阅读说明：本技术 一种制备血管支架的复合工艺方法 (Composite process method for preparing intravascular stent ) 是由 胡庆夕 沈志鹏 张海光 刘随红 于 2019-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种制备血管支架的复合工艺方法,采用两种不同的工艺制备三层血管支架结构,内层材料为PLCL,PEG以及内皮生长因子,采用电纺丝,并形成轴向有序的纺丝；中间层为胶原蛋白,采用电化学法,制备的胶原层比胶原蛋白水凝胶更加坚实；最外层采用电纺丝,材料为PLCL,将纺丝收集为周向有序。本发明制备出的血管支架很好地模拟了天然血管地三层结构,在临床应用中具有广阔前景。(The invention relates to a composite process method for preparing a vascular stent, which adopts two different processes to prepare a three-layer vascular stent structure, wherein inner layer materials are PLCL, PEG and endothelial growth factor, and adopts electrospinning and forms axially ordered spinning; the middle layer is collagen, and the prepared collagen layer is firmer than the collagen hydrogel by adopting an electrochemical method; the outermost layer adopts electrospinning, the material is PLCL, and the spinning is collected to be circumferentially ordered. The vascular stent prepared by the invention well simulates the three-layer structure of the natural blood vessel and has wide prospect in clinical application.)

一种制备血管支架的复合工艺方法

技术领域

本发明涉及一种制备血管支架的复合工艺方法，应用于生物制造技术和组织修复领域。

背景技术

心血管疾病已经成为世界上人口死亡的主要原因之一，心血管疾病的主要病因有内膜增生和血栓生成从而导致血管闭塞，一旦发生血管闭塞，就会导致距离心脏较远的组织缺血，使其丧失原本的组织功能。目前利用金属、尼龙、聚四氟乙烯等材料制备的大口径人工血管 (>6mm)在人体大中动脉缺损修复领域已获得广泛的成功，然而对于小口径的血管(<6mm) 还没有合适的解决方案，现在主要的治疗手段为血管移植，但是由于自体血管来源有限，以及异体脱细胞技术的价格昂贵，因此临床上需要大量的人工血管作为移植代替物。

随着近些年对血管支架的广泛研究，发现目前对于血管支架最好的制备方式就是模仿天然血管的三层结构从而达到血管移植的目的，然而现在单一的技术已经很难达到适合移植的血管支架的性能要求。目前随着材料学、组织工程学、细胞生物学和临床医学等的飞速发展，使得采用复合工艺构建组织工程人工血管成为可能，也成为国内外研究的重点和热点。

理想的组织工程化血管应具有如下条件：1)具有或模拟体内血管壁三层结构(即外膜、中膜和内膜)；2)具有良好的生物相容性，不易产生血栓，不易发生免疫排斥反应；3)具有生物学特性，如对药物刺激有舒缩反应；4)具有血管的力学特性，即能够提供足够的强度，并具有一定的粘弹性。

发明内容

为了解决现阶段制备组织工程血管支架的不足，本发明的目的是提供了一种制备血管支架的复合工艺方法，从而解决单一制备工艺所带来的局限性，可以更好地模拟天然的血管以及细胞外基质，使得制备的血管支架更加符合临床医学上的各种性能的要求。

为了达到上述的目的，本发明采用的技术方案如下：

一种制备血管支架的复合工艺方法，包括以下步骤：

a.将PLCL(聚(L-乳酸-ε-己内酯))与PEG(聚乙二醇)一起溶解在体积比为1：1氯化钙和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配置成150mg/mL～350mg/mL溶液作为油相，加入载有内皮生长因子三甲基化壳聚糖作为水相，将油相和水相充分混合，搅拌至制备成稳定的水乳溶液；

b.将a中的水乳溶液装载到料筒中进行静电纺丝，用一根接收棒来收集电纺丝，制备得到厚度为200～400μm周向排列电纺丝层；

c.将收集到周向排列的电纺丝层用医用剪刀剪开，铺平放在盛有酒精的培养皿中，并用消过毒的方铁块压在电纺丝层上，经过2～3天的培养，然后将已经平整的电纺丝层重新卷在另外一根直径为2～3mm的电极棒上，接着将电纺丝用PLA(聚乳酸)线进行缝合，最后进行修整，得到所需的轴向排列的电纺丝；

d.将胶原蛋白在常温下在蒸馏水200～300mL中充分溶解并进行长时间搅拌，然后将c 中的具有缝合好内层电极棒作为负极，一个同心空心圆柱棒作为正极，通过电吸附使胶原附着在电纺层上，然后通过调控电极棒(负极)和圆柱棒(正极)之间的距离，从而获得0.4～0.5mm 的压实胶原层作为中间层；

e.将d中制备电极棒(包裹着内层电纺丝和中间层胶原层)取出，去除胶原中的气泡，然后将两层膜和接收棒在酒精中浸泡2小时并照紫外灯进行消毒，然后用PBS(磷酸盐缓冲液)溶液清洗3～5次，置换出支架中残余的酒精；

f.将e中电极棒取下，再以接收棒为接收平台，再在外层电纺一层周向排列的PLCL层，最终获得三层血管支架。

所述步骤a中，采用PLCL与PEG质量配比为(5～10)：1，采用的油相与水相体积之比为(10～20)：1。

在所述步骤b中制作血管支架内层时，所述接收棒的直径为2～3cm，控制接收棒接收电纺丝在轴上的接收范围长度为7～9mm，所述接收棒的材质为316L不锈钢实心电极棒。

