阅读说明：本技术 一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法 (Method for detecting content of tyramine in aquatic product based on azo coupling reaction and surface enhanced resonance Raman scattering ) 是由 张进杰 郭小莹 黄栋玮 杨君萍 俞青瑶 徐大伦 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法,特点是包括取新鲜鱼肉加入三氯乙酸溶液匀浆后,室温下振荡,再离心取上清液,残渣用三氯乙酸溶液重复提取,合并上清液定容过滤膜得待测样品溶液的步骤；将NaNO<Sub>2</Sub>溶液加入到由对氨基苯甲酸溶解在HCl溶液中得到的混合液中,反应后在搅拌条件下,快速加入Na<Sub>2</Sub>CO<Sub>3</Sub>溶液和酪胺溶液,进行酪胺偶氮偶联反应,即得到酪胺衍生的偶氮化合物溶液的步骤；将酪胺衍生偶氮化合物溶液与Au@Ag NPs溶液按比例混合后进行光谱检测,根据酪胺浓度与特征峰信号强度之间的线性关系,计算出待测样品中酪胺的含量的步骤,优点是简单、快速以及灵敏度高。(The invention discloses a method for detecting the content of tyramine in aquatic products based on azo coupling reaction and surface enhanced resonance Raman scattering, which is characterized by comprising the steps of adding trichloroacetic acid solution into fresh fish meat for homogenate, oscillating at room temperature, centrifuging to obtain supernatant, repeatedly extracting residues by trichloroacetic acid solution, combining the supernatants, fixing the volume and filtering by a membrane to obtain a sample solution to be detected; adding NaNO 2 Adding the solution into a mixed solution obtained by dissolving p-aminobenzoic acid in HCl solution, reacting, and rapidly adding Na under stirring 2 CO 3 Carrying out tyramine azo coupling reaction on the solution and tyramine solution to obtain tyramine derived azo compoundA step of solution; the method comprises the steps of mixing a tyramine derivative azo compound solution and an Au @ Ag NPs solution in proportion, carrying out spectrum detection, and calculating the content of tyramine in a sample to be detected according to the linear relation between the tyramine concentration and the characteristic peak signal intensity.)

一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品 中酪胺含量的方法

技术领域

本发明涉及一种水产品中酪胺含量的检测方法，尤其是涉及一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法。

背景技术

酪胺（1-羟基-4-乙胺苯）属于生物胺的一种，是微生物活性降解产物。存在于发酵食品、饮料、肉类、鱼类、海鲜和乳制品。高浓度酪胺对人体健康危害极大，可促进周围血管收缩，刺激心律，提高血糖浓度，消除神经系统中的去甲肾上腺素，引起偏头痛。因此，建立一种快速、灵敏的酪胺测定方法十分重要。目前，国内外建立了多种方法来定量测定各类食品中酪胺的含量，包括结合不同的检测技术的高效液相色谱法、毛细管电泳、酶生物传感器方法，其中HPLC法是最常用的方法。虽然这些方法具有良好的选择性和检测限，但往往需要较长的时间、复杂的样品预处理和昂贵的仪器。因此，开发一种简便、灵敏度高的酪胺快速检测方法具有重要意义。

偶氮偶联反应是强酸和低温条件下由胺类(-NH₂)物质经HNO₂氧化成的重氮盐(-N≡N⁺)与酚类、苯胺和一些杂环化合物在碱性或中性溶液中发生亲电取代相互偶联生成偶氮分子的化学反应。所用的重氮组分为磺胺酸分子，重氮盐离子作为亲电试剂进攻偶联分子上最具有亲核性的位点(电子密度最强)，得到具有氮氮双键(-N=N-)结构的偶氮化合物。根据偶氮反应的机理，通常情况下重氮盐离子优先进攻酚羟基和芳香族氨基的对位，但是如果对位被占据，那么亲电取代就发生在羟基和氨基的邻位。

表面增强拉曼散射（SERS）是一种快速、具有极高灵敏度的光谱技术，在分析化学、生物医学和食品安全等领域具有广泛的应用。银，金和铜等金属纳米粒子是最常用的SERS基底。由于其独特的局部表面等离子体共振（LSPR）性质，核-壳纳米颗粒如镀银金胶体（[email protected] NPs）在SERS构造中得到广泛应用。SERS对于吸附在或靠近金属纳米结构的分子来说是一种超灵敏的振动光谱技术，每种分子都有它独特的振动指纹信息，而且SERS的灵敏度还可以通过选择合适的激发波长匹配目标分子的电子跃迁态，也就是SERRS进一步提高。目前，国内外还没有公开任何关于基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有简单、快速以及灵敏度高的基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法，包括以下步骤：

（1）样品处理

取新鲜鱼肉加入三氯乙酸（TCA）溶液匀浆后，在室温下振荡提取，再离心取上清液，残渣用三氯乙酸溶液重复提取1次，合并上清液定容，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液；

