阅读说明：本技术 一种基于AuNPs@ZIF-8的适配体荧光传感器的制备方法及其应用 (Preparation method and application of aptamer fluorescence sensor based on AuNPs @ ZIF-8 ) 是由 王广凤 胡慧 于 2019-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于AuNPs@ZIF-8的适配体荧光传感器的制备方法及其应用,合成了粒径在70nm左右的ZIF-8,利用硼氢化钠对氯金酸的还原作用原位合成金纳米粒子,并且利用巯基与金纳米粒子结合形成金硫键将巯基修饰的FAM-S1和锁定的DNAzyme修饰到金纳米粒子上面,在有目标物miRNA存在的情况下,miRNA与锁定链互补配对,DNAzyme释放出来,当pH为酸性时,ZIF-8降解释放出锌离子,DNAzyme在锌离子的辅助下切割基质链S1,释放出FAM信号,并通过DNAzyme在金纳米粒子表面的行走实现信号放大。(The invention discloses a preparation method and application of an aptamer fluorescence sensor based on AuNPs @ ZIF-8, ZIF-8 with the particle size of about 70nm is synthesized, gold nanoparticles are synthesized in situ by utilizing the reduction effect of sodium borohydride on chloroauric acid, sulfydryl and the gold nanoparticles are combined to form a gold-sulfur bond, sulfydryl modified FAM-S1 and locked DNAzyme are modified on the gold nanoparticles, miRNA and a locked chain are complementarily paired under the condition that target miRNA exists, DNAzyme is released, ZIF-8 is degraded to release zinc ions when the pH value is acidic, DNAzyme cuts a matrix chain S1 under the assistance of zinc ions to release FAM signals, and signal amplification is realized by the walking of DNAzyme on the surfaces of the gold nanoparticles.)

一种基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于[email protected]的适配 体荧光传感器的制备方法及其应用。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类约有19－25核苷酸在真核生物中发挥关键 作用的小分子非编码核糖核酸(RNA)，它被发现在真核细胞中充当转录后基因表 达的调控者，在细胞迁移、增殖、凋亡等过程中发挥重要调控作用。越来越多 的证据表明，miRNAs的异常表达与许多疾病有关，包括恶性肿瘤、糖尿病和病 毒感染等。miRNAs的表达可作为癌症和其他疾病的诊断和治疗的生物标记。随 着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，miRNAs作为基因表遗传学的重要机制 之一，受到越来越多的关注。

已经有很多传统的检测方法被用于检测miRNAs，其中包括Northern杂交、 实时PCR、催化发夹放大等。然而，这些方法具有一定的局限性。Northern杂 交操作复杂且需要放射性标记，不仅会造成严重的污染，而且灵敏度低。实时 PCR和催化发夹放大虽然灵敏度高，但是所需要的仪器和试剂昂贵且组装方法 复杂，因此限制了这些检测方法的广泛使用。为了克服这些传统方法的不足， 发展一些低成本、高灵敏度的方法是有必要的。

因此，有必要提出一种简便的、低检测限的和有选择性的方法来检测 miRNAs。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备 方法及其应用，本发明合成了粒径在100nm左右的ZIF-8，利用硼氢化钠对氯金 酸的还原作用原位合成金纳米粒子，并且利用巯基与金纳米粒子结合形成金硫 键将巯基修饰的FAM-S1和锁定的DNAzyme修饰到金纳米粒子上面。在有目标 物miRNA存在的情况下，miRNA与锁定链互补配对，DNAzyme释放出来，当 pH为酸性时，ZIF-8降解释放出锌离子，DNAzyme在锌离子的辅助下切割基质 链S1，释放出FAM信号，并通过DNAzyme在金纳米粒子表面的行走实现信号 放大。

本发明提供的一种基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备方法，包 括以下步骤：

(1)制备[email protected]材料；

(2)将DNA Lock1溶液和DNA DNAzyme溶液混合，加热后冷却，得到 锁定的DNAzyme溶液；

(3)将锁定的DNAzyme溶液和DNA S1溶液加入到[email protected]溶液中， 再加入吐温-20溶液，室温培育10～15h，

(4)分四次向步骤(3)中加入氯化钠水溶液，每次时间间隔为40～45min； 加入完成后继续培育22～26h，所得产物经离心、洗涤后，分散在缓冲溶液中， 即可得到所述基于[email protected]的适配体荧光传感器[email protected] 荧光传感器。

