水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1;2的应用

文档序号：163991 发布日期：2021-10-29 浏览：34次 >En<

阅读说明：本技术 水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1;2的应用 (Application of rice molybdate transporter coding gene OsMOT1 and 2 ) 是由黄新元胡大维赵方杰于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的应用。一种钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2,序列如SEQ ID NO.1所示。该基因可在提高水稻地上部钼含量和钼由根系向地上部转运,提高水稻中钼由衰老组织向新生组织转移以及提高水稻籽粒钼含量等方面应用。本发明通过大量实验发现了水稻中的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的生物学功能,该基因超表达后,水稻植株地上部钼含量显著上升,同时钼由根系向地上部转运比率显著提高；超表达植株中钼由衰老组织向新生组织转移增强；在水稻成熟阶段,超表达植株中籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节间钼含量以及节钼含量显著提高。(The invention discloses a rice molybdate transporter coding gene OsMOT1; 2. A molybdate transporter encoding gene OsMOT1;2, the sequence is shown as SEQ ID NO. 1. The gene can be applied to the aspects of improving the molybdenum content of the overground part of the rice, transferring the molybdenum from the root system to the overground part, improving the molybdenum transfer in the rice from an aged tissue to a newborn tissue, improving the molybdenum content of rice grains and the like. According to the invention, a large number of experiments find that the molybdate transporter coding gene OsMOT1 in rice; 2, after the gene is over-expressed, the molybdenum content in the overground part of a rice plant is obviously increased, and meanwhile, the transport ratio of molybdenum from a root system to the overground part is obviously increased; the molybdenum in the over-expression plant is transferred and enhanced from the aged tissue to the newborn tissue; in the rice maturation stage, the molybdenum content of grains, the molybdenum content of glumes, the molybdenum content of branches, the molybdenum content of internodes and the molybdenum content of internodes in over-expression plants are obviously improved.)

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的应用。

背景技术

钼(Mo)是几乎所有生物生长发育必需的营养元素之一，它参与了生命体内许多重要的生理生化代谢过程。植物缺钼时会导致叶片失绿、蜷曲，出现枯斑，坐果率下降以及种子发育不良 (Tejada-Jiménez等，2013)，而人体缺钼时则会造成幼儿严重的神经系统疾病，大脑和头部发育异常，甚至死亡(Schwarz，2005；Mendel&Kruse，2012)。因此加强人体日常钼摄入对维持人体健康十分必要。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有一半的人口以水稻为主食，研究水稻对钼的吸收和转运机制，培育钼高积累的优良水稻品种，从膳食角度补充钼营养是一种经济有效的解决办法。

目前有关调控水稻中钼转运的基因报道较少，人们仅对水稻根系从土壤中吸收钼的过程有初步了解，钼在水稻植株内的广泛运输、合理分配和高效利用等过程尚不明确。特别是，当钼由外界环境被吸收进入水稻体内后，如何促进其由根系向地上部继续运输，尤其是向贮藏器官——籽粒中运输？如何在面对钼缺乏环境时促进钼营养在各组织器官间分配，特别是由水稻衰老组织向新生组织转移？这些问题的存在限制了人们通过基因工程手段提高水稻籽粒钼含量，因而继续挖掘水稻中调控钼转运的基因具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供水稻钼酸盐转运蛋白编码基因 OsMOT1；2的应用。OsMOT1；2在GenBank中的登录号为XM_015766127。

本发明的第一个目的是提供超表达水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在提高钼由水稻根系向地上部的转运比率，和/或促进钼由水稻衰老组织向新生组织转移，和/或提高水稻组织器官中钼含量中的应用，所述水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述水稻组织器官为籽粒、颖壳、枝梗、节、节间中的一种或多种。

进一步的，所述水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种提高钼由水稻根系向地上部的转运比率，和/或促进钼由水稻衰老组织向新生组织转移，和/或提高水稻组织器官中钼含量的超表达载体，所述超表达载体为含有前述水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的重组表达载体。

