阅读说明：本技术 用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法 (Transcription factor for improving wheat rust-resistant varieties and screening method thereof ) 是由 王晓杰 王宁 王建锋 汤春蕾 康振生 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于农作物品种培育技术领域,公开了一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法,转录因子为TaWRKY19及二穗短柄草中的WRKY转录因子BdWRKY67。TaWRKY19的编码ORF序列为SEQ ID NO：1。二穗短柄草WRKY转录因子基因BdWRKY67的编码ORF序列为SEQ ID NO：2。本发明采用农杆菌介导的遗传转化获得了WRKY转录因子的RNAi突变体,接种短柄草锈进行抗病性鉴定,结果发现BdWRKY67的RNAi植株抗病性显著提升。TaWRKY19转录因子的沉默植株小麦抗病性显著提升,而瞬时过表达植株对条锈菌的抗性也是明显减弱,可以用于小麦抗条锈病遗传改良。(The invention belongs to the technical field of crop variety cultivation, and discloses a transcription factor for improving a wheat rust-resistant variety and a screening obtaining method thereof, wherein the transcription factor is TaWRKY19 and a WRKY transcription factor BdWRKY67 in brachypodium distachyon. The coding ORF sequence of TaWRKY19 is SEQ ID NO: 1. the encoding ORF sequence of brachypodium distachyon WRKY transcription factor gene BdWRKY67 is SEQ ID NO: 2. the invention adopts agrobacterium-mediated genetic transformation to obtain an RNAi mutant of the WRKY transcription factor, and inoculates the brachypodium distachyon for disease resistance identification, and the result shows that the RNAi plant disease resistance of BdWRKY67 is obviously improved. The wheat disease resistance of a silent plant of the TaWRKY19 transcription factor is remarkably improved, and the resistance of a transient over-expression plant to stripe rust is also remarkably weakened, so that the wheat stripe rust resistant genetic improvement method can be used for wheat stripe rust resistant genetic improvement.)

用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法

技术领域

本发明属于农作物品种培育技术领域，尤其涉及一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：宿主植物在长期进化过程中形成的应对病原菌的反应最常用的方法是调节致病基因相关基因的表达水平。转录因子(Transcription factors)是植物中广泛存在的基因家族能够转录调控或者转录抑制基因响应相关的TFs增加，从而使寄主植物对抗病菌的侵扰。活体营养寄生型真菌包括柄锈菌Puccinia sp.、白粉菌Blumeria graminis和黑粉菌Ustilago maydis，它们是世界上三大主要的活体营养型致病真菌，常常给世界农作物造成严重的损害。植物病原菌通过特定的感染结构从宿主活组织中吸收营养物质而存活。小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst)是引起小麦条锈病的专性活体营养型真菌，是小麦上最重要的致病真菌，每年给作物造成严重的经济损失。此外，由于小麦条锈菌频繁变异，小麦品种往往失去抗性和利用价值。因此，筛选和寻找与植物免疫特别是调控因子相关的重要基因，对培育持久抗小麦条锈病品种具有重要的意义。

为阐明小麦-Puccinia相互作用的分子基础，应制定和应用近代抗性策略。然而，小麦表现出基因组庞大而复杂、转化效率低(TE)和遗传转化不良。在目前的研究阶段，将其应用于调控机制的研究具有一定的挑战性。短柄草(Brachypodium distachyon)为二倍体，其基因组序列小且质量高、世代周期短、繁殖快和TE高，已经成为后基因组时代研究基因功能的模式植物。因此，借助短柄草快速挖掘目标基因，开展其小麦同源基因研究为小麦抗性品种的改良提供了新策略。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)小麦表现出基因组庞大而复杂、转化效率低(TE)和遗传转化不良，急需寻找能够作为小麦模式植物的效率高、易培养、且侵染小麦的而多数病原菌都能侵染的植株-二穗短柄草。

(2)小麦抗病基因的发掘及利用是能够给与小麦作物改良的最为经济有效的措施，利用传统的遗传改良方法筛选耗时较长，如何快速挖掘抗病及其调控基因面临着重大的挑战。

(3)侵染小麦的多数病原真菌都能够侵染短柄草，其中包含禾谷类锈菌。是否可以利用模式植物二穗短柄草筛选鉴定在寄主和Puccinia互作中的关键WRKY转录因子？

解决上述技术问题的难度：利用模式植物筛选在寄主和Puccinia互作的关键基因，创制二穗短柄草WRKY转录因子突变体费时耗费大量的人力，但是对筛选到的转录因子基因是否与小麦中的同源基因在小麦与Puccinia互作中具有相同的功能呢？以及如何证明它们之间具有相同的功能？本发明都进行了相应的考虑。

