一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法
阅读说明：本技术 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法 (Method for extracting eucommia ulmoides leaf polysaccharide by using microbial fermentation method ) 是由 陈虹 张建芬 雷超 柯薇 陆胤 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法,杜仲叶粉中加入无菌蔗糖水溶液,接种毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67孢子,于28–30℃发酵2–3d,发酵物加去离子水25-30℃浸提,然后超声波辅助浸提后,浓缩至原体积的1/10–1/7.5,获得浓缩物；浓缩物加入乙醇水溶液在4℃沉淀,离心,沉淀物真空干燥,获得杜仲叶多糖粗提物；在杜仲叶多糖超声水提前,增加了毡毛青霉DZ-9-67的发酵预处理,较不采用发酵预处理的超声水提法相比,杜仲叶多糖的提取得率可以提高33.7％。(The invention discloses a method for extracting eucommia ulmoides leaf polysaccharide by using a microbial fermentation method, which comprises the steps of adding sterile sucrose aqueous solution into eucommia ulmoides leaf powder, inoculating Penicillium maculosum (Penicillium velutinum) DZ-9-67 spores, fermenting for 2-3 d at 28-30 ℃, adding deionized water into a fermented product, leaching at 25-30 ℃, concentrating to 1/10-1/7.5 of the original volume after ultrasonic-assisted leaching, and obtaining a concentrate; adding ethanol water solution into the concentrate, precipitating at 4 deg.C, centrifuging, and vacuum drying the precipitate to obtain folium Eucommiae polysaccharide crude extract; the fermentation pretreatment of penicillium lanosum DZ-9-67 is added in advance of the ultrasonic water extraction of the eucommia ulmoides leaf polysaccharide, and compared with an ultrasonic water extraction method without the fermentation pretreatment, the extraction yield of the eucommia ulmoides leaf polysaccharide can be improved by 33.7%.)
(一)
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术在杜仲叶多糖提取中的应用。
(二)
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物。杜仲在我国栽培已有两千多年的历史。我国第一部药书汉代的《神农本草经》就记载了杜仲树皮的药效，并将杜仲列为上品。明代李时珍著作《本草纲目》中更为详细的记述了杜仲药名的由来和药效。2020年版中国药典一部药材和饮片中收录了杜仲(Eucommiae Cortex)和杜仲叶(Eucommiae Folium)。药典记载杜仲的功能与主治为：补肝肾，强筋骨，安胎。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安；杜仲叶的功能与主治为：补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。
杜仲含有多种生物活性成分，包括木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类等化合物，其中多糖是杜仲药理活性主要成分之一。现代药理学研究表明：杜仲多糖具有降血糖、提高免疫力、抗肝纤维化、抗疲劳、抗氧化、抗病毒和抗炎等作用[张晓芳,胡文忠,姜爱丽,等.杜仲多糖的提取方法及药理作用研究进展.中国新药杂志,2021,30(4):347-351]，它在药物和保健食品等领域有广泛应用前景。
目前，对杜仲多糖提取方法有较多的研究报道，常见的提取方法主要有热水浸提法、超声波或微波辅助提取法和酶辅助提取法等。不同的提取工艺有各自的优缺点，多糖提取得率也差异较大。热水浸提法的耗时长且多糖提取率低；超声波或微波辅助提取法是在热水浸提的基础上，增加超声波或微波处理步骤，促进多糖的溶出，提取得率相对较高，因此具有相对的优势；酶辅助提取法是在前面3种提取方法的基础上，增加了酶处理步骤，常用的酶有纤维素酶、果胶酶和蛋白酶。酶辅助提取虽然可以提高的多糖得率，但使用商品化的纯酶无疑增加了生产成本，限制了它的工业化应用。为了进一步提高杜仲叶多糖的提取得率，本发明对杜仲叶多糖超声波水提法工艺进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，从而可以显著提高杜仲叶多糖的提取得率。
(三)
发明内容
本发明目的是将微生物发酵技术应于杜仲叶多糖的超声波提取中，从而显著提高杜仲叶多糖提取得率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法，所述方法为：杜仲叶粉中加入无菌蔗糖水溶液，接种毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67孢子，于28–30℃发酵2–3d，发酵物加去离子水25-30℃(优选30℃)浸提，然后超声波辅助浸提后，浓缩至原体积的1/10–1/7.5，获得浓缩物；浓缩物加入乙醇水溶液在4℃沉淀，离心，沉淀物真空干燥，获得杜仲叶多糖粗提物；所述毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
进一步，所述的无菌蔗糖水溶液浓度是3–5g/L，经高压蒸汽121℃灭菌15min，无菌蔗糖水溶液体积用量以杜仲叶粉重量计为1.0–1.5mL/g，所述毡毛青霉DZ-9-67孢子接种量以杜仲叶粉重量计为5×107–7×107个/g；所述杜仲叶粉是将成熟的绿色杜仲叶烘干粉碎后过20目筛获得。
进一步，所述加去离子水室温浸提时间为4–6h，所述去离子水体积加入量以发酵前杜仲叶粉重量计为15–20mL/g。
进一步，所述超声辅助浸提是在80–90℃的超声波清洗机中，200–300W超声提取1–2h。
进一步，乙醇水溶液体积浓度为95％，所述乙醇水溶液体积用量为浓缩物体积的4–5倍。
进一步，所述毡毛青霉DZ-9-67孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28–30℃恒温培养1.5–2d后，加入无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108–7×108个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，所述浓缩物的制备方法为：发酵物加入去离子水，搅拌均匀后，先置于30℃水浴中保温4–6h，之后转入水温80–90℃的超声波清洗机中，200–300W超声提取1–2h；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液55℃减压浓缩至原体积的1/10–1/7.5，获得浓缩物；所述去离子水体积加入量以发酵前杜仲叶粉重量计为15–20mL/g。
