一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法

文档序号：1655445 发布日期：2019-12-27 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法 (Method for separating protopanoxadiol by using foam extraction and macroporous resin purification ) 是由卢文玉赵方龙南伟华张传波于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法,步骤：(1)将能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株置于发酵罐A中,通空气,发酵,有泡沫产生；(2)将泡沫转移至无菌容器B中,泡破裂,原人参二醇附着在无菌容器B的器壁上,而泡沫携带的发酵液和菌体聚集在无菌容器B的底部,再移到发酵罐A中,继续发酵；每间隔4-8h,停止发酵液和菌体的转移,向无菌容器B内通入乙醇水溶液,将无菌容器B器壁上附着的原人参二醇溶解得原人参二醇溶液；(3)将原人参二醇溶液经大孔树脂提纯。本发明的方法能高效的将原人参二醇从泡沫中分离出来,实现原人参二醇的提取。提取效率高,纯度高。(The invention discloses a method for separating protopanoxadiol by utilizing foam extraction and macroporous resin purification, which comprises the following steps: (1) putting a saccharomyces cerevisiae strain capable of synthesizing protopanaxadiol into a fermentation tank A, introducing air, and fermenting to generate foam; (2) transferring the foam into a sterile container B, breaking the foam, attaching protopanaxadiol on the wall of the sterile container B, collecting the fermentation liquid and thalli carried by the foam at the bottom of the sterile container B, transferring the fermentation liquid and thalli into a fermentation tank A, and continuing to ferment; stopping transferring the fermentation liquor and thallus every 4-8h, introducing ethanol water solution into the sterile container B, and dissolving the protopanaxadiol attached to the wall of the sterile container B to obtain protopanaxadiol solution; (3) purifying the protopanaxadiol solution with macroporous resin. The method can efficiently separate the protopanoxadiol from the foam, and realizes the extraction of the protopanoxadiol. High extraction efficiency and high purity.)

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法。

背景技术

原人参二醇是人参中的三萜皂苷元中的一种，是达玛烷型皂苷的前体。其分子由六个异戊二烯单位聚合而成，相对分子质量460.743。现代医学研究表明，三萜皂苷元这类物质，特别是原人参二醇(PPD)具有较强的抗癌活性，可有效杀伤、杀死肿瘤细胞。而且，它对人体不存在毒副作用，还能增强机体免疫力，与其他抗癌药物混合使用可有效增强抗癌疗效。除此之外，PPD在冠心病、抑郁症治疗和学习能力等方面具有非常出色的疗效和效果。目前，国内外多家公司正在积极开发以PPD为主要成分的药物，多种新产品已进入市场或临床试验阶段。海南亚洲制药研制的抗肿瘤药物“益今生”胶囊(主要成分为PPD和人参皂苷Rh2)，作为国家一类抗癌辅助药，目前在国内已完成临床3期试验；上海中药创新研究中心研制的抗抑郁国家1类新药“优欣定”胶囊，正在进行3期临床研究，该药含有93％以上的PPD成分。

三萜皂苷元的传统植物提取方式受限于原料成本高、农药残留和环保等因素，生产效率较低。近年来，采用合成生物学的方法，利用微生物发酵生产三萜皂苷元得了一定进展。例如，张学礼等将原人参二醇合成途径整合进入酿酒酵母细胞，并通过代谢工程优化、发酵优化使原人参二醇产量达到1.2g/L。

本课题组通过优化该途径关键酶、工程化细胞抗逆特性提高细胞活力，使原人参二醇的产量提高到4.2g/L。上述研究使得微生物发酵生产原人参二醇成为可能，然而目前针对原人参二醇发酵后提取的研究还未有报道。在PPD发酵过程中，98％以上的PPD会分泌到细胞外，形成大量泡沫，这使得发酵过程难以控制。另外，这些泡沫吸附于罐壁，形成大量固体物质，也增加了产物后提取的难度。目前还未有关于发酵法生产原人参二醇后分离工艺研究的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤：

(1)将能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株置于发酵罐A中，通空气，发酵，有含有原人参二醇的泡沫产生；

(2)将所述泡沫通过发酵罐A上的排气孔转移至无菌容器B中，当泡沫的泡破裂时，原人参二醇附着在无菌容器B的器壁上，而泡沫携带的发酵液和菌体聚集在无菌容器B的底部，再转移到发酵罐A中，继续发酵；每间隔4-8h，停止将无菌容器B的底部发酵液和菌体的转移，向无菌容器B内通入乙醇水溶液，将无菌容器B器壁上附着的原人参二醇溶解，得原人参二醇溶液；

