具体实施方式

本研究采用多相分类方法确定百子莲根际细菌3T7的分类地位，对其产IAA、溶磷功能进行研究，并通过种子发芽试验及盆栽试验检测其促生功能。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1/100TSA固体培养基:胰蛋白胨0.15g，大豆胨0.05g，氯化钠0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1 000mL，调节pH 7.3±0.2，121℃灭菌20min。

YMA培养基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，琼脂15.0g，蒸馏水1 000mL，调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。

YMA液体培养基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，蒸馏水1 000mL，调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。

无机磷培养基：氯化钠0.3g，葡萄糖10g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，七水合硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，蒸馏水1 000mL，调节pH 7.0-7.2，121℃灭菌30min。

产IAA液体发酵培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.03g，七水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，L-色氨酸0.2g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH 7.2±0.2，121℃灭菌15min。

实施例1、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分离与鉴定

1、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分离

在上海市园林科学规划研究院邬桥基地(30°58'N，121°25'E)采集百子莲的根际土壤样品，带回实验室4℃保存。抖落附着于植物根上的土壤，仅保留紧密粘附在根表面的根际土，称取2g带有根际土的植物根至于无菌研钵研磨，充分研磨后转至装有玻璃珠和50ml无菌水的150ml锥形瓶中，室温150r/min振荡30min，取1mL稀释液用无菌水进行系列稀释，取100μL系列稀释液涂布于1/100TSA平板，30℃倒置培养1周，根据生理形态特点，用竹签将挑取单菌落，接在平板上纯化，确定为纯菌后，转入斜面4℃短期保存，转入25％甘油管，-80℃长期保存。将其中一株分离纯化的菌株命名为3T7。

2、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的鉴定

2.1菌株形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的菌株3T7进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态、菌落边缘状态。根据制造商的说明使用索莱宝公司革兰氏染色试剂盒对3T7进行涂片革兰氏染色，采用光学显微镜观察菌体的形态。

3T7在YMA平板上的菌落为白色，圆形，凸起，半透明和有粘液(图1)。细胞革兰氏染色阴性，呈杆状，无芽孢形成。

2.2分子鉴定

按说明书方法操作，用天根公司TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA基因扩增。25μL PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix12.5μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，ddH2O8.5μL，2μL DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段为1400bp左右，电泳验证后，将阳性结果PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序得到的序列上传到Ezbiocloud(www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行序列比对。

菌株3T7的16S rRNA基因的测序长度为1,403bp，与EzBioCloud数据库比对结果显示菌株3T7是Rhizobium属的成员，与Rhizobium altiplani HAMBI 3664^T(99.43％)，Rhizobium tibeticum CGMCC 1.7071^T(99.36％)、Rhizobium favelukesii LPU83^T(99.29％)和Rhizobium mesoamericanum HAMBI 3151^T(98.89％)的序列具有高度相似性，与Rhizobium属的其他物种的模式菌序列相似性＜98.7％。从EzBioCloud服务器检索了那些密切相关的16S rRNA基因序列，并使用clustal_W程序进行了比对。使用MEGA 7软件通过邻近法(Neighbour-Joining)构建系统发育树。使用Kimura two-parameter模型计算NJ法的进化距离，Bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图2所示。菌株3T7与Rhizobiummesoamericanum聚在同一个分支。

2.3基因组分析

基因组DNA送至安诺优达基因科技(北京)有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000测序系统对菌株3T7进行基因组草图测序。使用Unicycler v0.4.7软件进行组装，得到80个重叠群，覆盖率约为185×，N50长度为232080bp。基因组5.94Mb，G+C含量为59.9％,用ChunLab的直系同源平均核苷酸鉴定工具(OAT)v0.93.1软件进行菌株3T7与Rhizobium属相近菌株的全基因组平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，OrthoANI)分析。使用基因组到基因组距离计算器(GGDC)2.0服务器(http：//ggdc.dsmz.de/distcalc.php)比较计算菌株3T7与参考菌株之间的数字DNA-DNA杂交(dDDH)值。

如表1所示，与其他具有公开基因组序列的Rhizobium属物种的菌株相比，OrthoANI的值为78.6-88.5％，低于先前为物种划界提出的临界值95-96％，3T7及其模式菌株的dDDH值在22.5-37.5％之间，远低于70％的物种划分阈值。ANI和dDDH的结果都支持菌株3T7为Rhizobium属的一个新种。

