阅读说明：本技术 一种促进蚂蟥生长的金属元素添加方法 (Method for adding metal elements for promoting leech growth ) 是由 郭巧生 史红专 施国伟 于 2018-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种促进蚂蟥生长的金属元素添加方法。本发明目的在现有室内蚂蟥养殖技术基础上提供一种能显著提高蚂蟥体质量,增强免疫力,增加经济效益的养殖方法。采用本发明方法养殖蚂蟥,可比现有养殖蚂蟥体质量提高约22.07％,死亡率降低37.5％。与现有蚂蟥养殖相比,不完全统计,采用本发明方法养殖蚂蟥每亩可增加蚂蟥干重约31.55公斤,按照目前市场价1000元/kg计,每亩增加经济效益约3.16万元。(The invention provides a method for adding a metal element for promoting leech growth. The invention aims to provide a leech culture method which can obviously improve the quality of leeches, enhance the immunity and increase the economic benefit on the basis of the existing indoor leech culture technology. Compared with the prior leech culture method, the quality of the leech culture method is improved by about 22.07%, and the death rate is reduced by 37.5%. Compared with the existing leech culture, the leech culture method has the advantages that the leech culture method can increase the leech dry weight by about 31.55 kilograms per mu, and the economic benefit is increased by about 3.16 ten thousand yuan per mu according to the current market price of 1000 yuan per kg.)

一种促进蚂蟥生长的金属元素添加方法

一、技术领域

本发明涉及一种促进蚂蟥生长的金属元素添加方法，属于药用动物养殖领域。

二、背景技术

蚂蟥(Whitmania Pigra Whitman)为《中国药典》(2015年版)药材水蛭的基原动物之一，其干燥全体具有破血消症、逐瘀通经的功效，是众多治疗心血管疾病中成药的主要原料。随着对蚂蟥养殖技术研究的不断深入，其室内人工养殖方法已取得初步成效。

研究发现蚂蟥天然饵料梨形环棱螺(Bellamya purificata)(又名螺蛳)对于重金属离子有较高的富集作用，其体液中Zn²⁺含量达12.12mg·kg^-1。锌作为生物体必需元素，不仅在稳定多级结构和遗传物质的复制、转录过程中起重要作用，在内环境中锌也对细胞膜结构及功能维持方面具有重要意义。但当浓度聚集超过生态阈值时，会引起机体中毒。目前，蚂蟥室内人工养殖工作已初见成效，但鲜见Zn²⁺促进蚂蟥生长的报道。确定有利于蚂蟥生长的Zn²⁺水浴模式，可以促进蚂蟥体质量的增长，提高蚂蟥室内养殖的效率。

三、

发明内容

本发明目的在现有室内蚂蟥养殖方法基础上，提供一种显著提高蚂蟥体质量，增强免疫力，增加经济效益的养殖方法。

本发明在蚂蟥养殖水体中添加锌离子，使养殖水体Zn²⁺为0.5mg·L^-1，连续养殖50天，然后停止添加锌离子，其他养殖模式不变。期间保持室温为25±1℃，3天换1次水，使用曝气24h的自来水，换水时间为上午9：00左右，每次换水100％并清除残留螺蛳。养殖过程中发现有死亡蚂蟥及时清理。

通过实验统计和比较发现，采用本发明添加Zn²⁺养殖蚂蟥的方法，与现有蚂蟥养殖相比，可比现有养殖蚂蟥体质量提高约22.07％，死亡率降低37.5％。不完全统计，每亩可增加蚂蟥干重约31.55公斤，按照目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约 3.16万元。

四、附图说明

图1：Zn²⁺富集与释放对蚂蟥特定生长率的影响。

图2：Zn²⁺富集与释放对蚂蟥消化酶活性的影响Zn²⁺富集与释放对蚂蟥消化酶活性的影响(A：脂肪酶，B：淀粉酶，C：酸性蛋白酶，D：碱性蛋白酶)。

图3：Zn²⁺富集与释放对蚂蟥抗逆酶活性的影响(A：超氧化物歧化酶，B：过氧化氢酶，C：碱性磷酸酶)。

不同小写字母表示同一时期不同组别差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示同一组别不同时期差异显著(P＜0.05)。

五、

具体实施方式

1.材料

1.1实验材料及仪器：

蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥W.pigra。

Alpha-1506紫外可见分光光度计(上海谱光仪器有限公司)、5810R离心机(Eppendorf公司)、XHF-D匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、FYL-YS-108L 低温保存箱(北京福意电器有限公司)、ZD-2型自动电位滴定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)、FA 1104分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、KQ250B超声仪(苏州昆山市超声仪器有限公司)、GXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂)、电感耦合等离子体发射光谱仪(2100DC，美国)等。