(3)将原人参二醇溶液过大孔树脂柱C，用乙醇或乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，蒸发，得原人参二醇。

优选的，步骤(1)为：将能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株置于发酵罐A中；在0-12h，以2L/min·L通空气，发酵；在12-24h时，以2-4L/min·L通空气，发酵；在24-48h时，以2-4L/min·L通空气，发酵；在48-60h时，以3-6L/min·L通空气，发酵；在60-108h时，以3-6L/min·L通空气，发酵；在108-120h时，以2-6L/min·L通空气，发酵；在120-144h时，以2L/min·L通空气，发酵；有含有原人参二醇的泡沫产生。

步骤(2)所述乙醇水溶液的体积浓度为40％-80％。

大孔树脂为Diaion HP-20，HDP-100或X-5。

步骤(3)所述乙醇水溶液的体积浓度为70％-99％。

本发明的优点：

实验证明，本发明的方法能高效的将属于三萜皂苷元的原人参二醇从发酵液的泡沫中分离出来，原人参二醇的转移效率达到74.8％及以上，实现原人参二醇的提取。通过大孔树脂纯化，可获得纯度为74.4％及以上的原人参二醇。

附图说明

图1为本发明的方法示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株是以原人参二醇酿酒酵母工程菌W3a-ssPy为例，但并不对本发明进行限定，其它能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株也可以用于本发明。

实施例1

菌W3a-HU的构建：

W3a-HU是将W3a的ura3和his3标记基因通过质粒pSH63回收得到的。

菌株W3a来自于已授权专利ZL201410735927.X，菌株的具体构建过程参考该专利。

在W3a菌株的基础上，为了提高酿酒酵母的抗逆特性，表达了SSD1和YBP1两个基因，这两个基因均来自于酿酒酵母BY4741(美国， Number:201388)。

在W3a菌株中，URA3和HIS3标记已经被利用，但这两个标记两侧含有两个loxP位点。这两个标记基因首先用表达Cre蛋白的质粒pSH63(购自生物风)敲除，生成W3a-HU菌株。

具体操作采用醋酸锂转化，醋酸锂转化方法为：出发酿酒酵母W3a在2mL YPD培养基中培养18小时后，以10％的接种比例接种到新的YPD培养基中，继续培养4小时。然后低速4,000转/min于常温下离心2min收集细胞，用无菌水冲洗菌体后再次离心收集菌体，弃去上清。然后将1mL 100mM在4℃预冷的醋酸锂加入菌体，室温下处理5min后5,000转/min常温下离心收集菌体，酵母感受态细胞制备完毕。转化混合体系包括：

1、240μL PEG(50％W/V)。

2、36μL 1.0M醋酸锂。

3、10μLss-DNA。

4、各质粒或转化片段分别200ng。

5、无菌水(补齐至360μL)。

将上述各项逐步加入到有感受态细胞的离心管中，离心后震荡1min混匀，在42℃水浴条件下孵育30min。然后低转速常温下离心2min，移去上清后加入1mL YPD(半乳糖作碳源)培养基复苏。筛选培养条件为30℃，培养60h以上。用不含色氨酸的合成培养基筛选单菌落，在不含尿嘧啶、组氨酸的合成培养基上不能生长，在含尿嘧啶、组氨酸的合成培养基上能生长的转化子即为基因敲除成功的转化子，将获得的转化子进行传代，在不含色氨酸的合成培养基上不能生长，在含色氨酸的合成培养基上能生长的即为质粒消失的菌W3a-HU。

合成培养基的配方为：

YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，氨基酸混合物2g/L，色氨酸0.02g/L，尿嘧啶0.02g/L，组氨酸0.02g/L，腺嘌呤0.02g/L，亮氨酸0.1g/L，PH＝5.5。

氨基酸混合物的配方为：丙氨酸2g，精氨酸2g，天冬酰胺2g，天冬氨酸2g，半胱氨酸2g，谷氨酰胺2g，谷氨酸2g，甘氨酸2g，肌醇2g，异亮氨酸2g，赖氨酸2g，对氨基苯甲酸0.2g，苯丙氨酸2g，脯氨酸2g，丝氨酸2g，苏氨酸2g，酪氨酸2g，缬氨酸2g。

实施例2

在W3a-HU菌株的基础上，高表达SSD1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)，构建菌株W3a-ss。