进一步，所述杜仲叶多糖粗提物的制备方法为：向浓缩物中加入4–5倍体积的95％乙醇，4℃条件下静置8–12h后，室温条件下8000r/min离心5–10min，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，得杜仲叶多糖粗提物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在杜仲叶多糖超声水提前，增加了毡毛青霉DZ-9-67的发酵预处理。毡毛青霉DZ-9-67在杜仲叶粉中适度生长，产生多种多糖水解酶，然后在适宜的温度下酶解，使得杜仲叶结构组织疏松，促进结合态可溶性多糖的解离，在热水超声浸提时更容易溶出。较不采用发酵预处理的超声水提法相比，杜仲叶多糖的提取得率可以提高33.7％。
(四)
附图说明
图1毡毛青霉DZ-9-67的菌落形态图。
图2苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线(以葡萄糖为标准品)。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的杜仲叶为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥叶，中药材的拉丁学名为Eucommiae Folium，在夏秋二季枝叶茂盛时采收，晒干或低温烘干。杜仲叶粉是干燥的杜仲叶经粉碎后过20目筛的细粉。
实施例1：发酵菌株的分离和筛选
发酵杜仲叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选：
(1)250-mL三角瓶中加入约5g的杜仲叶粉，再加入5mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株14株，各菌株的编号见表1。
(2)14个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/mL，即为各菌株的孢子液。
(3)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10mL的浓度为3g/L无菌蔗糖水溶液，再接种1mL上述步骤(2)各菌株的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下发酵培养3d。
(4)步骤(3)经发酵的全部杜仲叶粉中，加入150mL的去离子水，搅拌均匀后置于30℃恒温水浴锅中保温4h，间隔15min手摇振荡一次，之后三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，200W超声提取1h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至20mL，获得浓缩液，苯酚-硫酸法测定浓缩液中多糖含量。
同样条件下，以不接种孢子液未经发酵的杜仲叶粉作对照，杜仲叶粉经不同菌株发酵后，多糖的提取得率见表1。
表1不同菌株发酵杜仲叶后多糖的提取得率
由表1数据可以看出，杜仲叶粉经菌株DZ-9发酵后，较未经发酵的对照相比，多糖的提取得率提高幅度最高，达到了14.2％，本发明选定该菌株作为提高杜仲叶多糖提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的杜仲叶多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：将杜仲叶粗多糖用蒸馏水配制成浓度为0.1mg/mL的样品溶液。吸取样品溶液2mL于25-mL比色管中，加1mL的体积浓度5％苯酚水溶液，摇匀后迅速滴加2.5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1mL蒸馏水作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同葡萄糖浓度样品的A490，绘制葡萄糖浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定杜仲叶粗多糖样品中多糖含量。
所述的杜仲叶多糖提取得率按以下公式计算：
实施例2：发酵菌株DZ-9的的诱变选育
对菌株DZ-9进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：将菌株DZ-9经PDA平板培养基活化培养2d后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡20min。孢子悬液经过过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1×108个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取2.0mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养1.5d，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。经过2轮筛选，从85个菌株中筛选获得一株编号为DZ-9-67的菌株，对提高杜仲叶总黄酮提取得率的发酵性能最好。用该菌株发酵杜仲叶后，多糖的提取得率为5.70％，较出发菌株DZ-9的5.06％提高了14.4％，较未经发酵对照的4.43％提高了28.7％。DZ-9-67菌株经过转接传代5次，每代发酵杜仲叶后的多糖提取得率波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
实施例3：菌株DZ-9-67的分类鉴定
株DZ-9-67接种在PDA平板培养基上，28℃培养3d，菌落初期为灰白色细短绒毛状，后逐渐变为绿色至橄榄绿色，中部隆起而其他部分平坦，表面产生大量粉状分生孢子。气生菌丝顶端产生分生孢子梗，梗的顶端1–4个分枝，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成典型的帚状分生孢子穗；分生孢子呈球形或近似球形，直径2.5–3.0μm，绿色。毡毛青霉DZ-9-67在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
将菌株DZ-9-67交由生工生物工程(上海)有限公司测得其核糖体ITS区rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与5株已知的毡毛青霉(Penicillium velutinum)有大于99％的同源性。根据菌株DZ-9-67菌落特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株DZ-9-67的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，青霉属(Penicillium)，毡毛青霉(Penicillium velutinum)。
ITS区rDNA序列为：
TCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCTCTGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCAATTAGCTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCTTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGACAACAATCAATCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT。
综上，从杜仲叶粉的微生物富集物中分离的菌株DZ-9，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株DZ-9-67，即毡毛青霉(Penicillium velutinum)DZ-9-67，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶多糖的提取
