阅读说明：本技术 一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法 (Method for detecting thrombin by using quantum dot sensitized up-conversion nano material ) 是由 刘志洪 余甜雨 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法,包括以下步骤：(1)制备适配体TBA1修饰的上转换纳米粒子(UCNPs-TBA1)；(2)制备适配体TBA2修饰的Ag<Sub>2</Sub>Se量子点(Ag<Sub>2</Sub>Se QDs-TBA2)；(3)绘制凝血酶检测的标准曲线；(4)检测待测样品中的凝血酶浓度。本发明解决了利用FRET传感器检测的信背比低的问题,实现了待测样品中凝血酶的高灵敏检测,检出限可达0.091 nM。(The invention discloses a method for detecting thrombin by using quantum dot sensitized up-conversion nano materials, which comprises the following steps: (1) preparing aptamer TBA1 modified up-conversion nanoparticles (UCNPs-TBA 1); (2) preparation of aptamer TBA2 modified Ag 2 Se quantum dot (Ag) 2 Se QDs-TBA 2); (3) drawing a standard curve of thrombin detection; (4) and detecting the concentration of thrombin in the sample to be detected. The invention solves the problem of low signal-to-back ratio of detection by using the FRET sensor, realizes high-sensitivity detection of thrombin in a sample to be detected, and has the detection limit of 0.091 nM.)

一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法

技术领域

本发明属于生物传感及分析领域，具体涉及一种利用利用量子点敏化上转换纳米材料实现对凝血酶的荧光检测方法。

背景技术

稀土离子掺杂的上转换纳米粒子可以连续吸收两个或多个低能量光子，发射一个高能量光子。这种长波激发、短波发射的性质，能够有效避免来自生物样品本身的自发荧光和散射光的干扰，因此，上转换纳米粒子被广泛应用于生物分析检测领域。另外，由于其具备能够避免与其他物质同时激发的特点，上转换纳米粒子经常与荧光共振能量转移(FRET)技术联用，作为FRET体系的能量供体，而纳米金、二氧化锰、碳纳米材料等摩尔吸光系数较大的纳米材料通常作为FRET体系的能量受体。在检测过程中，首先将能量供-受体进行组装，构架FRET体系，此时上转换纳米粒子的荧光被受体所猝灭；当目标物出现后，通过改变受体的吸收光谱或供-受体之间距离使上转换纳米颗粒荧光恢复，从而实现对目标物的检测。由此可见，这种基于“猝灭-回升”的响应模式，其检测灵敏度受限于猝灭效率和回升效率。

由于上转换纳米粒子的粒径通常为几十纳米，发光离子掺杂在基质晶格中，这种结构特性使作为能量供体的发光离子与外部能量受体的空间距离较远，超出了发生能量转移的有效距离范围，从而导致能量转移效率较低，荧光猝灭程度受到限制。而碳纳米材料通常具有较高的猝灭效率，但由于其对上转换纳米粒子的非特异性吸附作用较强，从而限制了荧光恢复过程。无论是猝灭效率低还是回升效率低都将严重制约检测的信背比及灵敏度。综上所述，本领域仍需要寻找新的检测方法来提高信背比，实现对肿瘤标志物的高灵敏检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为克服现有技术的不足，提供一种利用量子点敏化上转换纳米颗粒检测凝血酶的方法，定量检测稀释血清中的凝血酶，解决了利用FRET传感器检测的信背比低的问题，实现了血清中凝血酶的高灵敏检测，检出限可达0.091nM。

本发明为解决上述技术问题提供的技术方案为：

一种利用量子点敏化上转换纳米颗粒检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

(1)制备适配体TBA1修饰的上转换纳米粒子：通过共沉淀法以稀土油酸盐为前驱体制备表面油酸包覆上转换纳米粒子，去配体之后得到无配体修饰、表面裸露的上转换纳米粒子，再用聚丙烯酸进行表面功能化使上转换纳米粒子表面富含羧基，表面功能化之后与一端修饰有氨基的适配体TBA1反应后，得到TBA1修饰的上转换纳米粒子；

(2)制备适配体TBA2修饰的Ag₂Se量子点：将羧基修饰的Ag₂Se量子点与一端修饰有氨基的适配体TBA2进行偶联反应，得到TBA2修饰的Ag₂Se量子点；

(3)绘制凝血酶检测的标准曲线：将步骤(1)所得上转换纳米粒子和步骤(2)所得的Ag₂Se量子点加入到缓冲溶液中，并向其中加入不同量的凝血酶进行孵育，将孵育后的溶液置于比色皿中用980nm激光光源激发得到荧光强度，设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶在缓冲溶液中的浓度为横坐标绘制标准曲线；

