具体实施方式

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他组分，也可以仅包括列出的组分。

根据本发明的一个优选实施方式，本发明记载的化学发光复合材料包含以下组分：

(i)氨基官能化磁珠；

(ii)第一金属颗粒，所述第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合；

(iii)第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合；

(iv)式(I)所示的发光体及任选的其氧化衍生物，

其中，A环表示C₆-C₁₄芳环；

R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₃₀)烷基，前提是该NR₁R₂具有至少一个NH₂端基。

根据本发明的一个实施方式，所述氨基官能化磁珠表示在表面上连接有氨基(NH₂-)的磁性材料的珠粒。根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠包含具有磁性的材料，例如Fe₃O₄、Co₂O₃、CoFe₂O₄、Ni₂O₃以及它们当中两种或更多种的混合物。

根据本发明的另一个优选的实施方式，所述磁珠包含上述磁性材料以及一种或多种包覆材料，所述包覆材料选自氧化硅、羟基氧化硅、硅酸盐、陶瓷材料、氧化铝、氮化铝、以及上述两种或更多种的组合。所述包覆材料至少部分地包覆所述磁性材料，优选完全包覆所述磁性材料。根据本发明的一个实施方式，所述磁珠中磁性材料与包覆材料的重量比为2:98至98:2，或者为5:95，或者为10:90，或者为20:80，或者为30:70，或者为40:60，或者为50:50，或者为60:40，或者为70:30，或者为80:20，或者为90:10。

根据本发明的另一个优选实施方式，在所述磁珠的表面具有氨基基团，所述氨基基团可以通过用氨基化试剂(例如氨水与烷基化试剂)对磁珠表面保护材料进行官能化而引入。根据使用的氨基化试剂种类的区别，连接在磁珠表面的氨基基团可以为各种不同的形式，例如连接在磁珠表面的氨基基团可以是-NH₂的形式，也可以是-R₀-NH₂的形式，其中R₀可以是C₁-C₁₂亚烷基或者进一步含有亚氨基或氨基的取代型亚烷基，例如R₀可以是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或-CHNH-C₂H₄NH-C₂H₄-。根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠表面连接的氨基的密度可以为0.01-50μmol/mg(磁珠重量)，例如可以为0.1-40μmol/mg，或者为0.15-30μmol/mg，或者为0.2-25μmol/mg，或者为0.4-20μmol/mg，或者为0.5-10μmol/mg，或者为0.8-8μmol/mg，或者为0.9-6μmol/mg，或者为1-5μmol/mg，或者为2-4μmol/mg。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠具有光滑的外表面，还具有球形或基本呈球形的形状。根据本发明的另一个实施方式，所述磁珠的粒径为纳米级或微米级，例如为5纳米至50微米，或者为10纳米至20微米，或者为20纳米至10微米，或者为40纳米至5微米，或者为50纳米至1微米，或者为60纳米至800纳米，或者为70纳米至500纳米，或者为100纳米至300纳米，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。

根据本发明一个非限制性的实施方式，所述磁珠可以通过以下方式合成：将纳米级磁性材料颗粒(例如四氧化三铁颗粒)分散在包覆材料前体(例如原硅酸四乙酯)中，通过凝胶溶胶过程获得由包覆材料包覆的磁性材料颗粒，也即尚未用氨基官能化的磁珠；然后用氨基化试剂(例如氨水和烷基化试剂的混合物)对其进行氨基官能化，得到可用于本发明的氨基官能化磁珠。上述磁珠的制备工艺是本领域已知的，并且已经商业化。在本发明的一些实施方式中，使用购自Biomag Technology Co.,Ltd.公司的氨基官能化磁珠。在本申请的全文中，用缩写MB表示未氨基官能化的“磁珠”，用MB-NH₂表示氨基官能化的磁珠。