表1.菌株3T7与其近缘菌株ANI及dDDH值

将3T7的全基因组序列提交至模式菌基因组服务器TYGS网站上比对，结果显示菌株3T7不属于TYGS数据库中发现的任何物种，为潜在的新物种。基于全基因组的分类学分析表明，3T7与Rhizobium tibeticum和Rhizobium favelukesii密切相关，并在系统发育树中与这两株模式菌聚集在一起，如图3所示。

2.4生理学和化学分类鉴定

使用法国梅里埃公司API 20NE和API ZYM试剂盒(bioMérieux)确定菌株3T7和相关模式菌株的生理生化特性。美国BIOLOG公司的GEN III MicroPlates用于确定碳源的氧化和对抑制性化合物的敏感性。

20NE试验结果显示菌株3T7的硝酸盐还原反应呈阳性，能产生吲哚，能水解七叶灵和脲素，不能水解明胶。葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖及葡萄糖酸盐同化反应阳性，苹果酸同化反应弱阳性，半乳糖苷酶阳性，葡萄糖酸化阴性，精氨酸双水解酶阴性，癸酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸同化反应阴性。ZYM酶活鉴定试验中，白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶和β-葡萄糖甙酶阳性。BIOLOG结果显示3T7可以利用L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、D-葡糖-6-磷酸D-果糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、奎宁酸、L-乳酸、D-苹果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸、果胶、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯、甲酸、龙胆二糖、蜜三糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-果糖、L-果糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、L-天冬氨酸、D-半乳糖醛酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、L-苹果酸、乙酸、D-麦芽糖、D-纤维二糖和蔗糖作为碳源，可以在四唑蓝、萘啶酮酸、亚碲酸钾和氨曲南存在条件下生长。菌株3T7与相关模式菌种的差异特征见表2。

菌株3T7与模式菌株西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)CGMCC 1.7071(＝LMG24453)在如下32项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，而模式菌株CGMCC 1.7071^T不能；2)菌株3T7胞外酶谱中不含β-半乳糖甙酶和α-葡萄糖甙酶，而CGMCC 1.7071^T胞外酶谱中含这两种酶；3)菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、奎宁酸、L-乳酸、D-苹果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸、果胶、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯和甲酸等18种物质作为碳源，而模式菌株CGMCC 1.7071^T不能利用这些物质，菌株3T7不能利用D-松二糖、水苏糖、N-乙酰神经氨酸、肌苷和D-葡糖酸作为碳源，而CGMCC 1.7071^T可以利用这5种物质作为碳源；4)在溴酸钠、1％乳酸钠、醋竹桃霉素、利福霉素SV和洁霉素存在条件下3T7可以生长，而CGMCC 1.7071^T不能生长。

菌株3T7与模式菌株Rhizobium mesoamericanum HAMBI 3151^T在如下19项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，不能同化柠檬酸，精氨酸双水解酶阴性，HAMBI 3151^T不能同化N-乙酰-葡萄糖胺和葡萄糖酸盐，能同化柠檬酸，精氨酸双水解酶阳性；2)菌株3T7胞外酶谱中不含碱性磷酸盐酶和α-葡萄糖甙酶，而HAMBI 3151^T胞外酶谱中含这两种酶；3)菌株3T7不能以柠檬酸和D-松二糖作为碳源，HAMBI 3151^T可以利用柠檬酸和D-松二糖，菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸、L-组胺、粘液酸、丙酮酸甲酯、甲酸和龙胆二糖作为碳源，HAMBI 3151^T不能利用；4)在氯化锂和1％乳酸钠存在条件下3T7可以生长，而HAMBI 3151^T不能生长，丁酸钠能抑制3T7生长，而不能抑制HAMBI 3151^T生长。

菌株3T7与模式菌株Rhizobium altiplani HAMBI 3664^T在如下17项生理生化特征方面存在明显差别：1)菌株3T7能水解脲素，HAMBI 3664^T不能；