2方法

2.1蚂蟥生长实验的设计

统一选取4g左右健康蚂蟥，在Zn²⁺对蚂蟥急性毒性实验的基础上，设置水体Zn²⁺浓度为0.3、0.4、0.5、0.6及0.7mg·L^-1五个Zn²⁺质量浓度组和一个空白对照组，每组 30瓶，每瓶10条。其他日常养殖和管理条件相同，实验时间为50天，初始与末期测定体重。筛选并确定最适宜蚂蟥生长的Zn²⁺浓度。

在上述试验基础上，统一选取3-4g健壮蚂蟥，在水体中添加适宜浓度Zn²⁺为Zn²⁺组，同时正常养殖为对照组，每组30瓶，每瓶10条。两组其他日常养殖和管理条件相同，实验时间为100天，其中前50天添加一定浓度Zn²⁺为Zn²⁺富集期，后50天停止添加为Zn²⁺释放期。每10天测定体重、不同组织Zn²⁺含量及消化道消化酶活性，第50天 (富集期末)和第100天(释放期末)检测蚂蟥内在品质。

在100天养殖实验中，根据以下公式计算每10天蚂蟥特定生长率(SGR)、存活率(SR)。式中Wt为实验第t天时的平均质量(g)，实验天数为T(10d)，W(t+10)为实验(t+10)天时的平均质量(g)。

SR(％)＝100×(总条数-死亡条数)/总条数

SGR(％)＝100×(lnW(t+10)-lnWt)/T

2.2消化酶活性的测定

用预冷的蒸馏水洗净，吸干消化道组织表面水分，冰浴中匀浆，加蒸馏水，稀释成含原浆20％的溶液，4℃离心15min(转速为8000r·min^-1)，所得上清液为酶液。

淀粉酶活力采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉酶活力，规定在37℃条件下，单位体积的酶量1min水解淀粉生成1mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位；脂肪酶活力采用对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法，规定在37℃条件下，1min催化释放1μmol对硝基酚的酶量定义为1个酶活力单位；蛋白酶活力采用福林-酚法，规定每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。组织匀浆液蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250比色法测定。

定义每毫克可溶性酶蛋白所具有的酶活力单位数(U·mg^-1)为1个酶比活 (U·mg^-1·prot^-1)。

2.3蚂蟥不同组织Zn²⁺含量的测定

每隔10天取2.1富集和释放实验中Zn²⁺和对照组蚂蟥皮肤、肌肉、消化道进行微波消解，然后采用电感耦合等离子体质谱法测定Zn²⁺含量。

2.4内在品质测定

采集富集与释放末期蚂蟥，按照2015版《中国药典》方法测定蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度、抗凝血酶活性。

2.5统计方法

试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包(One-Way ANOVE，LSD)进行分析。

3结果与分析

3.1不同浓度Zn²⁺对蚂蟥生长的影响

不同浓度Zn²⁺对蚂蟥生长的影响见表1。由表1可知：在实验初期20-30天内，Zn²⁺组除第20天0.5-0.7mg·L^-1浓度组外，其余浓度Zn²⁺组蚂蟥特定生长率显著高于对照组(P ＜0.05)。40天时Zn²⁺浓度高于0.5mg·L^-1组蚂蟥特定生长率均低于对照组，第50天时离子组特定生长率均不高于对照组。

表1不同浓度Zn²⁺对蚂蟥体重增长的影响

注：不同小写字母表示同一时期不同组别差异显著(P＜0.05)。表2与表4相同。

3.2 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥生长的影响

在3.1基础上，筛选对蚂蟥生长影响最好的0.5mg·L^-1Zn²⁺组，继续观察Zn²⁺富集与释放对蚂蟥生长性能的影响。Zn²⁺富集与释放对蚂蟥体重与死亡率的影响见表2、对特定生长率的影响见图1。

由表2可知，富集第10天起到第100天释放末期Zn²⁺组蚂蟥体重显著大于对照组(P＜0.05)。Zn²⁺富集和释放过程中蚂蟥的死亡率远小于对照组；富集过程死亡率小于释放过程。

