阅读说明：本技术 一种鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株、其制备方法及用途 (Chicken source turkey tissue trichomonas passaged attenuated strain, preparation method and application thereof ) 是由 许金俊 孔令明 戎杰 陈乔光 王子静 禚振男 郭平 曲昌宝 刘丹丹 侯照峰 陶建 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域一种鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株、其制备方法及用途,提供的鸡源火鸡组织滴虫传代人工致弱株A162具有良好的安全性和免疫原性,其由分离自鸡群的虫株经传代致弱、冻存再经虫株复苏,获得的候选活疫苗成本低,使用方便,使用后无药物残留,不产生耐药性,不会对环境造成污染,免疫原性好,使用安全,能有效抵抗105个强毒虫体的感染。相比火鸡来源虫株所制备的疫苗,该疫苗对鸡群的组织滴虫病的预防更为科学和可靠,有望成为药物控制鸡群组织滴虫病的替代手段,从而有效克服该病防治目前面临的巨大瓶颈和困境。(The chicken source turkey tissue infusorium subculture artificial attenuated strain A162 has good safety and immunogenicity, and is prepared by carrying out successive attenuation on insect strains separated from chicken flocks, freezing and then reviving the insect strains. Compared with the vaccine prepared from the turkey source insect strain, the vaccine is more scientific and reliable in preventing the chicken histomoniasis, and is expected to become a substitute means for controlling the chicken histomoniasis by medicaments, so that huge bottlenecks and difficulties in preventing and treating the chicken histomoniasis are effectively overcome.)

一种鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种预防鸡组织滴虫病的鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株及其制备方法及应用。

背景技术

组织滴虫病(Histomonosis)又称盲肠肝炎(Infectious enterohepatitis)，是由火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis,H.meleagridis)引起的鸡形目禽类的一种原虫病，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征；因发病后期病禽会出现血液循环障碍，导致头部发紫，又被称之为“黑头病”(Blackhead)。该病以侵害火鸡为主，发病率和死亡率可高达100％，呈世界性分布，在欧美等饲养火鸡的主要国家和地区流行非常严重和普遍，对火鸡养殖业危害巨大。国内虽然火鸡饲养量不大，禽群特别是鸡群中组织滴虫病的流行也非常严重，据本课题组对2012年1月-2013年12月两年间的扬州大学动物医院门诊部登记家禽病例的统计分析，组织滴虫病病例占就诊家禽病例总数的13.3％，位于该动物医院群发病门诊病例的第一位；对有详细记录的69例组织滴虫病例资料的统计分析后发现，家禽中以当地草鸡最为易感，其病例占到总病例数的88.4％，其次是江苏地区的地方品种三黄鸡，占总病例数的8.7％，白羽肉鸡、笼养蛋鸡和特种禽类较少；该病主要发生于放养和圈养的禽类，占总病例数的98.6％，网上平养和笼养禽类的发病比例较低；发病鸡群中，发病率在1.6％-100％之间，平均27.4％，60.9％的病例死亡率10％以下，最高可达40％以上。尽管易感性稍差于火鸡，但由于外界环境中虫体和各种传播媒介的广泛存在，加上近年来国内家禽规模化生态圈养和放养等健康养殖技术的示范应用和推广，可以预见，组织滴虫病在禽群特别是鸡群中的流行将越来越严重，危害也将越来越大。

多年以来，化学药物是防治组织滴虫病以及其他寄生虫病的主要手段，并且发挥了巨大的作用。许多化学药物曾被用于该病的防治，其中应用较多的药物有五价砷类的硝基苯胂酸和硝基咪唑类的二甲硝咪唑。这些药物广泛应用后虫体产生的抗药性目前尚不明显，但仍然存在潜在的毒性和致癌性，残留在肉、蛋中对人体会造成一定的危害。目前，欧盟已完全禁用所有对组织滴虫病具有疗效的化学药物(CEC，1995，2002)，美国已禁止使用除硝基苯胂酸以外的其他化学药物，我国农业部第193号公告中也将硝基咪唑类药物列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，这也是造成该病目前流行严重的主要原因。近十多年来，利用天然植物提取物替代化学药物成为了组织滴虫病药物防治研究的一个热点。然而，尽管少部分植物提取物已被证实对虫体的体外繁殖具有一定的抑制作用，但迄今相关报道结果均显示植物提取物对自然或人工感染的组织滴虫病疗效甚微。综上所述，采用化学药物和植物提取物控制组织滴虫病均不是理想的方法和手段，该病的防治目前已经陷入巨大的困境，急需开拓出安全、高效、方便的防治新策略和新途径。