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养2d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10mL的浓度为3g/L无菌蔗糖水溶液，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度以杜仲叶粉质量计为5×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2d，得发酵杜仲叶粉。
(3)步骤(2)经发酵的全部杜仲叶粉中，加入150mL的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温4h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，200W超声提取1h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至20mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入80mL的95％乙醇，4℃条件下静置8h后，室温条件下8000r/min离心5min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h至恒重，得杜仲叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从10g杜仲叶中提取得杜仲叶粗多糖0.949g，多糖含量为60.7％，即得到杜仲叶多糖0.576g，提取得率为5.76％，产品为灰绿色粉状物。
实施例5：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶多糖的提取
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养1.5d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为6×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加12.5mL的浓度为4g/L的无菌蔗糖水溶液，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度以杜仲叶粉质量计为6×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2.5d，得发酵杜仲叶粉。
(3)步骤(2)经发酵的全部杜仲叶粉中，加入175mL的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温5h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，250W超声提取1.5h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至20mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入90mL的95％乙醇，4℃条件下静置10h后，室温条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h至恒重，得杜仲叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从10g杜仲叶中提取得杜仲叶粗多糖0.975g，多糖含量为63.2％，即得到杜仲叶多糖0.616g，提取得率为6.16％，产品为灰棕色粉状物。
实施例6：毡毛青霉DZ-9-67应用于杜仲叶多糖的提取
(1)低温保藏的毡毛青霉DZ-9-67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养1.5d，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为7×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)八层纱布扎口的250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加15mL的含5g/L蔗糖的无菌生理盐水，接种1mL步骤(1)制备的毡毛青霉DZ-9-67的孢子液(孢子接种浓度以杜仲叶粉质量计为7×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d，得发酵杜仲叶粉。
(3)向步骤(2)经发酵的全部杜仲叶粉中，加入200mL的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温6h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，300W超声提取2h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至20mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入100mL的95％乙醇，4℃条件下静置12h后，室温条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h至恒重，得杜仲叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从10g杜仲叶中提取得杜仲叶粗多糖0.996g，多糖含量为65.4％，即得到杜仲叶多糖0.651g，提取得率为6.51％，产品为灰棕色粉状物。
如不经本实施例步骤(2)的发酵过程，其他步骤按本实施例方法，10g的杜仲叶粉可提取获得杜仲叶粗多糖0.782g，多糖含量为62.3％，即得到杜仲叶多糖0.487g，提取得率为4.87％。可见，本实施例中，在杜仲叶多糖超声水提前，增加了毡毛青霉DZ-9-67的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，杜仲叶多糖的提取得率可以提高了33.7％。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 505
<212> DNA
<213> 毡毛青霉(Penicillium velutinum)
<400> 1
tcccacccgt gtttatcgta ccttgttgct tcggcgggcc cgcctcacgg ccgccggggg 60
gcttctgccc tctggcccgc gcccgccgaa gacaccattg aacgctgtct gaagattgca 120
gtctgagcaa ttagctaaat aagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttccggcat 180
cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgatacgt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 240
gagtctttga acgcacattg cgccccttgg tattccgggg ggcatgcctg tccgagcgtc 300
attgctgccc tcaagcacgg cttgtgtgtt gggccccgtc ctccttcccg ggggacgggc 360
ccgaaaggca gcggcggcac cgcgtccggt cctcgagcgt atggggcttc gtcttccgct 420
cttgtaggcc cggccggcgc ttgccgacaa caatcaatct tttttcaggt tgacctcgga 480
tcaggtaggg atacccgctg aactt 505
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