根据本发明的一个实施方式，所述第一金属颗粒中的第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合。优选所述第一金属颗粒是金颗粒，或Au颗粒。根据一个优选的实施方式，所述第一金属颗粒的粒径为2-100纳米，例如为3-90纳米，或者为4-60纳米，或者为5-50纳米，或者为6-20纳米，或者为6-10纳米，或者为7-8nm。

根据本发明的另一个实施方式，所述式(I)的化合物也被称为发光体，

其中，A环表示C₆-C₁₄芳环，所述芳环包括苯环、萘环、蒽环等；

R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₃₀)烷基，前提是该NR₁R₂具有至少一个NH₂端基。

根据本发明的一个优选的实施方式，在所述式(I)的化合物中，所述A环表示C₆-C₁₀芳环，优选苯环、萘环或蒽环，所述R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₁₀)烷基，优选端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₆)烷基，前提是该-NR₁R₂部分具有至少一个NH₂端基。

根据本发明的一个更优选的实施方式，在所述通式(I)的化合物中，A环是苯环或萘环，且-NR₁R₂部分是氨基或N-(氨基C₁-C₆亚烷基)N-(C₁-C₆烷基)氨基；更优选A环是苯环，且-NR₁R₂部分是氨基、N-(4-氨基丁基)N-(乙基)氨基或(N-4-氨基己基)(N-乙基)氨基。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，特别优选式(I)的化合物具有以下所示的结构：

根据本发明的一个实施方式，所述第一金属颗粒可以使用第一金属的可溶性前体(例如HAuCl₄)在存在氨基官能化的磁珠和式(I)所示的发光体的条件下被还原，由此原位形成所述第一金属颗粒，并且使得形成的第一金属颗粒与MB-NH₂相连接。

根据本发明的一个实施方式，用来使得第一金属的可溶性前体还原的材料可以是本领域常规的还原剂，也可以是式(I)所示的发光体本身。当用于制备第一金属的还原剂另外提供的情况下，作为原料加入的式(I)的发光体基本没有或者完全没有参与上述通过还原反应制备第一金属颗粒的过程，因此本发明的化学发光复合材料中不包含式(I)所示发光体的氧化衍生物，所有的发光体均保持式(I)所示的未被氧化的状态。

根据本发明的另一个实施方式，在通过还原反应制备第一金属颗粒的过程中未添加另外的还原剂，由一部分式(I)所示发光体作为还原剂，在将第一金属的可溶性前体还原为第一金属颗粒的同时，式(I)所示发光体的一部分也被氧化而形成了其氧化衍生物。为了简化期间，在下文中称为“氧化衍生物”。根据本发明的一个优选实施方式，所述氧化衍生物表示式(I)中的基团被氧化形成两个羧基、或者两个羧酸酯基、或者二羧酯基之后得到的化合物。例如，对于下式所示的发光体，其氧化后会生成N-(4-氨基丁基)-N-乙基邻苯二甲酸酯。

根据本发明的一个实施方式，所述化学发光复合材料中仅包含式(I)的发光体而不含其氧化衍生物。

根据本发明的另一个实施方式，以所述化学发光复合材料中式(I)的发光体及任选的其氧化衍生物的总摩尔量为基准计，其中氧化衍生物的摩尔百分比可以在以下任意两个点组合得到的数值范围之内：0摩尔％、1摩尔％、3摩尔％、5摩尔％、8摩尔％、10摩尔％、12摩尔％、15摩尔％、18摩尔％、20摩尔％、22摩尔％、25摩尔％、28摩尔％、30摩尔％、32摩尔％、35摩尔％、38摩尔％、40摩尔％、42摩尔％、45摩尔％、48摩尔％、50摩尔％、52摩尔％、55摩尔％、58摩尔％、60摩尔％、62摩尔％、65摩尔％、68摩尔％、70摩尔％、72摩尔％、75摩尔％、78摩尔％、80摩尔％、82摩尔％、85摩尔％、88摩尔％、90摩尔％、92摩尔％、95摩尔％、98摩尔％、99摩尔％。