（2）酪胺偶氮偶联反应

在磁力搅拌和冰水浴的条件下，将质量分数为5％的NaNO₂溶液加入到等体积的由对氨基苯甲酸（PABA）按质量体积比0.9 g：100 mL的比例溶解在0.12 M HCl溶液中得到的混合液中，反应0.5-1min后，在搅拌条件下，在反应溶液中快速加入与NaNO₂溶液等体积的质量分数为6-10％Na₂CO₃溶液和2倍NaNO₂溶液体积的酪胺溶液，反应0.5-1min后，即得到酪胺衍生的偶氮化合物溶液；

（3）[email protected] NPs的合成

A．将0.25 mL浓度为10^-1 M的HAuCl₄溶液与100 mL去离子水混合并加热至沸腾，然后在剧烈磁力搅拌下快速加入1.0 mL质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，在搅拌下将溶液保持沸腾30分钟，冷却至室温后，通过0.22μm 滤膜过滤，获得粒径30-40 nm的金纳米颗粒悬浮液（Au NPs），于4℃下储存；

B. 取A步骤中合成的粒径30-40 nm的金纳米颗粒悬浮液（Au NPs）置于锥形瓶中，在磁力搅拌下加入浓度为10^-1 M 的L-抗坏血酸溶液，继续搅拌下，以1 滴/min的速率将浓度为10^-3 M 的AgNO₃溶液加入上述混合溶液中，直至溶液颜色从酒红色变为亮橙色，即合成[email protected] NPs悬浮原溶液，经浓缩至原体积的1/6-1/2后，得到[email protected] NPs溶液，其中金纳米颗粒悬浮液、L-抗坏血酸溶液和AgNO₃溶液的体积比为10：1.5：3.5；

（4）SERRS样品制备

将步骤（2）制备的酪胺衍生偶氮化合物溶液与步骤（3）制备的[email protected] NPs溶液按体积比（2-1）：（1-4）的比例混合后，滴在石英板上并置于拉曼显微镜下用于光谱检测，得到SERRS特征峰信号强度，采用线性回归方法建立酪胺浓度与特征峰信号强度之间的线性关系，根据酪胺浓度与特征峰信号强度之间的线性关系，即可计算出待测样品中酪胺的含量。

步骤（1）具体为：取10 g新鲜鱼肉，加入20 mL浓度为5wt%的三氯乙酸溶液，匀浆2min，在室温下振荡提取30 min，于8 000 r/min，4℃离心，10 min，取上清液，残渣用 20mL浓度为5 wt % 的三氯乙酸溶液重复提取1次，合并上清液，定容50 mL，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。

步骤（2）中所述的Na₂CO₃溶液的质量分数为8％。

步骤（3）中浓缩方法为：取一定体积[email protected]悬浮原溶液，8000r/min离心5min，小心移除一定量上清液，再振荡器上振荡2min，使[email protected]悬浮均匀，即得预期浓缩倍数的[email protected]溶液。

步骤（3）中浓缩至原体积为1/4倍。

步骤（4）中所述的酪胺衍生偶氮化合物溶液与所述的[email protected] NPs溶液按体积比1：4的比例混合。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测水产品中酪胺含量的方法，由于直接检测酪胺往往得不到很好的SERS信号，因此可以通过偶氮偶联反应等其他方法间接检测拉曼信号，该方法采用PABA制备的重氮离子反应，将酪胺变成相应的偶氮溶液，将所得到的偶氮溶液与制备的SERS活性基底[email protected] NPs按照一定的比例混合，进行SERRS检测，利用偶氮分子特征峰强度与酪胺浓度的相关关系对酪胺的含量进行定量分析。当酪胺浓度范围为100至0.1mg / L时，在1245cm^-1的特征峰处建立的校准曲线对应的拉曼峰强度具有良好的线性关系（R² =0.9835），得到检测限（LOD）为0.01mg/L，加标回收率在95.0％和97.5％之间，表明该方法具有非常好的重复性和准确性。此外，所提出的方法在5分钟内简单快速。

综上所述，本发明基于SERS技术的高选择性和灵敏度以及偶氮分子落在可见区的最大吸收位置，将化学衍生方法—偶氮偶联与SERRS方法结合，建立了一种简单、快速、灵敏度高的酪胺定量分析方法。

附图说明

图1为酪胺衍生偶氮化合物的合成过程；

图2为[email protected] NPs的TEM图；

图3为[email protected] NPs、100mg/L的酪胺衍生偶氮化合物、偶氮化合物与[email protected] NPs混合物以及Au NPs的紫外吸收光谱；