解决上述技术问题的意义：证明利用模式植物二穗短柄草来筛选关键的转录因子基因的过程，对于应用短柄草这一模式植物开展小麦中基因功能的验证非常重要的意义。并且也证实了小麦中的基因功能与短柄草中同源基因的功能是相似的，对于利用该模式植物进行功能验证鉴定了基础，同时可以利用TaWRKY19进行小麦的抗条锈育种。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法。

本发明是这样实现的，一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子，所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子为TaWRKY19及二穗短柄草中的WRKY转录因子BdWRKY67；

所述TaWRKY19的编码ORF序列为SEQ ID NO：1；

所述二穗短柄草WRKY转录因子基因BdWRKY67的编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的筛选获得方法，所述用于用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的筛选获得方法包括以下步骤：

第一步，利用农杆菌介导的遗传转化的方法创制模式植物短柄草WRKY转录因子RNAi突变体库，对突变体材料接种短柄草锈，且短柄草锈和小麦条锈菌都属于禾谷柄锈菌，对其表型进行筛选鉴定，获得的BdWRKY67的RNAi植株产生了显著的抗病反应；

第二步，对筛选获得转录因子基因BdWRKY67与在小麦基因组中找到同源性最高的基因TaWRKY19，在小麦中分别进行瞬时的过表达实验，小麦的抗病性都显著减弱，说明利用模式植株短柄草筛选到的基因和小麦中的TaWRKY19在小麦与锈菌互作中具有相同的功能。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的表达谱分析方法，所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的表达谱分析方法以六倍体小麦品种水源11为材料，待小麦生长至二叶期，用涂抹法接种小麦条锈菌新鲜夏孢子，接种后放置于16℃黑暗保湿24h；然后放置在光周期16℃光照18h，14℃黑暗培养8h，分别采取0h，12h，18h，24h，48h，72h，120h，168h，216h样品，采用上述方法提取RNA后进行反转录获得cDNA；

以cDNA为模板，以延伸因子基因TaEF1-α为内参；利用TaWRKY19基因的特异引物进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性2min；95℃15sec，60℃35sec，40个循环，再加溶解曲线；

在各种处理时间下对TaWRKY19基因表达量的检测结果。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的表型鉴定方法，所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的表型鉴定方法以六倍体小麦品种水源11为材料，待小麦生长至二叶一心期，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默TaWRKY19的两个特异性片段TaWRKY19-1as，TaWRKY19-2as，二叶接种病毒第7天观察发现在沉默TaPDS后小麦叶片上呈现出漂白状，证明病毒接种成功；对3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子，接种后的保湿和培养同上描述，接种第12d观察叶片表面发现与对照相比。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子在小麦抗病品种培育中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子在培育抗小麦条锈病植物品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于小麦抗锈病品种改良的转录因子在农作物抗病品种培育中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用二穗短柄草筛选关键基因BdWRKY67，并证明该基因及其同源基因TaWRKY19在小麦和短柄草抗禾谷锈菌中的功能是相同的；发现TaWRKY19沉默的小麦植株，对小麦条锈菌的抗性显著提高，主要表现在沉默后的植株接种小麦条锈菌后条锈菌的生物量显著减少，产孢数目与对照相比显著性减少，可用于小麦的抗条锈病遗传改良。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的筛选获得方法流程图。