2)菌株3T7的N-乙酰-葡萄糖胺同化反应为阳性，模式菌株HAMBI3664^T的N-乙酰-葡萄糖胺同化反应为阴性；

3)菌株3T7胞外酶谱中不含酯酶(C4)和胰蛋白酶，而HAMBI 3664^T胞外酶谱中含这两种酶；

4)菌株3T7不能以L-半乳糖醛酸内酯、丙酸、柠檬酸、D-松二糖、水苏糖和N-乙酰神经氨酸作为碳源，模式菌株HAMBI 3664^T可以，菌株3T7能以L-丙氨酸、L-丝氨酸、糖质酸和D-葡糖-6-磷酸作为碳源，HAMBI 3664^T不能利用；

5)在氯化锂和溴酸钠存在条件下3T7可以生长，而HAMBI 3664^T不能生长，万古霉素能抑制3T7生长，而不能抑制HAMBI 3664^T生长。

表2.菌株3T7与相关模式菌种的差异特征

注：+，阳性或可利用；-，阴性或不可利用；w，弱阳性。

使用Sherlock微生物鉴定系统(MIDI)测定从菌株3T7及3个近缘菌的细胞。MIDI分析结果见表2，菌株3T7的主要脂肪酸(＞5％)是第8特征类型(C_18：1ω6c和/或C_18：1ω7c)、第2特征类型(C_12：0醛和/或等效碳链长度为10.9525的未知脂肪酸)、C_16：0、C_18：0和C_19：0cycloω8c。结果支持菌株3T7为根瘤菌属。表3中显示了四种菌株之间脂肪酸谱的细微差异。

表3.菌株3T7以及其类型菌株的细胞脂肪酸组成

注：所示数值为总脂肪酸的百分比。-：没有检测到，特征类型是由MIDI系统无法通过GLC分离的两种或三种脂肪酸组成的混合物，第2特征类型包括C_14：0 3OH和/或C_16：1 isoI，第3特征类型包括C_16：1ω6c和/或C_16：1ω7c，第8特征类型包括C_18：1ω6c和/或C_18：1ω7c。

根据同源性比对，系统发育树的构建，结合形态学、生理生化鉴定、脂肪酸成分及基因组分析结果，可以确定菌株3T7为Rhizobium属的新种，建议的分类命名为Rhizobiumrhizagapanthus，中文名称为百子莲根际根瘤菌。百子莲根际根瘤菌(Rhizobiumrhizagapanthus)3T7已于2020年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.21507。以下简称为百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7。

实施例2、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的溶磷能力的检测

将取10μL百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7菌液接种于无机磷培养基上，30℃培养4d，观察有无溶磷圈产生，测量溶磷圈直径(d₂)和菌落直径(d₁)，计算溶磷圈与菌落直径比(d₂/d₁)。比值越大，表示溶磷能力越强。结果表明在无机磷培养基上生长4d后，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.06(图4)。表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7可以溶解无机磷。

实施例3、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的分泌生长素的定性检测和定量分析

1、定性检测

将百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7活化后接种于产IAA液体发酵培养基中，35℃、180r/min震荡培养2d，12 000rpm离心10min后取100μL百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的上清液滴在在白瓷板上，加入等体积Salkowski比色液进行显色反应(百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7处理)。分别以100μL IAA水溶液(100mg/L)和不加菌的产IAA液体发酵培养基作为阳性对照和阴性对照。白瓷板于室温下，避光条件下放置30min后观察，若出现粉红色则为阳性，说明该菌株能够分泌IAA。实验设三次重复。

定性检测结果显示，在百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的上清液中滴加Salkowski比色液后，菌液颜色变粉红色(图5)，表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能够分泌植物生长激素(IAA)。

2、定量分析

标准曲线的制作：取适量IAA加少量乙醇溶解后，用蒸馏水稀释，配置浓度为0、25、50、100、200、250mg/L的IAA标准溶液，并按体积比1∶1与Salkowski比色液混合，室温避光放置30min，然后分别测定各浓度的OD_530nm(以蒸馏水与Salkowski比色液的1∶1混合溶液为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD_530nm为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。