构建基因Pgk1p-SSD1-Adh1t基因表达盒：

以酿酒酵母BY4741基因组为模板，以序列1(SEQ ID NO.1)和序列2(SEQ ID NO.2)为引物，扩增Pgk1p启动子；以序列3(SEQ ID NO.3)和序列4(SEQ ID NO.4)为引物，扩增SSD1基因；以序列5(SEQ ID NO.5)和序列6(SEQ ID NO.6)为引物，扩增Adh1t终止子。通过融合PCR方法，将Pgk1p启动子、SSD1基因和Adh1t终止子融合成Pgk1p-SSD1-Adh1t基因表达盒。

构建同源重组的辅助片段，HIS3r-Pgk1p和Adh1t-HIS3f：

以质粒pxp320(购自Addgene)为模板，以序列7(SEQ ID NO.7)和序列8(SEQ IDNO.8)为引物，扩增HIS3r基因片段；通过融合PCR方法，将HIS3r基因片段和Pgk1p启动子融合成HIS3r-Pgk1p。

以质粒pxp320为模板，以序列9(SEQ ID NO.9)和序列10(SEQ ID NO.10)为引物，扩增HIS3f基因片段。通过融合PCR方法，将HIS3f基因片段和Adh1t终止子融合成Adh1t-HIS3f。

本发明所用PCR酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各1μL；dNTP(2.5mM)，5μL；10×Buffer，5μL；Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。

本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(2.5mM)，5μL；10×Buffer，5μL；Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、退火55℃30秒、72℃延伸1分钟(11个循环)，72℃延伸5分钟(1个循环)。

将Pgk1p-SSD1-Adh1t、HIS3r-Pgk1p和Adh1t-HIS3-f三个片段采用醋酸锂转化的方法，整合进入菌株W3a-HU，在不含组氨酸的合成培养基平板上进行筛选，菌落PCR验证后，得到转化成功的克隆子W3a-ss。

实施例3

在W3a-ss菌株的基础上，高表达YBP1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)，构建原人参二醇酿酒酵母工程菌W3a-ssPy：

构建基因Pgk1p-YBP1-Cyc1t基因表达盒(YBP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.22)：

以酿酒酵母BY4741基因组为模板，以序列11(SEQ ID NO.11)和序列12(SEQ IDNO.12)为引物，扩增Pgk1p启动子；以序列13(SEQ ID NO.13)和序列14(SEQ ID NO.14)为引物，扩增YBP1基因；以序列15(SEQ ID NO.15)和序列16(SEQ ID NO.16)为引物，扩增Cyc1t终止子。通过融合PCR方法，将Pgk1p启动子、YBP1基因和Cyc1t终止子融合成Pgk1p-YBP1-Cyc1t基因表达盒。

构建同源重组的辅助片段URA3r-Pgk1p和Cyc1t-URA3f：

以质粒Pxp218(购自addgene)为模板，以序列17(SEQ ID NO.17)和序列18(SEQ IDNO.18)为引物，扩增URA3r基因片段；通过融合PCR方法，将URA3r基因片段和Pgk1p启动子融合成URA3r-Pgk1p。

以质粒Pxp218为模板，以序列19(SEQ ID NO.19)和序列20(SEQ ID NO.20)为引物，扩增URA3f基因片段。通过融合PCR方法，将URA3f基因片段和Cyc1t终止子融合成Cyc1t-URA3f。

将Pgk1p-YBP1-Cyc1t、URA3r-Pgk1p和Cyc1t-URA3f三个片段采用醋酸锂转化的方法，整合进入菌株W3a-ss，在不含组氨酸和尿嘧啶的合成培养基平板上进行筛选，菌落PCR验证后，得到转化成功的克隆子W3a-ssPy。

实施例4

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

(1)将能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株(本实施例以实施例3构建的原人参二醇的酿酒酵母菌株W3a-ssPy为例，也可以选用其它的能合成原人参二醇的酿酒酵母菌株)置于5L发酵罐A中(见图1)通空气，有含有原人参二醇的泡沫产生；