进一步的，所述超表达载体为以pUN1301-eGFP载体为基础载体，将SEQ ID NO.2所示钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的CDS序列插入基础载体的BamHI-SacI酶切位点之间所得。

本发明的第三个目的是提供前述的超表达载体在提高钼由水稻根系向地上部的转运比率，和/或促进钼由水稻衰老组织向新生组织转移，和/或提高水稻组织器官中钼含量中的应用。

进一步的，所述水稻组织器官为籽粒、颖壳、枝梗、节、节间中的一种或多种。

进一步的，所述应用为将前述的超表达载体导入水稻得到超表达钼酸盐转运蛋白编码基因 OsMOT1；2的水稻，从而提高钼由水稻根系向地上部的转运比率，和/或促进钼由水稻衰老组织向新生组织转移，和/或提高水稻组织器官中钼含量。

本发明的有益效果

1、本发明通过系统研究，首次提供了一种钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在钼元素转运方面的生物学功能。

2、该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在酵母中异源表达后显著提高了酵母钼含量，表明该基因具有钼酸盐转运活性。

3、该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，提高了幼苗期水稻地上部钼含量，提高了钼由根系向地上部的转运比率，提高了水稻各个叶片钼含量，同时对水稻根系钼含量无明显影响。

4、该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，在钼缺乏环境中，超表达株系中钼由衰老组织向新生组织的转移比野生型显著上升，同时新生组织中的钼含量比野生型显著提高。

5、该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，提高了成熟期水稻籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节钼含量、节间钼含量。

6、构建了钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的超表达材料。

通过本发明提供的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的应用，能够有效促进钼酸盐由根系向地上部继续运输，特别是在水稻成熟期，促进钼酸盐由根系向贮藏器官——籽粒中运输，能够促进钼营养在各组织器官间分配，特别是在面对钼缺乏环境时，由水稻衰老组织向新生组织转移。

附图说明

图1为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在酵母中异源表达后，酵母细胞内钼酸盐含量显著上升。EV表示转入载体pDR196的酵母菌株，OsMOT1；2表示转入重组载体pDR196-OsMOT1；2的酵母菌株。

图2为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后显著降低了幼苗期水稻地上部钼含量，提高了根系钼含量，降低了钼由根系向地上部的转运比率以及水稻各个叶片的钼含量。

A：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗地上部钼含量，突变体的地上部钼含量比野生型显著下降；

B：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗根系钼含量，突变体的根系钼含量比野生型显著上升；

C：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗钼由根系向地上部的转运比率，突变体的转运比率比野生型显著下降；

D：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗各个叶片钼含量，突变体的各个叶片钼含量比野生型显著下降。

图3为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，提高了水稻地上部钼含量，提高了钼由根系向地上部的转运比率，提高了水稻各个叶片钼含量，同时对水稻根系钼含量无明显影响。

A：野生型WT以及OsMOT1；2超表达株系中OsMOT1；2的相对表达量；

B：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗地上部钼含量，OsMOT1；2超表达株系的地上部钼含量比野生型显著上升；

C：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗根系钼含量，OsMOT1；2超表达株系根系钼含量与野生型无明显差异；

D：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗钼由根系向地上部的转运比率， OsMOT1；2超表达株系的转运比率比野生型显著上升；

E：含有10nM钼酸盐的营养液中，生长到四叶期的水稻幼苗各个叶片钼含量，OsMOT1；2超表达株系的各个叶片钼含量比野生型显著上升。

图4为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后，在钼缺乏环境中，突变体中钼由衰老组织向新生组织的转移比野生型显著下降，同时突变体新生组织中的钼含量比野生型显著降低。

A：水稻幼苗在含有10nM钼酸盐的营养液中生长到四叶期，然后将营养液中的钼营养去除，继续培养至六叶期，比较四叶期与六叶期水稻相同叶片的钼含量，OsMOT1；2突变体中各个叶片的钼转移率均低于野生型；