随着公众对公共卫生关注程度的提高以及人们对绿色食品的需求不断扩大，动物寄生虫病的传统的化学药物防治方法受到了严重挑战，药物残留与药物污染问题已成为限制药物使用和开发的重要因素，研制疫苗成为目前寄生虫病防控主要研究方向和发展趋势。寄生虫是比细菌与病毒更复杂的真核生物，有着复杂的生活史，绝大多数寄生虫不能在人工条件下离开宿主培养，寄生虫抗原的复杂、易变异、伪装、表面抗原脱落与更新，往往也使宿主难以产生保护性免疫应答。因此，寄生虫疫苗不像针对细菌与病毒那样容易成功。正是由于寄生虫本身所具备的的独特的免疫学特性，所以相比其他类型的疫苗来看，能模仿自然感染并刺激机体产生有效免疫应答且安全可靠的致弱活疫苗占有绝对优势，是目前寄生虫疫苗研制的主攻方向，而通过特殊动物传代或在体外培养使毒力降低，则是目前致弱活疫苗研究的主要发展趋势。

就火鸡组织滴虫而言，禽类主要通过食入携带虫体的异刺线虫卵、多种携带虫卵的传播媒介或泄殖腔与病禽***物接触后感染。虫体进入盲肠组织内后采用二***法繁殖，并通过门静脉血流进入肝脏繁殖，破坏肝脏和盲肠组织，导致肝脏和盲肠发生炎症和坏死。现已证实，虫体感染后激发的保护性免疫与鸡艾美球虫类似，以细胞免疫为主，体液免疫作用很小。采用经培养后灭活的虫体抗原免疫火鸡，或者给火鸡直接注射高剂量的IgG，虽然都能导致血清中较高IgG水平的产生，但均不能提供火鸡以有效的免疫保护。因此，研制能激发细胞免疫且安全的致弱活疫苗是该病免疫预防的唯一途径。寄生虫体外致弱的方法很多，通过特殊动物传代或在体外连续培养使毒力降低是最为常用的致弱方法。近年来国外学者Liebhart、Sulejmanovic和Nguyen等将火鸡来源的火鸡组织滴虫体外连续培养传代或通过鸡体内连续传代后，其毒力显著降低，且对火鸡和鸡安全无副作用，免疫后能有效抵抗强毒株的感染，初步证实了利用致弱活疫苗预防组织滴虫病切实可行。

但是，现有的应用于致弱研制疫苗的火鸡组织滴虫都是分离自火鸡群，而非鸡群，而不同品种禽类对火鸡组织滴虫的易感性以及不同品种来源的虫株的致病性和免疫原性均存在一定的差异，所以有必要采用分离自鸡群的虫株制备致弱疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离自发病鸡群的火鸡组织滴虫致弱株及其制备方法、用途，旨在解决火鸡组织滴虫野外株致病力较强，不适合直接用于制备疫苗以及现有火鸡株与鸡群不匹配的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株的制备方法，包括如下步骤：

(1)传代致弱：将从自然感染发生组织滴虫病的病死火鸡肝脏中分离获得的火鸡组织滴虫强毒株，在体外培养过程中每隔2-3天连续加以传代至162代人工致弱；

(2)虫株冻存：培养液混匀后，每EP管内加入1ml含虫株的培养液，3000r/min离心5min；弃上清后每EP管内加入1ml M199培养基；混匀后转移到冻存管内，每根冻存管内加入二甲基亚砜100ul，混匀；旋紧盖子；放入已预冷的梯度降温盒中；立即放入﹣80℃超低温冰箱；12h后取出；放入冻存盒，放入液氮中；