根据本发明的另一个实施方式，所述第一金属颗粒经由金属原子与磁珠表面的氨基之间的金属-N键以及静电吸附作用连接于MB-NH₂。

根据本发明的另一个实施方式，式(I)的化合物以及任选的其氧化衍生物通过其-NH₂基团与金属原子之间的金属-N键以及静电吸附作用连接于第一金属颗粒。

在以下的一些具体实施方式中，为了简化期间，以ABEI和金为例来描述本发明的复合材料及其制备过程，但是此处仅仅是示例的表述，本发明的保护范围不限于此。

在下文中，将与第一技术颗粒(以金颗粒为例)和式(I)所示的化合物(例如ABEI)连接之后的MB-NH₂写作“MAA(即[email protected]的首字母缩写)”。

根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料还包含第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合。优选地，可以在如上所述将第一金属颗粒连接于MB-NH₂之后，再加入第二金属阳离子，使得第二金属阳离子基于配位键和静电吸附作用连接于MAA。在本发明中，当第二金属为钴离子的时候，将其写作MAA/Co²⁺。

根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与所述氨基官能化磁珠的重量比为10:1至1:1，例如为9:1至1.2:1，或者为8:1至1.4:1，或者为7:1至1.5:1，或者为6:1至1.6:1，或者为5:1至1.8:1，或者为4:1至1.8:1，或者为3:1至2:1，或者为2.5:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。此处所述的重量比是第一金属颗粒的离子型前体的固体重量与所述氨基官能化磁珠的固体重量之比。

根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与所述第二金属阳离子的摩尔比为50:1至1:1，例如可以为45:1至2:1，或者为40:1至3:1，或者为35:1至4:1，或者为30:1至5:1，或者为25:1至8:1，或者为20:1至10:1，或者为15:1至12:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内，以上所述的摩尔比表示所述化学发光复合材料中的第一金属颗粒的离子型前体包含的第一金属的摩尔量与第二金属阳离子的摩尔量之比。根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与式(I)所示的发光体以及任选的其氧化衍生物的摩尔比为10:1至1:5，例如为9:1至1:4，或者为8:1至1:3，或者为7:1至1:2，或者为6:1至1:1，或者为5:1至2:1，或者为4:1至3.75:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内，以上所述的摩尔比表示所述化学发光复合材料中的第一金属颗粒的离子型前体包含的第一金属的摩尔量与“式(I)所示的发光体以及任选的其氧化衍生物的总摩尔量”之比。

根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料在使用之前还连接一种特异性抗体蛋白。所述抗体蛋白根据作为表征对象的抗原蛋白的具体种类进行选择，例如所述抗体蛋白可以包括以下的抗体蛋白，但不限于这些抗体：新型冠状病毒S1抗体、新型冠状病毒RBD抗体、新型冠状病毒N蛋白抗体、心肌肌钙蛋白抗体、和肽素抗体、心脏型脂肪酸结合蛋白抗体、α-甲胎蛋白抗体、前列腺癌标志物抗体、肝癌标志物抗体、结/直肠癌标志物抗体、胰腺癌标志物抗体、胃癌标志物抗体、食道癌标志物抗体、肺癌标志物抗体、乳腺癌标志物抗体、卵巢癌标志物抗体、子宫癌标志物抗体、甲亢标志物抗体、肝炎标志物抗体、贫血标志物抗体、糖代谢标志物抗体、骨代谢标志物抗体。根据本发明的一个实施方式，所述抗体蛋白经由所述第一金属颗粒、所述第二金属阳离子、式(I)所示的化合物(以及任选的，其氧化衍生物)的氨基和磁珠表面氨基中的至少一种连接于所述MAA/Co²⁺。根据本发明的一个优选的实施方式，作为表征对象的抗原是SARS-CoV-2的N蛋白，而相应的抗体蛋白是N-抗体。通过使得所述抗体蛋白与本发明的化学发光复合材料接触，使得功能蛋白连接至所述化学发光复合材料。优选地，以连接抗体蛋白之前所述化学发光复合材料的总重量为100重量％计，例如根据本发明的一个优选的实施方式，以所述MAA/Co²⁺的总重量为100重量％计，所述抗体蛋白的重量比例为0.1-10重量％，例如0.5-9重量％，或者1-8.5重量％，或者1.5-6重量％，或者1.6-5重量％，或者1.8-4重量％，或者2-3重量％，或者2.1-2.5重量％，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。

