb/S，其中，K为测试的次数，L为方法的最低检出限、Sb为空白多次测量的标准偏差，S为标准曲线的斜率，得出检出限达到130nM。

实施例4

在体积百分数1％的胎牛血清中利用碳量子点荧光探针检测桑色素：取实施例1中制备的碳量子点荧光探针溶液10μL，加入10μL胎牛血清，加入980μL蒸馏水，即配制成0.1mg/mL的碳量子点荧光探针溶液，向每1mL稀释后的碳量子点荧光探针溶液中，分别加入桑色素的母液，使体系中桑色素的终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、25μM，此时，利用荧光光谱仪测试碳量子点荧光探针溶液对桑色素响应的荧光发射光谱(激发线为345nm)。如图5所示，随着桑色素的不断加入，在490nm处的发射峰不断减弱，在550nm处的发射峰不断增强。与此同时，如图6所示，绘制了在550nm处发射峰与在490nm处发射峰荧光强度的比值。如图7所示，我们绘制了在550nm处峰与490nm处峰荧光强度的比值，随着桑色素的不断加入，其与峰的比值呈现出良好的线性关系。因此，本发明制备的碳量子点体系可以用于在血液中对桑色素的检测，由公式L＝K*Sb/S，其中，K为测试的次数，L为方法的最低检出限、Sb为空白多次测量的标准偏差，S为标准曲线的斜率，得出检出限达到16nM。

实施例5

选择性测试：取实施例1中制备的碳量子点荧光探针溶液10μL，加入10μL胎牛血清，加入980μL蒸馏水，即配制成0.1mg/mL的碳量子点荧光探针溶液，向每1mL稀释后的碳量子点荧光探针溶液中，分别加入桑色素、芹菜素、茶多酚、槲皮素、杨梅素(浓度均为10μM)进行荧光光谱测试，记录它们在550nm处发射峰与在490nm处发射峰荧光强度的比值。如图8所示，碳量子点显示出了对桑色素的检测具有良好的选择性。

实施例6

制备碳量子点试纸：取一张双圈定性滤纸放在一个玻璃片上，取5mL制备好(方法见实施例1)的碳量子点荧光探针溶液浸润滤纸，随后自然晾干，即得到碳量子点试纸。

实施例7

利用碳量子点试纸检测桑色素：向实施例6得到的碳量子点试纸上滴加浓度分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、30、50、75、100μM的桑色素溶液(溶于DMSO)10μL。在紫外灯下，显示出逐渐变黄的荧光。再将实际样品取10μL滴加在试纸上，与刚才滴加在碳量子点试纸的点做对照，在样品桑色素含量为0-100μM的范围时，根据荧光强度与颜色可以确定样品中桑色素的含量范围(即在0-2.0、2.0-4.0、4.0-6.0、6.0-8.0、8.0-10、10-30、30-50、50–75或75-100μM之间)，实现了利用试纸检测桑色素。

还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。