在所述步骤b和步骤c中制作血管支架内层时，所述接收棒与针头之间的电压为10～15kv，注射速度为0.8～1.2mL/h，针头尖端到接收棒之间的距离为10～15cm，电纺1～3h。

在所述步骤d与步骤e中制作血管支架中间层时，其电化电压为2.5～3.5V，电化时长为 30～45min，作为正极的圆柱棒为316L不锈钢空心圆柱电极棒。

在所述步骤e中放置在真空下处理电化产生的氢气和氧气气泡。

所述步骤f中制作血管支架外层时，控制电纺丝的电压为10～15kv，注射速度为3～5mL/h，电极棒的转速控制在800～1000r/min，针头到电极棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为1～3h。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的优点：

1.本发明制备的血管支架采用的是具有生物相容性并可降解的生物材料，因此具有良好的生物相容性。

2.本发明制备的血管支架内层和外层都是采用的PLCL材料，此材料拥有足够的机械强度和顺应性，而中间层采用的是电化蛋白胶原层，因此拥有足够的强度。

3.本发明制备的血管支架的内层采用PGA(聚羟基乙酸)与PLCL材料包含内皮生长因子，其中PGA材料降解速度较快，可以快速释放内皮生长因子从而加快内皮化。

4.本发明制备的血管支架的内层采用轴向排列与血流方向一致，符合内皮细胞生长吸附繁殖的习性。

5.本发明制备的血管支架的中间层采用电化胶原层，相比于普通的胶原层，此胶原层强度更高，硬度更加硬，更好的模拟了天然血管胶原层，有利于平滑肌细胞的附着。

6.本发明制备的血管支架的外层采用周向排列的电纺层，周向排列的电纺层更加有利于平滑肌细胞的吸附。

附图说明

图1是本发明在制备血管支架内层结构采用的电纺设备结构示意图。

图2是本发明将内层电纺丝层剪开后用铁块压着浸泡在酒精消毒的示意图。

图3是本发明在制备血管支架中间层结构采用的电化学结构示意图。

图4是本发明制备血管支架的最终三层结构示意图。

在图1至图4中：

1—方铁块， 2—剪开支架内层膜， 3—酒精，

4—培养皿， 5—胶原蛋白溶液， 6—接收棒，

7—PLCL与PGA混合层， 8—胶原层， 9—血管支架外层，

10—血管支架中间层， 11—血管支架内层。

具体实施方式

以下结合附图对上述技术方案做出进一步说明，本发明得优选实施例详述如下：

实施例一：

一种制备血管支架的复合工艺方法，包括以下步骤：

a.将PLCL与PEG按照质量比为5：1溶于体积比为1：1氯化钙和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配置成150mg/mL溶液作为油相，加入载有内皮生长因子三甲基化壳聚糖作为水相，将油相和水相按照10：1充分混合，搅拌至制备成稳定的水乳溶液。

b.将a中的水乳溶液装载到料筒中进行静电纺丝，如图1所示，用一根直径为2.5cm的 316L不锈钢实心电极棒作为接收棒来收集电纺丝，控制接收棒接收电纺丝在轴上的接收范围长度为7mm，其中接收棒与针头之间的电压为10kv，注射速度为0.8mL/h，针头尖端到接收棒之间的距离为10cm，电纺1h，制备得到厚度为150μm周向排列电纺层。

c.将收集到周向排列的电纺丝层用医用剪刀剪开，铺平放在盛有酒精3的培养皿4中，并用消过毒的方铁块1压在电纺丝层2上，经过3天的培养，然后将已经平整的电纺丝层重新卷在直径为2mm的电极棒上，接着将电纺丝用PLA线进行缝合，最后进行修整，得到所需的轴向排列的电纺丝，如图2所示。

d.将胶原蛋白在常温下溶解在蒸馏水(200mL)中充分溶解并进行长时间搅拌，然后将 c中的具有缝合好内层电极棒6作为负极，一个同心空心圆柱棒9作为正极，将2.5V电压施加在两者之间，通过电吸附使胶原附着在电纺层上，通电时长控制在30分钟，然后通过调控电极棒6(负极)和圆柱棒9(正极)之间的距离，电化20min，从而获得压实胶原层8作为中间层，如图3所示。

e.将d中制备获得的两层膜及电极棒取出来放置在真空环境下去除胶原中的气泡，然后将两层膜和电极棒在酒精中浸泡2小时并照紫外灯进行消毒，然后用PBS溶液清洗5次，置换出支架中残余的酒精。

f.将e中两层膜以及接收棒取下，再以电极棒为接收平台，再在外层电纺一层周向排列的PLCL层9，其中具体的电纺条件为：电压为15kv，注射速度为3mL/h，电极棒的转速控制在800r/min，针头到电极棒之间的距离为10cm，电纺时间为1h，最终获得三层血管支架(PLCL层9，胶原层10和PLCL/PEG层)，如图4所示。