根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料在使用之前还任选地连接一种或多种其他的功能蛋白。在本文中所述的“功能蛋白”是指出于一个或多个特定的目的结合入本发明的化学发光复合材料中的任意的蛋白，该蛋白不同于以上所述的抗原蛋白和抗体蛋白，所述目的可以包括例如用来对化学发光复合材料的活性位进行封闭(即作为封闭剂)或保护，对所述化学发光复合材料的稳定性进行调节等等。在本领域中已知有很多具有上述功能的各种蛋白，例如：血清、BSA、脱脂奶粉、酪蛋白等。根据本发明的一个实施方式，所述功能蛋白经由所述第一金属颗粒、所述第二金属阳离子、式(I)所示的化合物(以及任选的其氧化衍生物)中的氨基和磁珠表面氨基中的至少一种连接于所述MAA/Co²⁺。根据本发明的一个优选的实施方式，作为表征对象的抗原是SARS-CoV-2的N蛋白，而相应的抗体蛋白是N-抗体，而所述功能蛋白是BSA(牛血清白蛋白)。根据本发明的一个优选的实施方式，通过将所述功能蛋白与本发明的化学发光复合材料接触，使得功能蛋白连接至所述化学发光复合材料。优选地，以连接功能蛋白和抗体蛋白之前所述化学发光复合材料的总重量为100重量％计，例如以所述MAA/Co²⁺的总重量作为100重量％计，所述功能蛋白的重量比例为0.01-9重量％，例如0.02-8重量％，或者0.05-7重量％，或者0.06-6重量％，或者0.07-5重量％，或者0.08-4重量％，或者0.09-3重量％，或者1-2重量％，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，本发明的化学发光复合材料除了包含所述的组分(i)-(iv)、抗体蛋白和任选的功能蛋白以外，不含其他的组分，例如不含其他的标记组分。优选地，根据本发明的一个实施方式，其中仅包含一种所述抗体蛋白，并且可能任选地包含功能蛋白，而不需要使用第二种抗体。由此可以实现一些配对二抗难以获得的目标物检测，省去了用标记物、标记试剂、标记官能团等组分标记二抗的过程，也减少了标记、孵育、洗涤等反应步骤，降低了成本。根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料包含所述的组分(i)-(iv)、一种所述抗体蛋白，以及任选的功能蛋白，但是除此之外，不含其他常规的标记物、标记试剂、标记官能团，所述常规的标记物、标记试剂、标记官能团等是本领域技术人员熟知的，例如可以包括其他的发光分子、酶、纳米材料、催化剂等。

图1显示了根据本发明一个实施方式用来合成本发明的化学发光复合材料的方法的示意图。如图1所示，该合成方法的过程包括以下步骤：(a)将氨基官能化磁珠(MB-NH₂)、第一金属颗粒的离子型前体(例如HAuCl₄)与式(I)所示的发光体(例如ABEI)混合，使得所述第一金属颗粒的离子型前体被还原生成0价的第一金属颗粒(在图1的实施方式中为金颗粒)并且其与所述磁珠和/或发光体结合，形成图1所示的[email protected](MAA)；(b)然后添加所述第二金属阳离子(例如CoCl₂)，使其与所述磁珠和/或发光体结合，形成图1所示的[email protected]/Co²⁺(MAA/Co²⁺)。此处有一部分ABEI作为合成所述第一金属颗粒的还原剂，同时自身的基团被氧化形成相应的二羧酯基。