B：水稻幼苗在含有10nM钼酸盐的营养液中生长到四叶期，然后将营养液中的钼营养去除，继续培养至六叶期，OsMOT1；2突变体中新生组织第六叶钼含量显著低于野生型。

图5为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，在钼缺乏环境中，超表达株系钼由衰老组织向新生组织的转移比野生型显著上升，同时新生组织中的钼含量比野生型显著提高。

A：水稻幼苗在含有10nM钼酸盐的营养液中生长到四叶期，然后将营养液中的钼营养去除，继续培养至六叶期，比较四叶期与六叶期水稻相同叶片的钼含量，OsMOT1；2超表达株系中各个叶片的钼转移率均高于野生型；

B：水稻幼苗在含有10nM钼酸盐的营养液中生长到四叶期，然后将营养液中的钼营养去除，继续培养至六叶期，OsMOT1；2超表达株系中新生组织第五叶、第六叶钼含量显著高于野生型。

图6为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后，降低了水稻籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节钼含量、节间钼含量、叶片钼含量以及叶鞘钼含量。

A：在盆栽条件下，OsMOT1；2突变体籽粒钼含量和颖壳钼含量显著低于野生型；

B：在盆栽条件下，OsMOT1；2突变体枝梗钼含量、节钼含量、节间钼含量、叶片钼含量以及叶鞘钼含量均显著低于野生型。

图7为该钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，提高了水稻籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节钼含量以及节间钼含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在酵母中的异源表达，具体实施过程如下：

1)以水稻品种中花11(ZH11)的cDNA文库为模板，利用PCR方法扩增OsMOT1；2的全长编码区序列(CDS序列)，OsMOT1；2的全长CDS序列如SEQ ID NO.2所示，然后将扩增的OsMOT1；2的全长CDS序列连接至pDR196载体的EcoRI-XhoI酶切位点之间，构建由组成型启动子PMA驱动的重组载体pDR196-OsMOT1；2。

扩增引物分别为：

OsMOT1；2-F:5'-CGGGCTGCAGGAATTCATGGCATCCTCCGCCGGCGAC-3′(SEQ ID NO.3)；

OsMOT1；2-R:5'-CGGGCCCCCCCTCGAGTCAAGCATCTCCAGCCCCAT-3′(SEQ ID NO.4)。

2)将重组载体以及空载体分别转化至酿酒酵母31019b(MATa ura3 mep1Δmep2Δ::LEU2 mep3Δ::KanMX2)中。挑选单克隆至2ml不含钼的SD/-U液体培养基中，并在30℃，200rpm 条件下孵育过夜,然后将1ml菌液转接至50ml不含钼的SD/-U液体培养基中，并在30℃， 200rpm条件下培养至对数生长阶段。此时，向菌液中加入钼酸钠使菌液中钼浓度为0.5uM，继续培养菌液半小时，然后用离心机在4℃下，4000rpm离心收集酵母细胞，并用预冷的 EDTANa₂溶液清洗三遍，最后用预冷的超纯水清洗一遍。

3)烘干菌块，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定4组样品的钼含量。

结果显示，钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2在酵母中异源表达后，酵母细胞内钼酸盐含量显著上升。本实施例表明钼酸盐转运蛋白OsMOT1；2具有钼酸盐转运活性(图1)。

实施例2

水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变体的制备，具体实施过程如下：

1)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2进行敲除。选定OsMOT1；2CDS区的序列CCGTCAAGTACATCCGCTAC(SEQ ID NO.5)和序列CGCTACTGTTCATAATCCTC(SEQ ID NO.6)作为编辑靶点T1和T2，设计构建敲除载体的引物。

引物序列如下：

gRT1:5’-TAGCGGATGTACTTGACGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ ID NO.7)；

OsU6aT1:5’-CCGTCAAGTACATCCGCTACGGCAGCCAAGCCAGCA-3’(SEQ ID NO.8)；

gRT2:5’-AGGATTATGAACAGTAGCGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ ID NO.9)；