所述步骤(1)中，所述[email protected]材料的制备方法为：向ZIF-8的甲 醇溶液中，逐滴加入氯金酸水溶液，搅拌反应5～8h；然后迅速加入新配置的硼 氢化钠甲醇溶液，继续反应1～1.5h，所得产物经清洗、离心、干燥，即可得到 所述[email protected]材料，其为十二面体结构，平均粒径在70nm。

进一步地，所述ZIF-8的甲醇溶液的浓度为1.5～2.5mg/mL；所述氯金酸水 溶液的质量浓度为0.8～1.5％，所述硼氢化钠甲醇溶液的浓度为6.0～8.0mg/mL， ZIF-8的甲醇溶液、氯金酸水溶液、硼氢化钠甲醇溶液的体积之比为8～12： 0.2～0.4：1。

进一步地，所述ZIF-8的制备方法为：将硝酸锌的甲醇溶液缓慢加入到2- 甲基咪唑的甲醇溶液中，搅拌15-20分钟，产物经清洗、离心、干燥，得到ZIF-8 材料。

所述硝酸锌的甲醇溶液的浓度为21.4-25.0mg/mL；所述2-甲基咪唑的甲醇 溶液的浓度为50-55mg/mL；两者的体积之比为1:1。

所述DNA Lock1溶液、DNA DNAzyme溶液、DNA S1溶液、[email protected] 溶液分别为将2.5OD的DNA Lock1、DNA DNAzyme和DNA S1、[email protected] 溶解在25mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中得到。

所述DNA Lock1溶液、DNA DNAzyme溶液和DNA S1溶液的浓度均为 100μM，[email protected]溶液的浓度为1mg/mL。

所述DNA Lock1、DNA DNAzyme、DNA S1的序列分别为：

DNA Lock1：5'-TTGAAG CAC AAA TTC GGT TCT ACA GGG TA-3’；

DNA DNAzyme：

5'-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTC TTCCGACCGGTCGAAAATAGTGGCCCGAATTTGTGCTTCAA-3’；

DNA S1：5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTGGGCCACTAT rAGGAAT-FAM-3’。

步骤(2)中，所述DNA Lock1溶液与DNA DNAzyme溶液的体积之比为 1:3；所述加热冷却指的是：加热到70～80℃保持3～5min后，以0.5～1.5℃/min 的速度缓慢降温到室温。

步骤(3)中，锁定的DNAzyme溶液、DNA S1溶液与[email protected]溶液 的体积之比为1:5:194；所述吐温-20在体系中的终浓度为0.05％。

步骤(4)中，所述氯化钠水溶液的浓度为0.1M；每次加入的氯化钠水溶液 与DNAS1溶液的体积之比为2:1。

步骤(4)中，所述洗涤是指用含有0.05％Tween 20的10mM pH7.4的Tris-HCl 缓冲溶液洗涤一次。

本发明还提供了根据所述的制备方法制备得到的基于[email protected]的适配 体荧光传感器在检测miRNA中的应用。

进一步地，所述miRNA的检测方法包括以下步骤：

将所述基于[email protected]的适配体荧光传感器分散到pH5.5的Tris-HCl 缓冲溶液，分别加入一系列不同浓度的miRNA-10b溶液，培养后，检测各体系 对应的荧光信号，构建荧光强度和miRNA-10b溶液的浓度的线性关系，进而实 现对miRNA-10b的定量检测。

进一步地，所述培养的条件为35℃培养60～70min。

进一步地，所述miRNA-10b的序列为：

5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’；所述miRNA-10b溶液的浓度 分别为0.01nM-100nM。

所述miRNA-10b溶液的制备方法为：将2.5OD的miRNA-10b溶解在DEPC 水中得到。

在上述检测方法中，在pH等于5.5时，[email protected]适配体荧 光传感器分解，释放出锌离子和修饰了DNA的金纳米粒子，当miRNA-10b存 在的情况下，miRNA-10b和DNA Lock1互补配对，将DNAzyme释放出来，在 锌离子存在的情况下，DNAzyme切割基质链DNA DNAS1上特定的碱基位点， 释放出带有FAM的DNA片段，从而实现荧光恢复。一个金纳米粒子上面修饰 了很多的DNAzyme链和基质链，经过DNAzyme在金纳米粒子上的行走从而实现信号放大。随着miRNA的浓度增加，荧光强度会随之增强，从而实现对miRNA 的灵敏检测。

本发明提供的基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备方法，使用 [email protected]合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，将DNA，金属有机 框架进行关联，利用ZIF-8的pH响应，进而利用DNA碱基互补配对原则和 DNAzyme的特异性切割构建一个行走的放大系统，实现了对miRNA的特异性 和灵敏性检测。