在图1所示的实施方式中还包括以下步骤：(c)向步骤(b)制得的MAA/Co²⁺中添加针对测试目标抗原的特异性抗体蛋白(例如N-抗体)，使得该特异性抗体蛋白连接至所述MAA/Co²⁺；(d)向步骤(c)制得的产物中添加其他功能蛋白(例如BSA，其发挥封闭剂的功能)，使得该功能蛋白连接至所述MAA/Co²⁺。

在上述步骤(c)和(d)之后，使得连接有N-抗体和BSA的MAA/Co²⁺与作为检测对象的SARS-CoV-2的N蛋白相结合，该结合体作为最终检测的对象，其可以在特定条件下(例如添加了H₂O₂的条件下)进行化学发光，基于其发光信号来检测SARS-CoV-2的N蛋白。

本发明还提供了基于化学发光检测，使用本发明的化学发光复合材料对抗原蛋白，例如SARS-CoV-2的N蛋白进行检测的方法。本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用来通过化学发光检测抗原。所述抗原选自但不限于以下这些抗原：新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S1、新型冠状病毒RBD、心肌肌钙蛋白、和肽素、心脏型脂肪酸结合蛋白、α-甲胎蛋白、前列腺癌标志物、肝癌标志物、结/直肠癌标志物、胰腺癌标志物、胃癌标志物、食道癌标志物、肺癌标志物、乳腺癌标志物、卵巢癌标志物、子宫癌标志物、甲亢标志物、肝炎标志物、贫血标志物、糖代谢标志物、骨代谢标志物，尤其是可以用来检测SARS-CoV-2的N蛋白。根据本发明的一个实施方式，所述试剂盒包含本发明的化学发光复合材料。

本发明还提供了本发明的化学发光复合材料在制备试剂盒中的用途，所示试剂盒用来通过化学发光检测抗原，例如用来检测SARS-CoV-2的N蛋白。

实施例

为了更好地理解本发明，下面结合实施例以及附图对本发明进一步说明。以下实施例只用于对本发明进行进一步的阐明，不能理解为对本发明内容的限制，任何根据本发明的发明思路和技术方案作出一些非本质的改进和调整，都将涵盖在本发明的保护范围之内。

若无特别说明，以下实施例中使用的试剂均为分析纯。

在以下实施例中，如果记载了“按照与上述某实施例相同的步骤进行操作，区别仅在于……”，则表示采用随后记载的工艺条件和步骤，而其他没有提及的工艺条件和步骤按照引用的之前的实施例的记载。

试剂和仪器

以下实施例中所使用到的化学试剂和测试使用化学仪器如表1和表2所示。

表1实施例中使用到的化学试剂

检测技术：

使用Talos F200X电子显微镜(FEI,USA)拍摄制得的产物的TEM图像。使用Optima7300DV等离子原子发射分光光度计(PerkinElmer,USA)，通过ICP-AES检测制得的产物中Co²⁺的浓度。使用Thermo ESCALAB 250Xi电子分光光度计(VG Scientific,EastGrinstead,U.K.)，使用Al Kα辐射作为X射线源进行XPS测试。使用ζ电势分析仪(Nano ZS90Zetasizer,Malvern Instruments,Malvern,U.K.)测量材料的ζ电势。使用振动样品磁强计(Quantum Design Inc,USA)获得MAA/Co²⁺的磁滞曲线。使用centro LB960微盘式冷光仪(Berthold,Germany)检测化学发光。