OsU6bT2:5’-CGCTACTGTTCATAATCCTCAACACAAGCGGCAGC-3’(SEQ ID NO.10)。

2)以质粒pYLsgRNA-OsU6a和质粒pYLsgRNA-OsU6b作为模板，用PCR的方法扩增出含有T1和T2的sgRNA表达盒片段。

扩增体系为：10μl Mix buffer；2μl质粒；引物各1μl；6μl ddH₂O；

扩增程序为：(1)95℃，3min；(2)95℃，15s；(3)58℃，15s；(4)72℃，20s；(5)72℃，5min；(6)12℃，2min；步骤(2)-(4)重复35个循环。

3)以2)中sgRNA表达盒片段为模板，继续扩增出完整的sgRNA表达盒OsU6a-T1-sgRNA 和OsU6a-T2-sgRNA。

扩增体系为：10μl Mix buffer；2μl表达盒片段；引物各1μl；6μl ddH₂O；

扩增程序为：(1)95℃，3min；(2)95℃，15s；(3)58℃，15s；(4)72℃，20s；(5)72℃，5min；(6)12℃，2min；步骤(2)-(4)重复35个循环。

4)将sgRNA表达盒OsU6a-T1-sgRNA和OsU6a-T2-sgRNA组装到pYLCRISPR/Cas9敲除载体。

5)将验证正确的pYLCRISPR/Cas9质粒转化至水稻中。具体的转基因过程为：(1)将pYLCRISPR/Cas9质粒转化至农杆菌(GV3101)中；(2)以水稻品种ZH11种子为材料，去壳，消毒后置于诱导培养基上诱导愈伤组织；(3)用农杆菌菌液侵染愈伤组织，用无菌水清洗后置于选择培养基上以筛选出抗性愈伤组织；(4)将抗性愈伤组织先后转移至分化培养基和生根培养基中，经诱导分化和生根后得到转基因T0代植株。

6)在大田中种植T0代植株，鉴定钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2编码区是否发生突变，选择纯合突变的单株，收获T1代种子。

鉴定引物为：

CRISPROs1；2-F:5'-CCCCATGCCCGTCCAGCCCAT-3′(SEQ ID NO.11)；

CRISPROs1；2-R:5'-CGGCGCCCTCCCAGAACCCGATCT-3′(SEQ ID NO.12)；

经检测，本实施例中获得三个钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2编辑形式不同的敲除突变体osmot1；2-1、osmot1；2-2和osmot1；2-3。

实施例3

实施例2制备的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变体osmot1；2-1、osmot1；2-2和 osmot1；2-3的水培实验，具体实施过程如下：

1)将野生型WT与OsMOT1；2突变体的种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，一周后将幼苗转移至含有10nM钼酸盐的1/2Kimura B营养液中继续培养至水稻的四叶期阶段，期间每三天更换一次营养液。

2)用自来水冲洗野生型以及突变体osmot1；2-1、osmot1；2-2、osmot1；2-3植株，除去附着在根系和茎基部表面的营养液，然后用超纯水清洗三遍，分不同叶片和根系取样。

3)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

本实施例表明钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后，水稻地上部钼含量、各个叶片钼含量以及钼由根系向地上部的转运比率均显著下降，而根系钼含量显著上升，即降低了钼由根系向地上部的转运比率以及水稻各个叶片的钼含量(图2)。

实施例4

水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达载体的构建，具体实施过程如下：

1)以ZH11 cDNA文库为模板，采用SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示pUN1；2-1引物扩增OsMOT1；2的全长CDS序列(如SEQ ID NO.2所示)，另以pUN1301-eGFP质粒为模板，采用SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示pUN1；2-2引物扩增eGFP序列。

扩增引物为：

pUN1；2-1F：5'-CGACTCTAGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′(SEQ ID NO.13)；

pUN1；2-1R：5'-GATGCCATCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(SEQ ID NO.14)；

pUN1；2-2F：5'-GTACAAGATGGCATCCTCCGCCG-3′(SEQ ID NO.15)；

pUN1；2-2R：5'-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAGCATCTCCAGCCCCATC-3′(SEQ IDNO.16)；