(4)将待测样品用缓冲溶液进行稀释，在与步骤(3)相同的条件下测定荧光强度，进而根据步骤(3)所得标准曲线，获得待测样品中的凝血酶浓度。

按上述方案，所述的上转换纳米粒子的吸收光谱和Ag₂Se量子点的发射光谱相重叠，并且Ag₂Se量子点在980nm处有吸收。

按上述方案，所述的上转换荧光纳米粒子组成为NaYF₄:Yb,Er，形貌为球形，粒径为20-28nm，晶相为六方相；所述Ag₂Se量子点粒径约为3-4nm，形貌也为球形。

按上述方案，所述的单链核酸TBA1和单链核酸TBA2的5’端都修饰有氨基，其序列分别为：5’-NH₂-TTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’和5’-NH₂-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’。

按上述方案，所述的Ag₂Se量子点和TBA2进行偶联反应时的比例为5μmol：(0.5-3)nmol。

按上述方案，所述的缓冲溶液为HEPES缓冲溶液，浓度10mM，pH为7.2。该缓冲溶液还可以用缓冲溶液稀释的血清代替，血清的稀释倍数为20-100倍。

按上述方案，步骤(3)中，缓冲溶液中凝血酶的加入量以其在缓冲溶液中的浓度计为0-125nM。

按上述方案，步骤(3)中，步骤(1)所得上转换纳米粒子在缓冲溶液中的浓度为0.04-0.06mg/mL；步骤(2)所得的Ag₂Se QDs-TBA2在缓冲溶液中的浓度为0.08-0.4μM。

按上述方案，所述的孵育时间为2-5h，孵育温度为37℃。

本发明的原理是：利用凝血酶包含两个不同的DNA适配体结合位点，通过适配体的特异性识别作用，构建检测凝血酶的夹心型核酸适配体传感器。将凝血酶的两条适配体(TBA1和TBA2)分别修饰在上转换纳米粒子和量子点表面，当体系中有凝血酶存在时，TBA1和TBA2特异性识别凝血酶，形成适配体二级结构，拉近量子点与上转换纳米粒子之间的距离，使量子点将其激发态能量转移给上转换纳米粒子，增强上转换纳米粒子的发光，上转换发光增强的程度与凝血酶浓度正相关，从而实现对凝血酶的定量检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明利用上转换荧光纳米材料近红外激发、可见发射的特性，可在血清样品中直接进行检测，无需前期预处理步骤，操作简单，更加适合实际应用。

2、本发明通过优化量子点与适配体的相对浓度，可有效提高体系荧光增强倍数；

3、本发明利用量子点吸光系数大的优点，可有效增强上转换纳米材料的发光，提高检测信背比，解决了利用FRET传感器检测的信背比低的问题，实现了血清中凝血酶的高灵敏检测，检出限可达0.091nM。

附图说明

图1是利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的检测原理图。

图2是不同孵育时间内荧光强度增加倍数随凝血酶浓度变化的关系图。

图3是不同量TBA2标记量子点后凝血酶浓度和荧光增长倍数关系图。

图4是不同量TBA2-QDs反应后凝血酶浓度和荧光增长倍数关系图。

图5是在不同稀释倍数的血清中凝血酶浓度和荧光增长倍数关系图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中，所述上转换纳米材料及其修饰按如下方法进行：

1、油相NaYF₄:Yb,Er的合成：将6.4mL油酸，10.4mL 1-十八烯和0.8mmol Ln(oleate)₃(Ln＝Y:Yb:Er＝78:20:2)加入到三口烧瓶中，升温至50℃后，加入含3.2mmol的NH₄F和2mmol的NaOH的甲醇溶液10mL，在50℃下反应30min；然后在氩气保护下将温度升至100℃，利用真空泵抽出三口瓶中的甲醇气体，最后升温到290℃，在该温度下反应90min后自然冷却至室温，加入适量乙醇，离心分离收集沉淀，再用体积比为1:2的环己烷和乙醇的混合溶液洗两遍，最后，将沉淀分散在环己烷中。该上转换荧光纳米粒子形貌为球形，粒径在24nm左右，即表面油酸包覆的上转换纳米粒子。

去配体：取50mg上述合成的表面油酸包覆的上转换纳米粒子，加入过量乙醇离心后收集沉淀，然后和30mL乙醇一同加入到单口烧瓶中，调至pH＝1，超声3h，超声完毕后离心得到沉淀，先用pH＝4的乙醇离心清洗一遍，再分别用乙醇和超纯水离心清洗三遍，最后将沉淀分散在20mL超纯水中。该过程即为去配体过程，得到无配体修饰、表面裸露的上转换纳米粒子(UCNPs)。

2、用聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子：

将200mg聚丙烯酸，233mg碳酸氢钠，和4mL浓度为12.5mg/mL的表面裸露的UCNPs加入到单口烧瓶中，室温下剧烈搅拌12h，离心收集沉淀后再用超纯水离心清洗三遍，得到聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子，记作PAA-UCNPs，表面修饰有羧基。