表2 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥体重与死亡率的影响

由附图1可知，随着富集时间的延长，Zn²⁺组特定生长率与对照组差异逐渐缩小，富集40天内Zn²⁺组蚂蟥的特定生长率显著高于对照组(P＜0.05)，富集第50天时各组特定生长率无明显差异(P＞0.05)。离子释放时期Zn²⁺组与对照组特定生长率无显著差异 (P＞0.05)。

注：不同小写字母表示同一时期不同组别差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示同一组别不同时期差异显著(P＜0.05)。图2-3及表3相同。3.3 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥消化酶的影响

Zn²⁺富集与释放对蚂蟥消化酶活性的影响见图2。由图2可知，对照组和Zn²⁺组消化酶活性呈先升高后降低趋势，30-50天达到最大值。前40天内Zn²⁺组蚂蟥消化酶除脂肪酶外均显著大于对照组(P＜0.05)，Zn²⁺组第50天碱性蛋白酶显著高于对照组(P＜0.05)，其余时间段Zn²⁺组所有消化酶活性均与对照组无显著性差异(P＞0.05)。

3.4 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥抗逆酶的影响

Zn²⁺富集与释放对蚂蟥抗逆酶的影响见图3。由图3可知，Zn²⁺对蚂蟥抗逆酶活性的影响为：Zn²⁺组SOD与AKP活性在富集开始30天内显著高于对照组(P＜0.05)，其余时间段，Zn²⁺组与对照组无显著性差异(P＞0.05)；Zn²⁺组CAT活性在富集开始40天内显著高于对照组(P＜0.05)，其余时间段，Zn²⁺组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。

3.5蚂蟥不同组织Zn²⁺富集与释放规律

蚂蟥不同组织对Zn²⁺富集与释放规律见表3。由表3可知，对照组蚂蟥不同组织 Zn^{2 +}含量均随着时间延长而上升，直至第90天左右逐渐稳定；Zn²⁺组不同组织Zn²⁺含量富集期和释放期前20天均有显著差异(P＜0.05)，其中富集期升高，释放期降低，并在释放期第30天左右逐渐稳定。整个富集期和释放期的前30天，同一时期Zn²⁺组不同组织含量均显著高于对照组(P＜0.05)，释放第40天开始两组Zn²⁺含量均渐趋稳定且无显著差异(P＞0.05)。

由表3可知，Zn²⁺在不同组织中的含量为皮肤＜肌肉＜消化道，其中消化道与肌肉中含量显著高于皮肤(P＜0.05)，消化道与肌肉中含量无显著差异(P＞0.05)。与对照组相比，Zn²⁺组皮肤、肌肉与消化道中Zn²⁺的增加量富集末期分别为43.50mg·kg^-1、59.87 mg·kg^-1和57.00mg·kg^-1，释放末期分别为-60.60mg·kg^-1、-58.05mg·kg^-1和-58.25mg·kg^-1，可知蚂蟥不同组织对Zn²⁺富集能力为肌肉＞消化道＞皮肤，释放能力为皮肤＞消化道＞肌肉。

表3 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥不同组织Zn²⁺含量的影响(mg·kg^-1)

3.6 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥内在品质的影响

Zn²⁺富集与释放对蚂蟥内在品质的影响见表4。由表4可知，Zn²⁺组在富集末期和释放末期酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等内在品质与对照组无显著差异(P＞0.05)。

表4 Zn²⁺富集与释放对蚂蟥内在品质的影响

4综合评判

本实验结果显示，添加浓度为0.5mg·L^-1Zn²⁺养殖蚂蟥，可以提高蚂蟥生长性能与免疫能力，可比现有养殖蚂蟥的体质量提高约22.07％，死亡率降低37.5％，但对蚂蟥内在品质无显著影响。但鉴于蚂蟥为药用动物，为尽可能达到安全，需离子释放至少 40天。与现有蚂蟥养殖相比，不完全统计，在蚂蟥养殖水体中添加0.5mg·L^-1Zn²⁺50天，每亩可增加蚂蟥干重约31.55公斤，按照目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约3.16万元。

具体实施例1：

选取体重3.61±0.27g蚂蟥，添加锌离子在养殖水体中，使养殖水体中Zn²⁺浓度为0.5mg·L^-1，养殖50天后停止添加锌离子，继续用曝气24小时后的自来水养殖30天。期间保持室温为25±1℃，3天换1次水，换水时间为上午9：00左右，每次换水100％并清除残留螺蛳，换水后投喂在自来水中暂养3天的新鲜梨形环棱螺。养殖过程中发现有死亡蚂蟥及时清理。

本发明阐述的实施例及权利要求并不是对本发明的限定，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化均落入本发明保护范围内。