扩增体系为：10μl Mix buffer；2μl cDNA或质粒；引物各1μl；6μl ddH₂O；

扩增程序为：(1)95℃，3min；(2)95℃，15s；(3)55℃，15s；(4)72℃，90s；(5)72℃，5min；(6)12℃，2min；步骤(2)-(4)重复35个循环。

2)对pUN1301-eGFP质粒进行酶切，获得线性化质粒。

酶切位点为：BamHI-SacI；

酶切体系为：1μg质粒；酶各1μl；5μl 10X buffer；补充ddH₂O至总体系为50μl；

酶切程序为：(1)37℃，4h；(2)4℃，2min。

3)用同源重组方法将扩增序列连接至pUN1301-eGFP载体的BamHI-SacI酶切位点之间，构建由组成型启动子Ubiquitin驱动的重组载体pUN1301-eGFP-OsMOT1；2。

重组体系为：线性化载体4μl；片段各2μl；4μl 5X buffer；2μl酶；6μl ddH₂O；

重组程序为：(1)37℃，30min；(2)4℃，30s；

经检测，本实施例中获得超表达水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2重组载体pUN1301-eGFP-OsMOT1；2。

实施例5

钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达材料的构建，具体实施过程如下：

1)将实施例4制备的重组载体pUN1301-eGFP-OsMOT1；2转化至水稻中，转基因过程同实施例2。在大田中种植T0代植株收获T1代种子。

2)T1代种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，一周后将幼苗转移至1/2Kimura B营养液中继续培养，用GUS染色法对T1代植株进行阳性鉴定。

3)取阳性单株和野生型WT植株叶片，提取RNA，反转录后获得cDNA。

4)利用荧光定量PCR检测野生型和阳性单株中钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2的表达量，以水稻看家基因Actin作为内参，计算OsMOT1；2的相对表达量。

OsMOT1；2的定量引物为：

qOsMOT1；2-F:5'-CTCATGAATTTCGTGGGGTG-3′(SEQ ID NO.17)

qOsMOT1；2-R:5'-AGCATGACGCCCAGTATC-3′(SEQ ID NO.18)

Actin的定量引物为：

Act-rts:5'-TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3′(SEQ ID NO.19)

Act-rta:5'-AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3′(SEQ ID NO.20)。

经检测，本实施例中获得两个钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2相对表达量不同的 OsMOT1；2超表达株系OE-1和OE-2(图3A)。

实施例6

实施例5制备的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达株系OE-1和OE-2的水培实验，具体实施过程如下：

1)将野生型WT与OsMOT1；2超表达株系的种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，一周后将幼苗转移至含有10nM钼酸盐的1/2Kimura B营养液中继续培养至水稻的四叶期阶段，期间每三天更换一次营养液。

2)用自来水冲洗野生型以及突变体OE-1和OE-2植株，除去附着在根系和茎基部表面的营养液，然后用超纯水清洗三遍，分不同叶片和根系取样。

3)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

结果显示：本实施例表明OE-1和OE-2中钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，水稻地上部钼含量、各个叶片钼含量以及钼由根系向地上部的转运比率均显著上升，而根系钼含量无明显变化(图3B～E)。

实施例7

钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变体的缺钼条件下水培实验，具体实施过程如下：

1)制备OsMOT1；2突变体的种子的操作同实施例2。将野生型WT与OsMOT1；2突变体的种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，一周后将幼苗转移至含有10nM钼酸盐的1/2Kimura B营养液中继续培养至水稻的四叶期阶段，期间每三天更换一次营养液。

2)将野生型与OsMOT1；2突变体的植株移出，用不含有钼的1/2Kimura B营养液以形成钼缺乏环境，继续培养直至水稻的六叶期阶段，期间每三天更换一次营养液。

3)用自来水冲洗野生型以及突变体植株osmot1；2-1、osmot1；2-2、osmot1；2-3，除去附着在根系和茎基部表面的营养液，然后用超纯水清洗三遍，分别取衰老和新生的叶片以及根系作为样品。