(3)虫株复苏：从液氮中快速取出所需复苏的虫株，放入40℃恒温水浴锅中轻轻摇晃至培养基融化；将冻存管内的培养基迅速转移至预热好的9ml正常传代用培养基中，放入40℃恒温培养箱中厌氧培养；36h后观察培养基中有无虫体生长，若有，进行下一次传代，若无，将其放回，过20-30min后再观察，选择有虫体生长的样品作为产品。

步骤(1)中传代致弱时，先将细胞培养瓶清洗干净，置于烤箱内烘干；称取10mg米粉，装入培养瓶，包好瓶口，置于烤箱内165℃干烤3-4h灭菌；包好瓶盖，置于高压锅内常规高压灭菌30min；在超净台内向准备好的培养瓶中加入8ml M199和1ml马血清，盖上瓶盖，置于40℃恒温培养箱内，预热培养基30min；在超净台中吸取1ml火鸡组织滴虫虫体加入预热好的上述培养基，盖上瓶盖，做上标记，放于干燥器内，用凡士林密封，通过燃烧蜡烛耗尽干燥器内氧气，制造厌氧环境，置于40℃恒温培养箱内培养；如此每2-3天重复上述操作一次，即为传代选育弱毒株的过程。

本发明一种鸡源火鸡组织滴虫传代致弱株，具有作为鸡群滴虫病的防治疫苗的用途。

本发明提供的鸡源火鸡组织滴虫传代人工致弱株A162具有良好的安全性和免疫原性，其由分离自鸡群的虫株制备的传代致弱候选活疫苗，该疫苗成本低，使用方便，使用后无药物残留，不产生耐药性，不会对环境造成污染，免疫原性好，使用安全，能有效抵抗10⁵个强毒虫体的感染。相比火鸡来源虫株所制备的疫苗，该疫苗对鸡群的组织滴虫病的预防更为科学和可靠，有望成为药物控制鸡群组织滴虫病的替代手段，从而有效克服该病防治目前面临的巨大瓶颈和困境。

附图说明

图1为本发明的实施流程图。

图2为制备的鸡源火鸡组织滴虫致弱活疫苗(×400)放大图。

图3为弱毒免疫攻虫组A组(左图盲肠右图肝脏)。

图4为未免疫攻虫对照组B组(左图盲肠右图肝脏)。

图5为未免疫未攻虫对照组C组。

具体实施方式

实施例1：鸡源火鸡组织滴虫虫株传代致弱株的制备

火鸡组织滴虫弱毒株的传代选育操作虽然简单，但耗时很长，选育出一株相对安全的弱毒株可能需要数年的努力。在致弱株选育过程中要定期的观察虫体的生长繁殖情况和形态特征并计数虫体密度，还要定期冻存或复苏，保存不同代次传代虫体的祖代虫株。

传代致弱步骤如下：细胞培养瓶清洗干净，置于烤箱内烘干；称取10mg米粉，装入培养瓶，包好瓶口，置于烤箱内165℃干烤3-4h灭菌；包好瓶盖，置于高压锅内常规高压灭菌30min；在超净台内向准备好的培养瓶中加入8ml M199和1ml马血清，盖上瓶盖，置于40℃恒温培养箱内，预热培养基30min；在超净台中吸取1ml火鸡组织滴虫虫体加入预热好的上述培养基，盖上瓶盖，做上标记，放于干燥器内，用凡士林密封，通过燃烧蜡烛耗尽干燥器内氧气，制造厌氧环境，置于40℃恒温培养箱内培养；如此每2-3天重复上述操作一次，即为传代选育弱毒株的过程。

虫株冻存步骤如下：培养液混匀后，每EP管内加入1ml含虫株的培养液，3000r/min离心5min；弃上清后每EP管内加入1ml M199培养基；混匀后转移到冻存管内，每根冻存管内加入二甲基亚砜(DMSO)100ul,立即混匀；旋紧盖子；放入已预冷的梯度降温盒中；立即放入﹣80℃超低温冰箱；12h后取出立即放入冻存盒，立即放入液氮中。