菌液中IAA浓度的测定：百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7活化后在产IAA液体发酵培养基中35℃、180r/min震荡培养48h后测定发酵液的OD_600nm值，12000rpm离心10min，取上清液与等体积的Salkowski比色液混合。室温下避光放置30min，测定其OD_530nm值(以未接菌的产IAA液体发酵培养基与等体积Salkowski比色液的混合溶液为对照)。通过IAA浓度与OD_530nm的标准关系曲线计算相应的IAA浓度。并根据OD₆₀₀值，按照公式计算单位IAA产量:

单位IAA产量(mg/L)＝发酵液中IAA含量/发酵液OD_600nm值。

经检测IAA含量标准曲线回归方程为:y＝0.013x+0.0672，相关系数R2＝0.9934，培养72h后百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7的OD_600nm值为0.52，其上清液与Salkowski比色液混合OD_530nm为0.33，百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7发酵液的单位IAA含量为38.88mg/L。

实施例4、百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7促进植物生长

1、促进万寿菊种子萌发

挑取百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7单菌落接种于装有100mL YMA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD_600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。挑选粒大饱满的万寿菊种子置于底部铺置滤纸的9cm平板中，每个平板放10粒种子，加10ml菌悬液，阴性对照加10ml无菌水，每个处理3个平板。将其置于30℃恒温培养箱。跟踪观察万寿菊发芽情况，记录发芽数，分析试验菌对万寿菊种子发芽的促进效果。

发芽率％＝(指定天数的发芽种子数/供试种子数)×100％。

培养7d后，阴性对照种子发芽率为20％，试验组种子发芽率为45％，表明百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7能显著提高万寿菊种子发芽率。

2、促进水稻及万寿菊幼苗生长

挑取百子莲根际根瘤菌(Rhizobium rhizagapanthus)3T7单菌落接种于装有100mL YMA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD_600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。挑选长势相近的水稻及万寿菊幼苗，移栽于花盆中，每盆4-5株。设置试验组及对照组CK各4盆(分别称为试验组1-4和对照组1-4)。进行菌悬液灌根处理，每周每盆浇灌菌悬液(试验组)或无菌水(对照组)25mL。植物生长期间每2-3d浇水一次。实验在智能温室中进行。日夜温度分别为25℃/20℃，日照时间为14h。

在移栽1个月后测定地上部鲜重和干重、植株高度(植株茎基部至叶片顶端高度)、根长、根重等。最终实验数据为每盆植株的平均值。

水稻幼苗盆栽结果如表4和图6所示，实验组茎鲜重、根长、根和茎干重与对照组相比分别增长了80.0％、17.8％、33.3％和53.2％,显著优于对照组，试验结果表明3T7对水稻幼苗具有明显促生作用。

表4.水稻幼苗盆栽实验测定结果

注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。

万寿菊幼苗盆栽结果如表5和图7所示，试验组在根及茎鲜重与对照组相比，分别提高了94.7％和34.2％。试验结果表明3T7对万寿菊幼苗具有明显促生作用。

表5.万寿菊幼苗盆栽实验测定结果

注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；上海市园林科学规划研究院

<120> 具有溶磷功能并促进园林植物生长的根瘤菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 百子莲根际根瘤菌（Rhizobium rhizagapanthus）

<400> 1

aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc gccccgcaag gggagcggca 60

gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtaccc tttactacgg aataacccag ggaaacttgg 120

actaataccg tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg taaaggatcg gcccgcgttg 180

gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccatagct ggtctgagag 240

gatgatcagc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg 300

gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggccct 360

agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt aaccggagaa gaagccccgg 420

ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggatttactg 480

ggcgtaaagc gcacgtaggc ggatcgatca gtcaggggtg aaatcccaga gctcaactct 540

ggaactgcct ttgatactgt cgatctggag tatggaagag gtgagtggaa ttccgagtgt 600

agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggtcca 660

ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 720

acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgtcgg gcagtatact gttcggtggc gcagctaacg 780

cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg 840

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag 900

cccttgacat gcccggccag ctacagagat gtagtgttcc cttcggggac cgggacacag 960

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020

gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggggac tgccggtgat 1080

aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ctgggctaca 1140

cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagaccgc gaggtcgagc taatctccaa 1200

aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg aatcgctagt 1260

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320

caccatggga gttggtttta cccgaaggta gtgtgctaac cgcaaggagg cagctaacca 1380

cggtagggtc agcgactggg gtg 1403