图2是本发明实施例提供的用短柄草锈接种处理苗期野生型二穗短柄草后的BdWRKY67基因的表达谱分析示意图。

图3是本发明实施例提供的用小麦条锈菌接种处理苗期野生型小麦后的TaWRKY19基因的表达谱分析示意图。

图4是本发明实施例提供的获得二穗短柄草突变体的分化筛选及土培过程图。

图5是本发明实施例提供的对二穗短柄草RNAi突变体植株PCR检测结果示意图，阳性植株在1159bp处有清晰的条带，扩增片段为为诱导基因LhmGr

图6是本发明实施例提供的二穗短柄草BdWRKY67-RNAi突变体植株生长表型，生长高度与野生型无明显差异示意图。

图7是本发明实施例提供的二穗短柄草BdWRY67-RNAi突变体植株接种短柄草锈抗病性显著增强示意图。

图8是本发明实施例提供的BdWRY67与TaWRKY19氨基酸序列比对结果示意图。

图9是本发明实施例提供的沉默TaWRKY19的两个片段小麦的抗病性都明显增强示意图。

图10是本发明实施例提供的在小麦中分别过表达TaWRKY19和BdWRKY67发现小麦的抗病性都显著减弱。

图11是本发明实施例TaWRKY19沉默的小麦植株接种小麦条锈菌后条锈菌的生物量显著减少，产孢数目与对照相比显著性减少。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其稍逊获得方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的转录因子为TaWRKY19及其相似度最高的短柄草中的WRKY转录因子BdWRKY67。

本发明的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY19的编码ORF序列为SEQ ID NO：1。

本发明的二穗短柄草WRKY转录因子基因BdWRKY67的编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

本发明植物优选单子叶植物能够被小麦条锈病菌成功侵染定制的禾谷类作物，特别优选小麦。

如图1所示，本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的筛选获得方法包括以下步骤：

S101：利用农杆菌介导的遗传转化的方法创制模式植物短柄草WRKY转录因子RNAi突变体库，对突变体材料接种短柄草锈，且短柄草锈和小麦条锈菌都属于禾谷柄锈菌，对其表型进行筛选鉴定，获得的BdWRKY67的RNAi植株产生了显著的抗病反应；

S102：对筛选获得转录因子基因BdWRKY67与在小麦基因组中找到同源性最高的基因TaWRKY19，在小麦中分别进行瞬时的过表达实验，小麦的抗病性都显著减弱，说明利用模式植株短柄草筛选到的基因和小麦中的TaWRKY19在小麦与锈菌互作中具有相同的功能。

SEQ ID NO：3：

正向引物：TaWRKY19-cDNA-F:ATGGTGCCTGAGTCTAGGAAC，反向引物：TaWRKY19-cDNA-R:CTAGAAGGCGAGATCGTTCAG

本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的小麦TaWRKY19转录因子的表达谱分析方法以六倍体小麦品种水源11为材料，待小麦生长至二叶期，用涂抹法接种小麦条锈菌新鲜夏孢子，接种后放置于16℃黑暗保湿24h，然后放置在光周期16℃光照18h，14℃黑暗培养8h，分别采取0h，12h，18h，24h，48h，72h，120h，168h，216h样品，采用上述方法提取RNA后进行反转录获得cDNA。以cDNA为模板，以延伸因子基因TaEF1-α为内参，其引物为TaEF1-α-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT；TaEF1-α-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT，利用TaWRKY19基因的特异引物TaWRKY19-qRT-F：GGAGCCTTCAACTAAATC；TaWRKY19-qRT-R：TGGCAATAAAACATCCGTCAT进行实时定量PCR，反应条件为：9595℃预变性2min；95℃15sec，60℃35sec，40个循环，再加溶解曲线。在各种处理时间下对TaWRKY19基因表达量的检测结果(如图3所示)，TaWRKY19基因能被小麦条锈菌亲和小种不同程度的诱导上调表达，是一个与小麦感条锈病相关的转录因子，可能在小麦与条锈菌互作中其负调控作用。

SEQ ID NO：4：

TaEF1-α-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT；

TaEF1-α-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT。

SEQ ID NO：5：

TaWRKY19-qRT-F：GGAGCCTTCAACTAAATC；

TaWRKY19-qRT-R：TGGCAATAAAACATCCGTCAT。

本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的转录因子的小麦TaWRKY19转录因子的表型鉴定方法以六倍体小麦品种水源11为材料，待小麦生长至二叶一心期，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默TaWRKY19的两个特异性片段TaWRKY19-1as，TaWRKY19-2as，二叶接种病毒第7天观察发现在沉默TaPDS后小麦叶片上呈现出漂白状，证明病毒接种成功。对3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子，接种后的保湿和培养同上描述，接种第12d观察叶片表面发现与对照相比，产孢量显著减少，沉默植株抗病性显著增强，说明TaWRKY19确实在小麦与条锈菌互作中其负调控作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

<210> 2

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5