实施例1：合成MAA/Co²⁺

在该实施例1中，通过两步法合成MAA/Co²⁺。首先在第一步中合成MAA，具体来说，称取1毫克MB-NH₂，用乙醇洗涤两次，然后将其分散在0.5毫升乙醇。然后将1.5毫升5mM的HAuCl₄水溶液加入其中，得到混合物。在振摇条件下将0.5毫升4mM的ABEI溶液(pH＝13.0)加入上述溶液中，在振荡器(该振荡器具有高、中、低三档功率)上使用最大功率剧烈振荡2小时,将该混合物转移到垂直混合器中，使得反应在室温下持续进行过夜。然后用超纯水对由此制得的MAA洗涤两次,然后将得到的MAA分散在1毫升超纯水中，在4℃条件下储存用于进一步的使用。

在第二步中，将0.1毫升各种浓度(0.1、1、5、10、100mM，其发光性能表征参见以下实施例4)的Co²⁺水溶液加入上述分散在1毫升超纯水中的MAA中，在室温下搅拌3小时。然后将所得的悬浮液磁性分离,用水洗涤两次，分散在1毫升水中。由此制得的MAA/Co²⁺在4℃的条件下进行储存。

实施例2：制备用于检测SARS-CoV-2的N蛋白的样品。

在该实施例2中，使用以上实施例1制得的MAA/Co²⁺与抗体蛋白和封闭蛋白结合，制备用于检测SARS-CoV-2的N蛋白的样品。具体来说，将25μL的1mg/mL兔抗体-N蛋白多克隆抗体(N-Ab)加入以上合成实施例1制得的分散在1毫升水中的MAA/Co²⁺，在室温下反应0.5小时，然后进行磁性分离，然后加入0.01M PBS缓冲液(pH＝7.4),将由此制得的MAA/Co²⁺/N-Ab分散在1％的BSA溶液中，用于封闭，再反应0.5小时。接下来将制得的MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA磁性分离,用PBS洗涤,溶解在1.5mL的PBS中，在4℃储存。

在进行对于SARS-CoV-2的N蛋白的化学发光检测的时候，将200μL不同浓度(1.0×10^-8-1.0×10^-13g/mL)的所述N蛋白加入200μL的MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA悬浮液中，在温和振摇条件下，在37℃培养20分钟，然后通过磁性分离进行洗涤，分散在200μL的PBS溶液中备用。

实施例3：产物的表征以及化学发光性能的表征

首先对实施例1的原料、中间产物和产物进行TEM、XPS、ζ电势、ICP-MS和饱和磁化强度的表征。

图2A和2I显示了实施例1的MB-NH₂磁珠的TEM图像，图中显示MB-NH₂磁珠具有球形结构，非常光滑的表面，并且平均颗粒直径约为150nm左右。

图2B和2J显示了在MB-NH₂磁珠表面上连接金颗粒以及ABEI之后的TEM图像，可以看到ABEI-Au纳米颗粒良好地分散在MB-NH₂磁珠表面上，并且与ABEI结合的Au纳米颗粒的直径约为7-8nm,由此证明生成了MAA。

图2C和2D显示了添加Co²⁺之后合成得到的产物的形貌，可以看到加入Co²⁺之后，MAA/Co²⁺形貌没有明显的变化。另外图2E-2H显示了元素分析图，证明MAA表面上具有Co²⁺，由此证明实施例成功合成了MAA/Co²⁺。

图3A-3C显示了MAA的XPS谱图，图4A-4D显示了MAA/Co²⁺的XPS谱图。这些图中的结果均显示了ABEI分子设置在纳米材料表面之上，图4D显示了Co²⁺以配位形式存在于MAA/Co^{2 +}MAA/Co²⁺中。

ICP-MS表征结果显示MAA/Co²⁺中的Co元素浓度为47.2ng/mL。并且测得MB-NH₂、MAA和MAA/Co²⁺水溶液的ζ电势分别为9.89mV、-23.32mV和-9.23mV，这表明在MB-NH₂磁珠上连接ABEI-Au颗粒导致ζ电势从正变负。但是在施加Co²⁺之后，ζ电势又发生正向变化,这说明Co²⁺可能至少部分地通过静电相互作用设置在带负电荷地MAA上。另外，MAA/Co²⁺的饱和磁化度为55.98emu/g,表明其可以进行磁性分离。以上表征结果均证明成功制得了官能化的磁性材料MAA/Co²⁺。