附图说明

图1为[email protected]的合成过程和构建荧光传感器传感器检测miRNA的 示意图；

图2A和图2B分别为ZIF-8、[email protected]的扫描电子显微镜照片(SEM)， 图2C和图2D分别为ZIF-8、[email protected]的透射电子显微镜照片(TEM)， 图2E-L是[email protected]材料的元素分布图，图2M为[email protected]的高分辨 透射电子显微镜照片(HRTEM)；

图3A和图3B分别为ZIF-8、[email protected]的粉末X射线衍射图(PXRD) 和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)，图3C为ZIF-8、ZIF-8+DNA、[email protected]、 [email protected]+DNA的紫外吸收曲线，图3D为ZIF-8、[email protected]、 [email protected]+DNA的Zeta电势图；

图4A为基于[email protected]适配体荧光传感器检测不同浓度miRNA的标准曲线，图4B为对应的荧光曲线；

图5为基于[email protected]适配体荧光传感器检测miRNA的可 行性图，A为在不同pH值条件下添加目标物的荧光曲线，B为添加miRNA之 后孵育不同时间的荧光强度曲线；

图6为基于DNAzyme-Au[email protected]适配体荧光传感器检测miRNA的条 件优化图，A为孵育温度的优化，B为DNA S1：DNAzyme的比例优化；

图7为基于[email protected]适配体荧光传感器检测不同miRNA 的选择性图，插图为对应的荧光曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明进行详细说明。

实施例1

[email protected]材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取350mg 2-甲基咪唑(2-MIM)，溶于7mL甲醇中，超声溶解10-15 分钟；

(2)称取150mg硝酸锌[Zn(NO₃)₂·6H₂O]溶于7mL甲醇中，超声溶解8-10 分钟；

(3)在搅拌的条件下，将步骤(2)得到的硝酸锌溶液缓慢加入步骤(1) 中得到的2-甲基咪唑溶液，并在室温下继续搅拌20-30分钟，将得到的产物离心， 并用无水甲醇洗涤三次，在真空干燥箱中80℃干燥12h，得到ZIF-8材料，其 SEM和TEM图像如图2A和2C所示，从图中可以看出，ZIF-8材料为正十二面 体结构，粒径大小约为70nm左右，且形貌均匀；

(4)称取20mg ZIF-8材料，分散在10mL无水甲醇里面，超声15-20分钟， 在搅拌下逐滴加入300μL氯金酸水溶液，并在室温下继续搅拌6个小时，迅速 加入1mL新配的含有7.2mg硼氢化钠(NaBH₄)的甲醇溶液，继续在室温下搅 拌反应1小时，将产物离心，并用无水甲醇洗涤三次，在真空干燥箱中80℃干 燥24小时，得到[email protected]材料。

其SEM和TEM图像如图2B和2D所示，可以看到[email protected]材料保 持十二面体的结构，粒径大小为70nm左右，表面有小颗粒的金纳米粒子存在， HRTEM图像图2M证明金纳米粒子的成功包覆，其元素分布图如图图2E-L所 示，也证明[email protected]的成功合成。

实施例2

一种基于[email protected]荧光传感器的构建过程，包含以下步骤：

(1)称取2mg [email protected]溶于2mL的Tris-HCl缓冲溶液(25mM，pH ＝7.4)，超声20分钟左右使分散均匀，得到含有[email protected]溶液；

(2)将购买的DNA序列DNA S1、DNA Lock1、DNA DNAzyme分别溶解 在25mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到浓度为100uM的DNA S1溶液、 DNA Lock1溶液和DNA DNAzyme溶液；所述DNA S1、DNA Lock1、DNA DNAzyme的序列分别如下所示：

DNA S1：5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTGGGCCACTAT rAGGAAT-FAM-3’；

DNA Lock1：5'-TTGAAG CAC AAA TTC GGT TCT ACA GGG TA-3’；

DNA DNAzyme：

5'-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTC TTCCGACCGGTCGAAAATAGTGGCCCGAATTTGTGCTTCAA-3’；

(3)取5μL步骤(2)得到的DNA DNAzyme溶液加入到15μL步骤(2) 得到的DNA Lock1溶液中，加热到75℃保持3～5min，并以1分钟/℃的温度缓 慢降温到室温，得到锁定的DNAzyme溶液；

(4)取1μL步骤(3)中得到的锁定的DNAzyme溶液和5μL步骤(2)得 到的DNA S1溶液，加入到194μL步骤(1)得到的Au[email protected]溶液中，加 入1％质量浓度的Tween20使最终的Tween20的质量浓度为0.05％，在室温下培 育12h；

(5)向步骤(4)中的反应体系中分四次加入浓度为0.1M的氯化钠水溶液 以增加DNA在[email protected]上面的负载量，每次的添加量为10μL，每次添加 NaCl水溶液后均超声1分钟左右并在室温培育40分钟，全部加入完成后继续培 育24小时，离心，用含有0.05％Tween20的10mM pH＝7.4的Tris-HCl缓溶液 洗涤三次，所得产物分散在25mM pH5.5的Tris-HCl缓冲溶液中，在4摄氏度 下储存备用，即为[email protected]荧光传感器溶液。

从图3C的紫外吸收曲线可以看到，AuNPs的特征吸收峰有微量的红移同时 在260nm出现DNA的特征峰，可以证明[email protected]荧光传感器 的成功制备，同时，根据图3D的Zeta电位变化图也可以证明 [email protected]荧光传感器的成功制备。

实施例3

[email protected]荧光传感器对于miRNA-10b的定量检测， miRNA-10b的序列为5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’

将浓度为1mg/mL实施例2得到的[email protected]荧光传感器溶 液分为多组，分别向其中加入浓度从0.01nM到100nM的miRNA-10b溶液(其 为将2.5OD的miRNA-10b溶解在DEPC水中得到)，在35℃培养60min；然后 在490nm激发波长下检测各体系的荧光发射光谱，结果如图4B所示；

以miRNA-10b溶液的浓度为横坐标，各体系的荧光强度最大值为纵坐标构 建标准曲线如图4A所示，得出线性方程为I＝346.26log[c]+936.5728，其相关系 数R²为0.9720，检测限为3pM，根据线性曲线和线性方程进而可实现对于未知 浓度的miRNA-10b溶液的定量检测。

实施例4

基于[email protected]荧光传感器检测miRNA-10b的可行性研究

(1)向浓度为1mg/mL实施例2得到的[email protected]荧光传感 器溶液中加入20μL 1nM的miRNA-10b溶液，35℃培育60min后检测其荧光强 度，由图5A可以看出，只有在pH为酸性的情况下加入目标物培育才有荧光信 号，证明了基于[email protected]荧光传感器检测miRNA-10b的可行性；

(2)向浓度为1mg/mL实施例2得到的[email protected]荧光传感 器溶液中加入20μL 1nM的miRNA-10b溶液，35℃培育不同时间后检测其荧光 强度，如图5B所示，可以看出，随着时间的增加，荧光强度也在不断增加，在 60min后趋于稳定，证明了DNAzyme的行走可以放大荧光强度。

实施例5

基于[email protected]荧光传感器检测miRNA-10b优化条件：

(1)向浓度为1mg/mL实施例2得到的[email protected]荧光传感 器溶液中加入20μL 1nM的miRNA-10b溶液，改变孵育的温度分别为20，25， 30，35，40，45℃，孵育的时间为60min，检测对应的荧光强度，结果如图6A， 表明35℃为实验最佳温度；

(2)将实施例2中步骤(4)中的DNA S1缓冲溶液的体积分别替换为2、3、4、5、6、7、8μL，向分别得到的浓度为1mg/mL的[email protected] 荧光传感器溶液中分别加入20μL1nM的miRNA-10b溶液，35℃培育60min后 检测荧光强度，结果如图6B，表明DNA S1：锁定的DNAzyme的摩尔比为20:1 时，体系的荧光强度最大。

实施例6

向7组浓度为1mg/mL实施例2得到的[email protected]荧光传感 器溶液中分别加入体积和浓度均为20μL 1nM的miRNA-10b、miRNA-16、 miRNA-126、单个碱基错配miRNA-10b干扰物、两个碱基错配miRNA-10b干 扰物、三个碱基错配miRNA-10b干扰物溶液，它们都是通过溶解在DEPC水中 配制得到的溶液，其中一组为空白组，35℃培育60min后检测各组相对应获得 的荧光发光强度，如图7所示，说明此荧光传感器具有很好的选择性。

上述参照实施例对一种基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备方法 及其应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列 举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发 明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种基于[email protected]的适配体荧光传感器的制备方法及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> DNA Lock1

<400> 1

5'- ttgaagcaca aattcggttc tacagggta-3’ 29

<210> 2

<211> 89

<212> DNA

<213> DNA DNAzyme

<400> 2

5'-SH-tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttattctt ccgaccggtc 60

gaaaatagtg gcccgaattt gtgcttcaa-3’ 89

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> DNA S1

<400> 3

5’-SH-tttttttttt ttttgggcca ctatraggaa t-FAM-3’ 31

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-10b

<400> 4

5'-uacccuguag aaccgaauuu gug-3’ 23