3、羧基修饰的Ag₂Se量子点制备：首先，在惰性气体的保护下，将2.5μL(0.01mmol)(TMS)₂Se和80mg LiN(SiMe₃)₂溶解在0.5mL TOP和1mL ODE的混合物液中制备硒前体。将16.7mg(0.1mmol)AgAc、130μL(0.75mmol)1-辛醇和5mL ODE在氩气保护的条件下搅拌一小时后，缓慢加热至160℃后，快速注入硒前驱体，随后在130℃下反应30min，然后冷却至室温后用乙醇洗涤，分散在非极性溶剂中，得到含有油性Ag₂Se量子点的溶液。

将溶解在氯仿中的辛胺改性的聚丙烯酸酯逐滴加入到含有油性Ag₂Se量子点的氯仿溶液中，充分混合后，在室温下通过旋转蒸发干燥溶剂；旋蒸后的固体分散在硼酸盐缓冲液(pH 12.0,50×10^-3M)中，用填充有Superdex 200prep grade的聚丙烯柱过滤纯化，得到羧基修饰的Ag₂Se量子点。

所得羧基修饰的Ag₂Se量子点经EDC和NHS活化羧基后，可与一端修饰有氨基的适配体TBA2进行偶联反应。

4、TBA1和PAA-UCNPs的偶联：将1mg PAA-UCNPs加入1mL 2-(N-吗啉)乙磺酸MES(10mM,pH＝5.5)缓冲溶液中，超声5min，然后加入0.5mg EDC·HCl和1mg Sulfo-NHS，室温下振荡40min后，离心沉淀，再用超纯水离心清洗两遍，沉淀分散到1mL HEPES(10mM,pH＝7.2)缓冲溶液中，加入1nmol TBA1，振荡一夜，得到偶联产物。偶联产物仍通过离心收集沉淀，再用超纯水离心清洗两遍，最后分散在1mL Tris缓冲溶液中(10mM,pH＝7.4)，记作TBA1-UCNPs，4℃保存备用。

实施例1

一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备TBA1-UCNPs溶液；

(2)TBA2和Ag₂Se QDs的偶联：将5μmol Ag₂Se QDs加入到1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝6.8)，超声处理5min后，向其中加入10mg EDC·HCl和5mg Sulfo-NHS，在室温下振荡30min。通过离心收集活化的量子点，并用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)离心洗涤两次后分散在含有2nmol TBA2的1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝7.2)。然后，在室温振荡下孵育4h，得到偶联产物。最后，将偶联产物用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)洗涤三次，并分散在1mL Tris缓冲液中(10mM,pH＝7.4)，记作TBA2-QDs，4℃下保存备用。

(3)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH 7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育2h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(4)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育3h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(5)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(6)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育5h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

通过以上不同孵育时间所绘制的标准曲线，可知：孵育时间的长短会影响上转换荧光的增强倍数，如图2所示，随着孵育时间延长到4h，增强倍数达到最大值，再延长孵育时间也没有明显的荧光增强，因此确定孵育时间为4h较佳。

实施例2

一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备TBA1-UCNPs溶液；

(2)TBA2和Ag₂Se QDs的偶联：将5μmol Ag₂Se QDs加入到1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝6.8)，超声处理5min后，向其中加入10mg EDC·HCl和5mg Sulfo-NHS，在室温下振荡30min。通过离心收集活化的量子点，并用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)离心洗涤两次后分散在含有0.5-3nmol TBA2(分别取值为0.5，1，2，3)的1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝7.2)。然后，在室温振荡下孵育4h，最后，将所得偶联产物分别用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)洗涤三次，并分散在1mL Tris缓冲液中(10mM,pH＝7.4)，分别记作TBA2-QDs-0.5，TBA2-QDs-1，TBA2-QDs-2，TBA2-QDs-3，4℃下保存备用。

(3)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mLHEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs-0.5 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(4)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs-1 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(5)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mLHEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs-2 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(6)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs-3 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

通过以上不同量的适配体TBA2修饰来Ag₂Se量子点，如图3所示，对比可知：用5μmol Ag₂Se QDs和2nmol TBA2进行标记时，可得到最大的上转换荧光的增强倍数，之后增加TBA2的用量，对荧光增强也没有进一步改善，所以将标记过程中TBA2的量确定为2nmol。

实施例3

一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备TBA1-UCNPs溶液；

(2)TBA2和Ag₂Se QDs的偶联：将5μmol Ag₂Se QDs加入到1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝6.8)，超声处理5min后，向其中加入10mg EDC·HCl和5mg Sulfo-NHS，在室温下振荡30min。通过离心收集活化的量子点，并用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)离心洗涤两次后分散在含有2nmol TBA2的1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝7.2)。然后，在室温振荡下孵育4h，最后，将偶联产物用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)洗涤三次，并分散在1mL Tris缓冲液中(10mM,pH＝7.4)，4℃下保存备用。