具体步骤为：

将2LYPD培养基加入到5L的发酵罐A中。将200mL的W3a-ssPy菌株种子液(YPD在30℃下培养18h)接种到发酵罐A中。发酵温度控制在30℃，

在0-12h，以2L/min·L通空气，发酵，

在12-24h时，以4L/min·L通空气，发酵，

在24-48h时，以4L/min·L通空气，发酵，

在48-60h时，以6L/min·L通空气，发酵；

在60-108h时，以6L/min·L通空气，发酵；

在108-120h时，以6L/min·L通空气，发酵；

在120-144h时，以2L/min·L通空气，发酵；

转速设定在300-800转/min之间，DO设定高于40％。通过自动添加5M氨水来控制pH为5.5。

在发酵的26h时，初始葡萄糖及代谢产生的乙醇基本消耗完毕，此时发酵罐A中加入350mL补料液(pH＝5.5)，补料液的成分为9g/L KH₂PO₄，5.12g/L MgSO₄·7H2O，3.5g/LK₂SO₄，0.28g/L Na₂SO₄，0.5g/L腺嘌呤，0.6g/L尿嘧啶，1.2g/L赖氨酸，10mL/L微量元素溶液，12mL/L维生素溶液。通过发酵罐A的补料装置添加乙醇维持培养基中乙醇浓度在1-6g/L。微量元素溶液和维生素溶液的组分如下：

微量元素成分和比例为(/L)：EDTA 15g、ZnSO₄·7H₂O 10.2g、MnCl₂·4H₂O 0.50g、无水CuSO₄ 0.5g、CoCl₂·6H₂O 0.86g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.56g、CaCl₂·2H₂O 3.84g和FeSO₄·7H₂O 5.12g。

维生素成分和比例为(/L)：生物素0.05g、泛酸钙1g、尼克酸(烟酸)1g、肌醇25g、维生素B₁1g、盐酸吡哆醇1g和对氨基苯甲酸0.2g。

发酵过程中有含有原人参二醇的泡沫产生。

(2)将泡沫通过发酵罐A上的排气孔转移至无菌容器B中，当泡沫的泡破裂时，原人参二醇附着在无菌容器B的器壁上，而泡沫携带的发酵液和菌体聚集在无菌容器B的底部，再通过泵转移到发酵罐A中，继续发酵；每间隔4h，停止将无菌容器B的底部发酵液和菌体的转移，向无菌容器B内通入体积浓度为40％乙醇水溶液，将无菌容器B器壁上附着的原人参二醇溶解，将此溶液从无菌容器B中放出得原人参二醇溶液，该通气模式下泡沫提取的效率为98.3％；

(3)将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂Diaion HP-20)，流速设为2BV/h。用体积浓度为90％的乙醇水溶液以1BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率89.0％，纯度90.18％。

该模式下获得的最终收率为87.5％，纯度90.18％。

发酵罐A中胞外原人参二醇提取：发酵结束后，发酵罐A的罐壁上，附着有原人参二醇，用乙酸乙酯充分溶解，并用HPLC定量。

菌体中的原人参二醇提取：取2mL发酵液，在12,000转/min的条件下离心10min。弃去上清液，将细胞与0.5mL乙酸乙酯及0.25mL直径为0.5mm的玻璃珠混合，涡旋震荡10min破碎细胞，然后用超声波提取。细胞内的PPD提取过程重复4次，合并乙酸乙酯相进行HPLC分析。

HPLC测定方法：流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速1mL/min，进样量20μL。色谱分离由Elite P230II高压液相泵和色谱柱Grace Apollo C18column(4.6mm×250mm,5μm)实现，紫外检测器为Elite UV230II，检测波长为203nm。