虫株复苏步骤如下：从液氮中快速取出所需复苏的虫株，放入40℃恒温水浴锅中轻轻摇晃至培养基融化；将冻存管内的培养基迅速转移至预热好的9ml正常传代用培养基中，放入40℃恒温培养箱中厌氧培养；36h后观察培养基中有无虫体生长，若有，进行下一次传代，若无，将其放回，过20-30min后再观察，选择有虫体生长的样品作为产品。

结果分析如下：每隔20代左右冻存一批，每批均可复苏培养，用于后续传代与保种。传代过程中各代次虫体的形状和生长特性未发生明显变化，传至162代进行致弱效果的评价，选择162代后的作为产品。

实施例2：鸡源火鸡组织滴虫虫株传代致弱株安全性检测

对传代培养2d的火鸡组织滴虫A58和A162株经台盼蓝染色后计数，调整各株火鸡组织滴虫的数量达到10⁵个/ml，分别吸取1ml培养液分装到10个1.5ml EP管中，3000r/min离心5min，弃上清700μl，将沉淀轻轻吹匀，接种前放入40℃恒温培养箱中保存。将饲养至15d的苏禽黄羽肉鸡称重，随机分为3组：A、B、C组，每组10只鸡；A组感染火鸡组织滴虫A58株，B组感染火鸡组织滴虫A162株，C设为为阴性对照组接种空白对照培养基，各组每只鸡均经泄殖腔感染途径感染10⁵个虫体。感染7天后每天观察鸡的精神、食欲、粪便与发病情况，并且记录结果。感染后15天对所有存活的鸡称重后扑杀，取盲肠和肝脏进行病变记分，病变记分标准如表1。

表1脏器计分标准

结果分析如下：两株不同代次的虫株与空白对照组相比，增重差异不显著(表2)；肝脏病变计分与空白对照组相比无显著差异；盲肠病变计分稍高空白对照组，其中A162株组盲肠病变计分明显低于A59株组(表2)。综合增重、脏器病变计分等指标，A162株致病力指标均较低，具有很好的安全性。

表2不同代次虫株感染对鸡增重和脏器病变计分的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

实施例3：鸡源火鸡组织滴虫虫株传代致弱株免疫原性检测

将饲养至17d的苏禽黄羽肉鸡称重，随机分为A、B、C三组，每组5只鸡；A组为免疫组，17日龄时经过泄殖腔免疫火鸡组织滴虫致弱株A162株10⁵个/羽，B组为未免疫阳性感染对照组，C组为未免疫阴性对照组。正常饲喂至37日.龄时，除C组外，A、B组以未致弱的D6株进行经泄殖腔感染攻虫10⁵个/羽，15天后全部扑杀，以发病率、死亡率、增重、脏器病变计分为评价指标，评价致弱株的免疫保护效果。

结果分析如下：攻虫10天左右B组出现发病鸡蜷缩于笼子角落，缩头、垂翅、羽毛蓬乱、打瞌睡，食欲不振及黄白色稀便等症状，A组、C组的鸡一切表现正常；A组平均增重与B组差异显著(p﹤0.05)，A组与C组的平均增重差异不显著(p﹥0.05)(表3)，以未致弱的毒株对接种了传代致弱活疫苗的鸡攻虫后，其生长速度明显高于没有接种传代致弱活疫苗的鸡，但是与正常的鸡相比，其生长速度尚有一定程度上减缓；A组的平均盲肠病变程度比B组轻且差异显著(p﹤0.05)，C组无病变，且A组与C组、B组与C组间差异显著(p﹤0.05)(表3，图3、4、5)；A组平均肝脏病变程度较B组轻，两组间差异不显著(p﹥0.05)，C组无病变，A、C两组差异显著(p﹤0.05)(表3，图3、4、5)；结果表明火鸡组织滴虫传代致弱株A162具有良好的免疫原性，可以进一步用于组织滴虫病的预防。

表3不同实验组的增重和脏器病变计分

注:同列数据肩注具有相同小写字母者表示差异不显著(p>0.05)；同列数据肩注具有不同小写字母者表示差异显著(p<0.05).

本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。