(3)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.016nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(4)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.032nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(5)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.048nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(6)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(7)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.08nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，0.002，0.01，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

通过调整TBA2-QDs的投加量，如图4所示，增加TBA2-QDs的浓度可以提高荧光增强的倍数，但是当TBA2-QDs在缓冲溶液中的浓度大于0.32μM(即绘制标准曲线过程中，TBA2-QDs的加入量为0.064nmol)时，荧光增强倍数反而下降，这是因为过量的QDs-TBA2会使体系内部发生内滤效应，反而使上转换发光被猝灭，因此可以得到QD-TBA2在缓冲溶液中的最佳浓度为0.32μM。

实施例4

一种利用量子点敏化上转换纳米材料检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备TBA1-UCNPs溶液；

(2)TBA2和Ag₂Se QDs的偶联：将5μmol Ag₂Se QDs加入到1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝6.8)，超声处理5min后，向其中加入10mg EDC·HCl和5mg Sulfo-NHS，在室温下振荡30min。通过离心收集活化的量子点，并用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)离心洗涤两次后分散在含有2nmol TBA2的1mL PBS缓冲液中(10mM，pH＝7.2)。然后，在室温振荡下孵育4h，最后，将偶联产物用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2)洗涤三次，并分散在1mL Tris缓冲液中(10mM,pH＝7.4)，4℃下保存备用。

(3)血清稀释：从医院获得新鲜血清，分别用HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.2)稀释至20倍、50倍、75倍、100倍，记作HEPES-serum20、HEPES-serum50、HEPES-serum75、HEPES-serum100，4℃下保存备用。

(4)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES-serum20中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，2×10^-5，2×10^-4，0.001，0.003，0.008，0.015，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(5)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES-serum50中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，2×10^-5，2×10^-4，0.001，0.003，0.008，0.015，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(6)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES-serum75中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，2×10^-5，2×10^-4，0.001，0.003，0.008，0.015，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(7)绘制凝血酶检测标准曲线：向0.2mL HEPES-serum100中加入步骤(1)所得TBA1-UCNPs 0.01mg和步骤(2)所得TBA2-QDs 0.064nmol，再分别加入0-0.025nmol(分别取值为0，2×10^-5，2×10^-4，0.001，0.003，0.008，0.015，0.02，0.025)的凝血酶，37℃下孵育4h。随后，在980nm连续波激光激发下，在546nm处测量了上转换荧光。设定凝血酶的浓度为0时，所得空白样强度记为F₀，以荧光比率F/F₀为纵坐标，以凝血酶标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

通过对比以上用HEPES缓冲液对血清进行不同倍数的稀释，如图5所示，可知：上转化荧光的增强倍数随着血清稀释倍数的增大而升高，这是由于人血清中存在很多的干扰物，会阻碍QDs和UCNPs之间的聚集以及能量转移，但是在100倍稀释血清中可以得到线性的凝血酶检测范围，为0.1nM～75nM，检出限是0.091nM。

实施例5

表1

如表1所示，根据实施例1-4优化的实验条件和凝血酶检测的标准曲线(即实施例4步骤(7)建立的标准曲线)，在100倍稀释血清样品的加标回收实验中，分为四组，凝血酶加入量分别为1.5、5、10、30nM，得到加标回收率为91.93％～102.8％，其中相对标准偏差为0.749％～6.97％，这表明本发明所述利用量子点敏化上转换纳米颗粒检测凝血酶的方法在临床分析中的可行性。

实施例6

表2

如表2所示，先将从武汉大学中南医院提供的血浆样本按现有方法进行预处理，将凝血酶原转化为凝血酶原。由于凝血酶原以其前体形式存在于血浆中，在该血浆样本中加入0.03M CaCl₂，将凝血酶原转化为凝血酶原，静置活化2h后，用HEPES缓冲液(10mM，pH7.2)将含凝血酶的血浆稀释100倍。

随后，根据实施例1-4优化的实验条件和凝血酶检测的标准曲线(即实施例4步骤(7)建立的标准曲线)，对血浆样本中的凝血酶进行检测。通过对4个人血浆样本中凝血酶水平的检测，本发明所述方法所得到的检测结果在一般血浆中凝血酶的浓度范围内。与商业ELISA试剂盒的测试结果进行比较，因为基于t检验统计分析的t实验值小于t临界值(t_crit[0.05，4]＝2.78)，所以本发明所述利用量子点敏化上转换纳米颗粒检测凝血酶的方法，在实际样品中检测凝血酶的准确性可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。