实施例4：MAA/Co²⁺化学发光性能的表征

在该实施例4中，通过以下方式进行化学发光测试：将以上所述实施例中制备的MAA/Co²⁺各50μL以不同的浓度加入96孔板中，然后向每个孔加入50μL的浓度为1mM的H₂O₂水溶液(该溶液的pH值用0.01M的NaOH水溶液调节至12.0),同时记录每个孔中的化学发光动力学曲线。测量时间优化为10秒，时间间隔为0.1秒。

图5显示了实施例1使用各种不同的Co²⁺浓度制备的MAA/Co²⁺的化学发光性能。可以看到当Co²⁺为大约5mM的条件下实现了最高的化学发光强度。

实施例5：连接抗原之后的化学发光性能表征

通过实施例4的表征证明，本发明实施例制得的MAA/Co²⁺具有极佳的化学发光性能,因此在该实施例5中，使用相同的Co²⁺浓度5mM，按照与上文所述相同的方式表征了与不同抗体蛋白(N-Ab)、功能蛋白(BSA)和抗原蛋白(N蛋白)结合之后的化学发光性能和ζ电势，结果汇总列于图6A-6B。该实施例的化学发光可以用来在无标记的情况下进行N-蛋白的抗原免疫检测。在该实施例中，依照实施例2所述的方式连接各种蛋白。不希望受限于具体的理论，在该实施例5中，N-Ab抗体中游离的氨基端及巯基端通过Au-N键、Au-S键和疏水相互作用结合于MAA/Co²⁺，以形成MAA/Co²⁺/N-Ab；BSA同样通过其中游离的氨基端及巯基端通过Au-N键、Au-S键和疏水相互作用结合于MAA/Co²⁺/N-Ab，用来封闭非特异性结合位点，形成MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA。此处形成的MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA可以作为基于化学发光检测SARS-CoV-2抗原N蛋白的试剂。通过磁性分离，用PBS进行洗涤。在上述连接各种抗体蛋白和封闭剂蛋白过程的每一步都对产物的化学发光强度和ζ电势进行检测，结果汇总列于图6A-6B。图6A显示了MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA/N蛋白有效地发生了化学发光现象，可以用于免疫检测，而图6B的ζ电势结果则证明了上述每一步都成功地连接。

实施例6：金颗粒用量对化学发光性能的影响

本实施例研究了金颗粒用量对化学发光性能的影响。具体来说，在本实施例6中重复实施例1的步骤两次，按照实施例1所述的步骤合成了MAA，区别仅在于在振荡器上振荡2小时的过程中分别使用“中”档位和“低”档位。图7A显示了使用“高”振荡档位(即实施例1)制备的MAA的TEM图像，图7B显示了使用“中”振荡档位制备的MAA的TEM图像，图7C显示了使用“低”振荡档位制备的MAA的TEM图像，图7D显示了原始的MB-NH₂的TEM图像。根据这些TEM图像可以看到，图7A中金纳米颗粒的数量约为135，图7B中金纳米颗粒的数量约为34，图7C中金纳米颗粒的数量约为16，图7D中金纳米颗粒的数量则为零。

图8则显示了上述四种材料各自体现出的化学发光强度。

由此可以确定，通过改变振荡频率,随着振荡频率提高，被ABEI还原的Au纳米颗粒在磁珠表面上的量相应地增加，其各自实现的化学发光强度也随之提高。

实施例7：工艺条件对化学发光性能的影响

本实施例研究了包括H₂O₂溶液的pH值、H₂O₂溶液的浓度以及N-蛋白培育时间对化学发光性能的影响。

在本实施例中，按照实施例1、实施例2和实施例3所述的方式制备MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA/N蛋白样品(Co²⁺浓度为5mM，N蛋白浓度1ng/mL)，区别仅在于单独改变H₂O₂溶液的pH值、H₂O₂溶液的浓度或N-蛋白培育时间，在这些条件下检测MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA/N蛋白样品的发光强度,结果汇总列于图9A-9C。从图9A可以看到，H₂O₂溶液的pH值在12左右可以得到最佳的化学发光强度，H₂O₂溶液的浓度在1mM左右可以得到最佳的化学发光强度。另外如图9C所示,N蛋白的培育时间在20分钟左右为最佳。