4)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

本实施例表明钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后，在钼缺乏环境中，突变体中钼由衰老组织向新生组织的转移率比野生型显著下降，同时突变体新生组织中的钼含量比野生型显著降低(图4)。

实施例8

实施例4制备的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达株系OE-1和OE-2的缺钼条件下水培实验，具体实施过程如下：

2)将野生型与OsMOT1；2超表达株系的植株移出，用不含有钼的1/2Kimura B营养液以形成钼缺乏环境，继续培养直至水稻的六叶期阶段，期间每三天更换一次营养液。

3)用自来水冲洗野生型以及超表达株系植株OE-1和OE-2，除去附着在根系和茎基部表面的营养液，然后用超纯水清洗三遍，分别取衰老和新生的叶片以及根系作为样品。

4)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

本实施例表明钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，在钼缺乏环境中，超表达株系中钼由衰老组织向新生组织的转移率比野生型显著提高，同时超表达株系新生组织中的钼含量比野生型显著提高(图5)。

实施例9

盆栽条件下钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变体的钼含量测定，具体实施过程如下：

1)制备OsMOT1；2突变体的种子的操作同实施例2。将野生型WT与OsMOT1；2突变体的种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，培养两周后将幼苗移栽至装有5kg土壤的黑色塑料桶中，每桶一个重复，共计6桶，置于温室中，水肥管理遵从正常大田管理；

2)在水稻的成熟期，收获野生型与OsMOT1；2突变体osmot1；2-1、osmot1；2-2、osmot1；2-3 植株，分籽粒、颖壳、枝梗、节、节间、叶片以及叶鞘取样；

3)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

本实施例表明钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2突变后，突变体的籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节钼含量、节间钼含量、叶片钼含量以及叶鞘钼含量均显著下降(图6)。

实施例10

大田条件下，实施例4制备的钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达株系的钼含量测定，具体实施过程如下：

1)将野生型WT与OsMOT1；2超表达株系的种子在37℃下催芽2天后，播种在悬浮于自来水的塑料黑网上，培养两周后将幼苗移栽至大田中，水肥管理遵从正常大田管理；

2)在水稻的成熟期，收获野生型与OsMOT1；2超表达株系的植株OE-1和OE-2，分籽粒、颖壳、枝梗、节、节间、叶片以及叶鞘取样；

3)烘干样品，称重。用石墨炉消煮样品后，ICP-MS测定样品钼含量。

本实施例表明钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1；2超表达后，超表达株系的籽粒钼含量、颖壳钼含量、枝梗钼含量、节钼含量、节间钼含量均显著提高(图7)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻钼酸盐转运蛋白编码基因OsMOT1;2的应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1786

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

gtggatcaaa cttgagttca ctggactctg ccactacgga aatctggatc gcatcttaat 60

taagcctcga gagagacatt agtattttta ttcgctcatt ccaccggtca gaaacgtgtg 120

caagctaaca acatcgctag gcaaaaggaa gtcgttgctt tcgagtttcc cacccatggc 180

atcctccgcc ggcgacccgc tcctctccgg cgaggccggc gacggccgcc gcaggttcgt 240

cccgtccacc atacggctca agacgtcggt gtggtcggag ctgggcggcg cggtgggcga 300

tctgggcacc tacatcccca tcgtgctggc gctgtcgctc gcgtcccacc tcgacctcgg 360

caccacgctc atcttcaccg cgctctacaa cttcgccacc gggctcctct tcggcatccc 420

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catcccgcag atcatgtccg ctggcctcgc cgtcgccgcc atcctcctct tcctcggcgt 540

caccggcctc atgaccaccc tctaccgcct cctcccgctc cccgtcgtgc gcggcgtcca 600

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cttctcccgt tcctcctctg cttccacctc cgtgccgcgc cccctcctcg gcctcgacgg 720

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

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ggagatgctt ga 1392

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<212> DNA