实施例二：

本实施例与实施例一基本相同，一种制备血管支架的复合工艺方法，包括以下步骤：

a.将PLCL与PEG按照质量比为7：1溶于体积比为1：1氯化钙和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配置成250mg/mL溶液作为油相，加入载有内皮生长因子三甲基化壳聚糖作为水相，将油相和水相按照15：1充分混合，搅拌至制备成稳定的水乳溶液。

b.将a中的水乳溶液装载到料筒中进行静电纺丝，用一根直径为2.5cm的316L不锈钢实心电极棒作为接收棒来收集电纺丝，控制接收棒接收电纺丝在轴上的接收范围长度为8mm，其中接收棒与针头之间的电压为10kv，注射速度为1mL/h，针头尖端到接收棒之间的距离为12cm，电纺1.5h，最终制备得到周向排列电纺层170um。

c.将收集到周向排列的电纺丝层用医用剪刀剪开，铺平放在盛有酒精3的培养皿4中，并用消过毒的方铁块1压在电纺丝层2上，经过2天的培养，然后将已经平整的电纺丝层重新卷在直径为2.5mm的电极棒上，接着将电纺丝用PLA线进行缝合，最后进行修整，得到想要的轴向排列的电纺丝。

d.将胶原蛋白在常温下溶解在蒸馏水(250mL)中充分溶解并进行长时间搅拌，然后将 c中的电极棒作为负极，再找一个同心实心圆柱棒9作为正极，将3V电压施加在两者之间，通过电吸附使胶原附着在电纺层上，通电时长控制在40分钟，然后通过调控电极棒6(负极) 和同心实心圆柱棒9(正极)之间的距离，电化40min，从而获得压实胶原层作为中间层。

e.将d中制备获得的两层膜及电极棒取出来放置在真空环境下去除胶原中的气泡，然后将两层膜和电极棒在酒精中浸泡2小时并照紫外灯进行消毒，然后用PBS溶液清洗4次，置换出支架中残余的酒精。

f.将e中两层膜以及电极棒取下，再以电极棒为接收平台，再在外层电纺一层周向排列的PLCL层，其中具体的电纺条件为：电压为15kv，注射速度为4mL/h，接收棒的转速控制在900r/min，针头到接收棒之间的距离为12cm，电纺时间为2h，最终获得三层血管支架。

实施例三：

本实施例与实施例一基本相同，一种制备血管支架的复合工艺方法，包括以下步骤：

a.将PLCL与PEG按照质量比为10：1溶于体积比为1：1氯化钙和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配置成350mg/mL溶液作为油相，加入载有内皮生长因子三甲基化壳聚糖作为水相，将油相和水相按照20：1充分混合，搅拌至制备成稳定的水乳溶液。

b.将a中的水乳溶液装载到料筒中进行静电纺丝，用一根直径为3cm的316L不锈钢实心电极棒作为接收棒来收集电纺丝，控制接收棒接收电纺丝在轴上的接收范围长度为9mm，其中接收棒与针头之间的电压为15kv，注射速度为1.2mL/h，针头尖端到接收棒之间的距离为15cm，电纺3h，最终制备得到周向排列电纺层200um。

c.将收集到周向排列的电纺丝层用医用剪刀剪开，铺平放在盛有酒精3的培养皿4中，并用消过毒的方铁块1压在电纺丝层2上，经过3天的培养，然后将已经平整的电纺丝层重新卷在直径为3mm的电极棒6上，接着将电纺丝用PLA线进行缝合，最后进行修整，得到想要的轴向排列的电纺丝。

d.将胶原蛋白在常温下溶解在蒸馏水(300mL)中充分溶解并进行长时间搅拌，然后将 c中的缝合好内层电极棒6作为负极，再找一个同心实心圆柱棒9作为正极，将3.5V电压施加在两者之间，通过电吸附使胶原附着在电纺层上，通电时长控制在45分钟，然后通过调控接收棒6(负极)和同心实心圆柱棒9(正极)之间的距离，电化45min从而获得压实胶原层作为中间层。

e.将d中制备获得的两层膜及电极棒取出来放置在真空环境下去除胶原中的气泡，然后将两层膜和电极棒在酒精中浸泡2小时并照紫外灯进行消毒，然后用PBS溶液清洗5次，置换出支架中残余的酒精。

f.将e中两层膜以及电极棒取下，再以电极棒为接收平台，再在外层电纺一层周向排列的PLCL层，其中具体的电纺条件为：电压为15kv，注射速度为5mL/h，电极棒的转速控制在1000r/min，针头到电极棒之间的距离为15cm，电纺时间为3h，最终获得三层血管支架。