实施例8：检测下限和选择性的研究

在本实施例中，重复以上实施例7的步骤，但是采用不同的N蛋白浓度，在以上实施例7确定的最优化条件下，研究N蛋白浓度对数值与化学发光信号强度的关系，如图10所示，在N蛋白浓度为0.1pg/mL至10ng/mL的范围内，二者之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为ΔI＝-16287.08-11869.27logC(R²＝0.985,n＝3)。本发明用来检测N蛋白的检测下限为69fg/mL(S/N＝3),比下表所示的其他现有技术检测方法要低得多。因此本发明开发了一种无需标记的免疫检测技术，其避免了复杂的标记步骤,不仅有极佳的检测效果，能够在很宽的检测范围内进行检测，具有极低的检测下限，非常灵敏，而且检测步骤简便，成本极低。

表2.本发明的化学发光技术与现有技术已知的其他N蛋白检测技术的比较

对比试验1-6

另外，申请人同样使用上述最优化的表征条件实施了对比试验1-6，区别仅在于，对比试验1是空白实验，对比试验2-5使用一些干扰蛋白IgM、S1、RBD和IgG以相同的步骤表征了化学发光强度，但是所有干扰蛋白的浓度分别为1ng/mL,比N蛋白的浓度(0.1ng/mL)高一个数量级,还有一个对比试验6包含所有干扰蛋白的混合物。实验结果见图11，其中的N蛋白实验是使用0.1ng/mL N蛋白进行表征。从该图中可以看到干扰蛋白IgM、S1、RBD、IgG的发光强度都与空白实验相近,混合物的发光强度则与N蛋白实验类似，由此证明本发明的技术对N蛋白具有很高的选择性。另外如图12所示，对于本发明的技术，检测到在一个月的时间内，相邻两天之间的相对标准偏差(RSD)为2.9％,这说明本发明的技术在用于检测N蛋白的时候具有优异的重现性和可靠性。

实施例9.实际样品中的测试

在该实施例中，使用本发明的MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA样品，以标准曲线法在临床应用中检测人血清和唾液中的N蛋白。健康人血清样品得自南京第一人民医院，保存于-20℃的条件下。从禁水禁食2小时的人员对象获得健康人唾液样本。这些样品分别离心10分钟，弃去沉淀物,上清液在-20℃储存备用。在进行测量之前，所有的血清样品和唾液样品都用0.01M的PBS(pH 7.4)稀释一百倍，向其中加入不同浓度的(0.5,1,10,50pg/mL)N蛋白。如表3所示,本发明的技术用于实际样品的化学发光免疫测试的时候可以实现优异的检测结果。

表3.人血清和唾液样品中N蛋白的定量检测

实施例10.对康复后的患者血清的实验

在该实施例中,从志愿者处收集健康人员的血清和康复后的患者血清，使用本发明的MAA/Co²⁺/N-Ab/BSA样品进行检测。血清在使用前用0.01M的PBS(pH 7.4)稀释一百倍，测试结果见图13。从图13可以看到，康复后患者的化学发光强度略低，这是因为康复后的患者体内仍然存在少量的SARS-CoV-2N蛋白。该实施例的结果证明本发明的检测技术能够区别正常人和康复后患者的样品。

综上所述，本发明开了一种针对抗原的全新免疫检测技术，其能够实现对SARS-CoV-2抗原的快速、方便、高效、高选择性、灵敏、低成本的检测，并且无需标记过程。