发酵结束后，收集发酵罐A中的原人参二醇，并用HPLC定量。测定了该通气模式下泡沫提取的效率(foam separation efficiency，FEE)。

泡沫提取的效率FEE＝PPD_B/(PPD_B+PPD_A)×100％。

式中，PPD_A和PPD_B分别是发酵结束后，在A和B中收集到的PPD质量。其中，PPDtankA包含罐A中菌体中和胞外的PPD含量。

实施例5

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

具体步骤为：

将2LYPD培养基加入到5L的发酵罐A中。将200mL的W3a-ssPy菌株种子液(YPD在30℃下培养18h)接种到发酵罐A中。发酵温度控制在30℃，

在0-12h，以2L/min·L通空气，发酵，

在12-24h时，以2L/min·L通空气，发酵，

在24-48h时，以2L/min·L通空气，发酵，

在48-60h时，以3L/min·L通空气，发酵；

在60-108h时，以3L/min·L通空气，发酵；

在108-120h时，以2L/min·L通空气，发酵；

在120-144h时，以2L/min·L通空气，发酵；

转速设定在300-800转/min之间，DO设定高于40％。通过自动添加5M氨水来控制pH为5.5。

在发酵的26h时，初始葡萄糖及代谢产生的乙醇基本消耗完毕，此时发酵罐A中加入350mL补料液(pH＝5.5)，补料液的成分同实施例4。

发酵过程中有含有原人参二醇的泡沫产生。

(2)将泡沫通过发酵罐A上的排气孔转移至无菌容器B中，当泡沫的泡破裂时，原人参二醇附着在无菌容器B的器壁上，而泡沫携带的发酵液和菌体聚集在无菌容器B的底部，再通过泵转移到发酵罐A中，继续发酵；每间隔8h，停止将无菌容器B的底部发酵液和菌体的转移，向无菌容器B内通入体积浓度为60％乙醇水溶液，将无菌容器B器壁上附着的原人参二醇溶解，将此溶液从无菌容器B中放出得原人参二醇溶液，该通气模式下泡沫提取的效率为74.8％；

(3)将原人参二醇溶液过Diaion HP-20型大孔树脂柱C，用体积浓度为80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，蒸发，得原人参二醇。

将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂Diaion HP-20)，流速设为4BV/h。用体积浓度为80％的乙醇水溶液以2BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率86.3％，纯度90.4％。

该模式下获得的最终收率为64.6％，纯度90.4％。

实施例6

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

具体步骤为：

将2LYPD培养基加入到5L的发酵罐A中。将200mL的W3a-ssPy菌株种子液(YPD在30℃下培养18h)接种到发酵罐A中。发酵温度控制在30℃，

在0-12h，以2L/min·L通空气，发酵，

在12-24h时，以3L/min·L通空气，发酵，

在24-48h时，以3L/min·L通空气，发酵，

在48-60h时，以5L/min·L通空气，发酵；

在60-108h时，以5L/min·L通空气，发酵；

在108-120h时，以5L/min·L通空气，发酵；

在120-144h时，以2L/min·L通空气，发酵；

转速设定在300-800转/min之间，DO设定高于40％。通过自动添加5M氨水来控制pH为5.5。

在发酵的26h时，初始葡萄糖及代谢产生的乙醇基本消耗完毕，此时发酵罐A中加入350mL补料液(pH＝5.5)，补料液的成分同实施例2。

发酵过程中有含有原人参二醇的泡沫产生。

(2)将泡沫通过发酵罐A上的排气孔转移至无菌容器B中，当泡沫的泡破裂时，原人参二醇附着在无菌容器B的器壁上，而泡沫携带的发酵液和菌体聚集在无菌容器B的底部，再通过泵转移到发酵罐A中，继续发酵；每间隔6h，停止将无菌容器B的底部发酵液和菌体的转移，向无菌容器B内通入体积浓度为80％乙醇水溶液，将无菌容器B器壁上附着的原人参二醇溶解，将此溶液从无菌容器B中放出得原人参二醇溶液，该通气模式下泡沫提取的效率为96.1％；

(3)将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂Diaion HP-20)，流速设为3BV/h。用无水乙醇以2BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率49.1％，纯度90.23％。

该模式下获得的最终收率为47.2％，纯度90.23％。

实施例7

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

(1)-(2)同实施例2的(1)-(2)；

(3)将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂Diaion HP-20)，流速设为6BV/h。用体积浓度为70％的乙醇水溶液以3BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率49.6％，纯度93.1％。

该模式下获得的最终收率为48.8％，纯度93.1％。

实施例8

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

(1)-(2)同实施例2的(1)-(2)；

(3)将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂HDP-100)，流速设为4BV/h。用体积浓度为99％乙醇水溶液以2BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率73.4％，纯度74.4％。

该模式下获得的最终收率为72.2％，纯度74.4％。

实施例9

一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法，包括如下步骤:

(1)-(2)同实施例2的(1)-(2)；

(3)将得到的原人参二醇溶液经过0.45μm的尼龙膜过滤。得到的过滤液以恒速流过1.5×30cm的层析柱(装有20mL预处理的大孔树脂X-5)，流速设为3BV/h。用体积浓度为90％乙醇水溶液以2BV/h的流速流过层析柱，PPD洗脱液每5mL收集一批，PPD产品通过旋转蒸发获得，其含量用HPLC测定。

获得原人参二醇的收率83.0％，纯度88.6％。

该模式下获得的最终收率为81.6％，纯度88.6％。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种利用泡沫提取和大孔树脂纯化分离原人参二醇的方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA