一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法
阅读说明：本技术 一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法 (Method for defining effective working temperature parameter of fluorescent probe ) 是由 石吉勇 李文亭 邹小波 黄晓玮 李志华 胡雪桃 郭志明 史永强 石海军 于 2019-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析测试技术领域,涉及一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法；具体包含温度偏移情况下探针信号的检测、荧光探针对温度偏移响应规律解析、以及探针有效工作温度的定量界定三个步骤；本发明通过解析荧光探针信号对温度正向偏移和负向偏移的响应规律,分别构建了荧光信号正向偏移幅度函数和荧光信号负向偏移幅度函数,实现了允许检测误差范围内荧光探针对应工作温度参数的精确界定,可为荧光探针在实际应用中的有效工作温度范围界定提供参考依据,从而实现待测分析物的高效、精准荧光法检测。(The invention belongs to the technical field of analysis and test, and relates to a method for defining an effective working temperature parameter of a fluorescent probe; the method specifically comprises three steps of detecting a probe signal under the condition of temperature deviation, analyzing a response rule of a fluorescent probe to the temperature deviation and quantitatively defining the effective working temperature of the probe; according to the invention, by analyzing the response rule of the fluorescent probe signal to positive deviation and negative deviation of the temperature, a positive deviation amplitude function and a negative deviation amplitude function of the fluorescent signal are respectively constructed, so that the accurate definition of the corresponding working temperature parameter of the fluorescent probe in the allowable detection error range is realized, a reference basis can be provided for the effective working temperature range definition of the fluorescent probe in practical application, and the efficient and accurate fluorescence detection of the analyte to be detected is realized.)
技术领域
本发明属于分析测试技术领域，涉及一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法。
背景技术
荧光探针与待测目标分析物作用后使其自身荧光特性发生改变，从而实现待测分析物的定性或定量检测，具有分析灵敏度高、检测成本低和操作简单等优点，已广泛应用于食品检测、环境监测和生物成像领域。荧光探针的高灵敏度同时也意味着其易受检测体系环境参数的影响，因此荧光探针的有效工作环境界定对荧光探针实际检测结果的有效性、可靠性和稳定性至关重要。
测试环境温度是影响荧光探针检测有效性的重要因素之一。实验室环境下，荧光探针经过测试环境温度优化后，具有很高的测试精度。在荧光探针的实际应用过程中，其对应的测试环境温度往往无法做到与其最优测试环境温度保持严格一致。如何在允许的检测精度误差内，精确界定荧光探针的工作环境温度显的至关重要。
现有的荧光探针有效工作温度界定方法为在最佳工作温度附近测定有限个温度值对应的荧光信号，通过比较有限个温度值的荧光信号强度与最佳工作温度对应的荧光信号强度，从而确定其给定误差对应的有效工作温度范围。该方法的不足为得到的有效工作温度范围的边界必定为测定的有限个温度值之一，温度范围的边界值无法精确界定。
本发明的目的在于解决现有技术中的问题之一，本发明提出了一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法，从而为确定荧光探针的实际应用范围提供参考依据。
本发明所述一种荧光探针有效工作温度参数的界定方法，具体包含温度偏移情况下探针信号的检测、荧光探针对温度偏移响应规律解析、以及探针有效工作温度的定量界定三个步骤:
温度偏移情况下探针信号的检测：
对最佳工作温度为T0℃的荧光探针，设定其温度正向偏移幅度为ΔT1℃，温度负向偏移幅度为ΔT2℃；依次测量正向偏移幅度和负向偏移幅度内不同温度下对应荧光探针的荧光信号；
所述正向偏移幅度和负向偏移幅度内温度下对应荧光探针的荧光信号的检测方法具体如下：
当温度正向偏移时，荧光信号检测次数为n+1，以单次增幅ΔT1/n℃，依次测量温度T0，T0+ΔT1/n，T0+2ΔT1/n，……，T0+(n-1)ΔT1/n，T0+nΔT1/n℃对应的荧光信号A0，A1，A2，……，An-1，An；当温度负向偏移时，荧光信号检测次数为m，以单次减幅ΔT2/m，依次测量温度T0-ΔT2/m，T0–2ΔT2/m，……，T0-(m-1)ΔT2/m，T0–mΔT2/m℃对应的荧光信号B1，B2，……，Bm-1，Bm；其中，n和m为大于0的整数。
荧光探针对温度偏移响应规律解析：
将荧光探针在温度正向偏移和负向偏移幅度内不同温度下对应荧光信号与最佳工作温度T0℃对应的荧光信号相减并取绝对值得到荧光信号偏移幅值；以温度偏移幅度为自变量，以荧光信号偏移幅值为因变量，建立荧光信号正向偏移幅度函数Y＝F1(X)和负向偏移幅度函数V＝F2(U)；同时建立荧光信号正向偏移幅度函数的反函数X＝F1 -1(Y)和负向偏移幅度函数的反函数U＝F2 -1(V)；
所述荧光信号偏移幅值的计算方法如下：当温度正向偏移时，将温度T0+ΔT1/n，T0+2ΔT1/n，……，T0+(n-1)ΔT1/n，T0+nΔT1/n℃对应的荧光信号A1，A2，……，An-1，An与温度为T0的荧光信号A0相减并取绝对值，得到温度偏移幅度ΔT1/n，2ΔT1/n，……，(n-1)ΔT1/n，nΔT1/n℃对应的荧光信号偏移幅值|A1-A0|，|A2-A0|，……，|An-1-A0|，|An-A0|；当温度负向偏移时，将温度T0-ΔT2/m，T0–2ΔT2/m，……，T0-(m-1)ΔT2/m，T0–mΔT2/m℃对应的荧光信号B1，B2，……，Bm-1，Bm与温度为T0的荧光信号A0相减并取绝对值，得到温度偏移幅度ΔT2/m，2ΔT2/m，……，(m-1)ΔT2/m，mΔT2/m℃对应的荧光信号偏移幅值|B1-A0|，|B2-A0|，……，|Bm-1-A0|，|Bm-A0|；
其中，n和m为大于0的整数。
所述正向偏移幅度函数Y＝F1(X)和负向偏移幅度函数V＝F2(U)的建立方法具体操作如下：当温度正向偏移时，以温度偏移幅度0，ΔT1/n，2ΔT1/n，……，(n-1)ΔT1/n，nΔT1/n为自变量X，以荧光信号偏移幅值0，|A1-A0|，|A2-A0|，……，|An-1-A0|，|An-A0|为因变量Y，建立荧光信号正向偏移幅度函数Y＝F1(X)；当温度负向偏移时，以温度偏移幅度0，ΔT2/m，2ΔT2/m，……，(m-1)ΔT2/m，mΔT2/m为自变量U，以荧光信号偏移幅值0，|B1-A0|，|B2-A0|，……，|Bm-1-A0|，|Bm-A0|为因变量V，建立荧光信号负向偏移幅度函数V＝F2(U)。
所述正向偏移幅度函数和负向偏移幅度函数通过Excel线性拟合得到。
探针有效工作温度的定量界定：
设定荧光信号正向和负向允许误差，以荧光探针最佳工作温度T0对应的荧光信号为基准点，计算荧光信号正向允许最大偏移幅度和负向允许最大偏移幅度；
所述荧光信号正向允许最大偏移幅度和负向允许最大偏移幅度的计算方法如下：设定正向允许误差C1％，以荧光探针最佳工作温度T0对应的荧光信号A0为基准点，计算荧光信号正向允许最大偏移幅度ΔA1＝|A0*C1％|；设定负向允许误差-C2％，以荧光探针最佳工作温度T0对应的荧光信号A0为基准点，计算荧光信号负向允许最大偏移幅度ΔA2＝|-A0*C2|
将荧光信号正向允许最大偏移幅度ΔA1代入信号正向偏移幅度函数的反函数X＝F1 -1(Y)，计算荧光信号正向允许最大偏移幅度ΔA1时对应的正向偏移温度T+＝F1-1(ΔA1)；将荧光信号负向允许最大偏移幅度ΔA2代入信号正向偏移幅度函数的反函数U＝F2 -1(V)，计算荧光信号负向允许最大偏移幅度ΔA2时对应的负向偏移时温度T-＝F2 -1(ΔA2)；由此确定荧光探针信号允许误差范围-C2％～C1％对应的有效工作温度为T0-T-～T0+T+℃。
本发明的有益效果：
本发明通过解析荧光探针信号对温度正向偏移和负向偏移的响应规律，分别构建了荧光信号正向偏移幅度函数和荧光信号负向偏移幅度函数，实现了允许检测误差范围内荧光探针对应工作温度参数的精确界定，可为荧光探针在实际应用中的有效工作温度范围界定提供参考依据，从而实现待测分析物的高效、精准荧光法检测。
附图说明
图1为本发明方法的工作流程图。
具体的实施方案
以下通过各实施方式对本发明进行详细描述。但是这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明所述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要书所限定的范围。
本实施例采用铜纳米簇(CuNCs)作为荧光探针构建荧光信号正向偏移幅度函数和荧光信号负向偏移幅度函数，并界定了铜纳米簇对应工作温度参数的允许检测误差范围。
铜纳米簇荧光探针的制备：取32mg CuSO4加入到20g水中，加入2mL的NaOH溶液(0.5M)以及20mL抗坏血酸溶液(0.1M)，在pH调节至8.0～9.0、温度为50℃条件下水浴搅拌15h后得到铜纳米簇溶液原液，用透析袋(1000D)在去离子水中透析24h纯化，得到激发波长为365nm、发射波长为445nm铜纳米簇荧光探针。
铜纳米簇荧光探针有效工作温度参数的界定方法，包括以下三个步骤：
步骤一、温度偏移情况下铜纳米簇荧光信号的检测：
步骤1.1.环境温度值的设定：
已知铜纳米簇荧光探针的最佳工作温度T0为25℃，需要测定该探针有效工作温度范围，那么，设定其温度正向偏移幅度ΔT1为15℃，温度负向偏移幅度ΔT2为25℃；
步骤1.2.铜纳米簇荧光信号检测：
荧光信号检测次数为4，单次增幅5℃，依次测量温度25，30，35，40℃时对应的荧光强度800，788，773，761；当温度负向偏移时，荧光信号检测次数为5，单次减幅5℃，依次测量温度20，15，10，5，0℃时对应的荧光强度813，821，829，835，842；
步骤二、铜纳米簇对温度偏移响应规律解析包括以下过程：
步骤2.1.温度偏移幅度对应的荧光信号偏移幅度计算：
当温度正向偏移时，将温度30，35，40℃对应的荧光强度788，773，761与温度为25℃的荧光强度800相减并取绝对值，得到温度偏移幅度5，10，15℃对应的荧光信号偏移幅值12，27，39；当温度负向偏移时，将温度20，15，10，5，0℃对应的荧光信号813，821，829，835，842与温度为25℃的荧光强度800相减并取绝对值，得到温度偏移幅5，10，15，20，25℃对应的荧光信号偏移幅值13，21，29，35，42；
步骤2.2.铜纳米簇荧光信号偏移幅度函数回归：
当温度正向偏移时，以温度偏移幅度0，5，10，15℃为自变量X，以荧光信号偏移幅值0，12，27，39为因变量Y，利用Excel进行线性拟合，其中设置截距为0，得到荧光信号正向偏移幅度函数Y＝F1(X)＝2.6143X；当温度负向偏移时，以温度偏移幅度0，5，10，15，20，25℃为自变量U，以荧光信号偏移幅值0，13，21，29，35，42为因变量V，利用Excel进行线性拟合，其中设置截距为0，得到荧光信号负向偏移幅度函数V＝F2(U)＝1.7891U；
步骤2.3.铜纳米簇荧光信号偏移幅度反函数计算：
根据荧光信号正向偏移幅度函数Y＝2.6143X，其中X＝Y/2.6143＝0.3825Y，得到光信号正向偏移幅度函数的反函数X＝F1 -1(Y)＝0.3825Y；根据荧光信号负向偏移幅度函数V＝1.7891U，其中U＝V/1.7891＝0.5589V，得到荧光信号负向偏移幅度函数的反函数U＝F2 -1(V)＝0.5589V；
步骤三、铜纳米簇有效工作温度的定量界定包括以下步骤：
步骤3.1.荧光信号允许工作误差设定：
设定正向允许误差C1％为0.5％，以荧光探针最佳工作温度25℃对应的荧光强度800为基准点，计算荧光信号正向允许最大偏幅ΔA1＝|A0*C1％|＝|800×0.5％|＝4；设定负向允许误差C2％为-0.5％，以荧光探针最佳工作温度25℃对应的荧光强度800为基准点，计算荧光信号负向允许最大偏幅ΔA2＝|-A0*C2％|＝|-800×0.5％|＝4；
步骤3.2.探针有效工作温度计算：
将荧光信号正向允许最大偏移幅度ΔA1＝4代入正向偏移时温度的反函数X＝F1 -1(Y)，计算荧光信号正向允许最大偏移幅度为ΔA1＝4时对应的正向偏移时温度T+＝F1-1(ΔA1)＝0.3825*4＝1.53℃；将荧光信号负向允许最大偏移幅度ΔA2＝4代入信号负向偏移时温度的反函数U＝F2 -1(V)，计算荧光信号负向允许最大偏移幅度为ΔA2＝4时对应的负向偏移时温度T-＝F2 -1(ΔA2)＝0.5589*4＝2.24℃；由此确定荧光探针信号允许误差范围-0.5％～0.5％对应的有效工作温度为22.76～26.53℃。
将铜纳米簇在有效工作范围22.76～26.53℃内测量其误差，取23、24、25、26℃下分别获得其365nm激发下的荧光强度为803、800、800、798，测量得到的误差分别为：0.375％、0％、0％、0.25％，均<0.5％，说明本发明的荧光探针有效工作温度参数的界定方法是可行的。
具体实施方式
图1为本发明方法的工作流程图。
具体的实施方案
以下通过各实施方式对本发明进行详细描述。但是这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明所述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要书所限定的范围。
本实施例采用铜纳米簇(CuNCs)作为荧光探针构建荧光信号正向偏移幅度函数和荧光信号负向偏移幅度函数，并界定了铜纳米簇对应工作温度参数的允许检测误差范围。
铜纳米簇荧光探针的制备：取32mg CuSO4加入到20g水中，加入2mL的NaOH溶液(0.5M)以及20mL抗坏血酸溶液(0.1M)，在pH调节至8.0～9.0、温度为50℃条件下水浴搅拌15h后得到铜纳米簇溶液原液，用透析袋(1000D)在去离子水中透析24h纯化，得到激发波长为365nm、发射波长为445nm铜纳米簇荧光探针。
铜纳米簇荧光探针有效工作温度参数的界定方法，包括以下三个步骤：
步骤一、温度偏移情况下铜纳米簇荧光信号的检测：
步骤1.1.环境温度值的设定：
已知铜纳米簇荧光探针的最佳工作温度T0为25℃，需要测定该探针有效工作温度范围，那么，设定其温度正向偏移幅度ΔT1为15℃，温度负向偏移幅度ΔT2为25℃；
步骤1.2.铜纳米簇荧光信号检测：
荧光信号检测次数为4，单次增幅5℃，依次测量温度25，30，35，40℃时对应的荧光强度800，788，773，761；当温度负向偏移时，荧光信号检测次数为5，单次减幅5℃，依次测量温度20，15，10，5，0℃时对应的荧光强度813，821，829，835，842；
步骤二、铜纳米簇对温度偏移响应规律解析包括以下过程：
步骤2.1.温度偏移幅度对应的荧光信号偏移幅度计算：
当温度正向偏移时，将温度30，35，40℃对应的荧光强度788，773，761与温度为25℃的荧光强度800相减并取绝对值，得到温度偏移幅度5，10，15℃对应的荧光信号偏移幅值12，27，39；当温度负向偏移时，将温度20，15，10，5，0℃对应的荧光信号813，821，829，835，842与温度为25℃的荧光强度800相减并取绝对值，得到温度偏移幅5，10，15，20，25℃对应的荧光信号偏移幅值13，21，29，35，42；
步骤2.2.铜纳米簇荧光信号偏移幅度函数回归：
当温度正向偏移时，以温度偏移幅度0，5，10，15℃为自变量X，以荧光信号偏移幅值0，12，27，39为因变量Y，利用Excel进行线性拟合，其中设置截距为0，得到荧光信号正向偏移幅度函数Y＝F1(X)＝2.6143X；当温度负向偏移时，以温度偏移幅度0，5，10，15，20，25℃为自变量U，以荧光信号偏移幅值0，13，21，29，35，42为因变量V，利用Excel进行线性拟合，其中设置截距为0，得到荧光信号负向偏移幅度函数V＝F2(U)＝1.7891U；
步骤2.3.铜纳米簇荧光信号偏移幅度反函数计算：
根据荧光信号正向偏移幅度函数Y＝2.6143X，其中X＝Y/2.6143＝0.3825Y，得到光信号正向偏移幅度函数的反函数X＝F1 -1(Y)＝0.3825Y；根据荧光信号负向偏移幅度函数V＝1.7891U，其中U＝V/1.7891＝0.5589V，得到荧光信号负向偏移幅度函数的反函数U＝F2 -1(V)＝0.5589V；
步骤三、铜纳米簇有效工作温度的定量界定包括以下步骤：
步骤3.1.荧光信号允许工作误差设定：
设定正向允许误差C1％为0.5％，以荧光探针最佳工作温度25℃对应的荧光强度800为基准点，计算荧光信号正向允许最大偏幅ΔA1＝|A0*C1％|＝|800×0.5％|＝4；设定负向允许误差C2％为-0.5％，以荧光探针最佳工作温度25℃对应的荧光强度800为基准点，计算荧光信号负向允许最大偏幅ΔA2＝|-A0*C2％|＝|-800×0.5％|＝4；
步骤3.2.探针有效工作温度计算：
将荧光信号正向允许最大偏移幅度ΔA1＝4代入正向偏移时温度的反函数X＝F1 -1(Y)，计算荧光信号正向允许最大偏移幅度为ΔA1＝4时对应的正向偏移时温度T+＝F1-1(ΔA1)＝0.3825*4＝1.53℃；将荧光信号负向允许最大偏移幅度ΔA2＝4代入信号负向偏移时温度的反函数U＝F2 -1(V)，计算荧光信号负向允许最大偏移幅度为ΔA2＝4时对应的负向偏移时温度T-＝F2 -1(ΔA2)＝0.5589*4＝2.24℃；由此确定荧光探针信号允许误差范围-0.5％～0.5％对应的有效工作温度为22.76～26.53℃。
将铜纳米簇在有效工作范围22.76～26.53℃内测量其误差，取23、24、25、26℃下分别获得其365nm激发下的荧光强度为803、800、800、798，测量得到的误差分别为：0.375％、0％、0％、0.25％，均<0.5％，说明本发明的荧光探针有效工作温度参数的界定方法是可行的。