图4为酪胺衍生偶氮化合物SERRS检测原理的示意图；

图5为[email protected] NPs的不同浓缩倍数下酪胺衍生偶氮化合物的SERRS光谱图；

图6为[email protected] NPs的不同浓缩倍数下酪胺衍生偶氮化合物在1245 cm^-1处特征峰强度值；

图7为不同Na₂CO₃浓度下酪胺衍生偶氮化合物的SERRS光谱图；

图8为不同Na₂CO₃浓度下酪胺衍生偶氮化合物在1245 cm-1处特征峰强度值；

图9为不同酪胺衍生偶氮化合物与[email protected] NPs混合比例下的SERRS光谱图；

图10为不同酪胺衍生偶氮化合物与[email protected] NPs混合比例在1245 cm-1处特征峰强度值；

图11为不同酪胺浓度下衍生的偶氮化合物的SERRS光谱图；

图12为不同酪胺浓度下衍生的偶氮化合物在1245 cm^-1处特征峰强度值。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施方式

1、材料与仪器

材料：新鲜鲐鱼和咸鱼购于宁波路林市场。样品购买后，置于-80℃贮藏备用。除去鱼皮和鱼骨，仅保留背部肌肉作为实验材料。

试剂：对氨基苯甲酸（PABA，C₆H₇NO₃S，≥ 99.8 %），硝酸银（AgNO₃,，99.9%），亚硝酸钠（NaNO₂, ≥ 99 %），盐酸（HCl，36.46%），碳酸钠（Na₂CO₃，≥ 99.8 %）和柠檬酸钠（98%）购自国药化学品有限公司（中国上海）。盐酸酪胺（C₈H₁₁NO·HCl，98%），氯金酸（HAuCl₄，98%），L-抗坏血酸（99%）和4-巯基苯甲酸（4MBA，99%）购自Sigma-Aldrich（中国上海市）。实验过程中使用去离子水，且所有试剂均为分析试剂级。

仪器：XploRA ONE高灵敏度拉曼光谱仪（上海，中国）；JEM-2100F透射电子显微镜（东京，日本）；D-7PC紫外分光光度计（南京，中国）。

仪器参数设置：每次试验前拉曼光谱仪使用硅片（Si）在520 cm^-1 峰作为基准峰进行仪器校正。表面增强拉曼光谱采集如无特殊说明，激光波长785 nm，激光强度设置为 50%，功率 120 mW，50×目镜，曝光时间60 s，检测的光谱范围均为200 到3500 cm^-1，分辨率为1 cm^-1。样品检测过程中参数设置保持一致，每个样品至少重复3次，以得到准确的拉曼光谱结果。

2、基于偶氮偶联反应和SERRS快速检测水产品中酪胺含量的方法，包括以下步骤：

（1）样品处理方法

取10 g新鲜鱼肉，加入20 mL 5wt %三氯乙酸（TCA）溶液，匀浆2 min，在室温下振荡提取30 min，于8 000 r/min ，4℃离心，10 min，取上清液。残渣用 20mL 5 wt % TCA溶液重复提取1次，合并上清液，定容50 mL，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液；

（2）酪胺偶氮偶联反应

在磁力搅拌和冰水浴的条件下，将质量分数为5％的NaNO₂溶液加入到等体积的由对氨基苯甲酸（PABA）按质量体积比0.9 g：100 mL的比例溶解在0.12 M HCl溶液中得到的混合液中，反应0.5-1min后，在搅拌条件下，在反应溶液中快速加入与NaNO₂溶液等体积的质量分数为8％Na₂CO₃溶液和2倍NaNO₂溶液体积的酪胺溶液，反应0.5-1min后，即得到酪胺衍生的偶氮化合物溶液；如图1所示，酪胺分子含有酚基团，因此可与重氮化合物反应转化为相应的偶氮分子。由于酚类化合物对[email protected] NPs的亲和力较弱，导致SERS信号大大降低。为了提高酚类化合物和[email protected] NPs的亲和力，通过偶氮偶联反应将酪胺转化为相应的偶氮分子，以实现SERS的高灵敏度检测。图1为偶氮反应的过程示意图。简而言之， NaNO₂与HC1生成亚硝酸(HNO₂ )，在低温和强酸性条件下对氨基苯甲酸（PABA）分子的氨基(-NH₂)与HNO₂作用形成重氮正离子(-N≡N⁺ )，然后在碱性条件下-N≡N⁺再作为亲电试剂进攻酪胺从而生成相应的偶氮分子；

（3）[email protected] NPs的合成

A．将0.25mL浓度为10^-1 M的HAuCl₄溶液与100 mL去离子水混合并加热至沸腾，然后在剧烈磁力搅拌下快速加入1.0mL质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，在搅拌下将溶液保持沸腾30分钟，冷却至室温后，通过0.22μm 滤膜过滤，获得粒径30-40 nm的金纳米颗粒悬浮液（AuNPs），于4℃下储存；

B．取A步骤中合成的粒径30-40 nm的金纳米颗粒悬浮液（Au NPs）10 mL置于锥形瓶中，在磁力搅拌下加入1.5mL浓度为10^-1M 的L-抗坏血酸溶液，继续在搅拌下以1 滴/min的速率将3.5 mL浓度为10^-3M 的AgNO₃溶液加入上述混合溶液中，随着硝酸银的添加，[email protected] NPs的颜色从酒红色变为亮橙色，即合成Ag壳厚度为7 nm的[email protected] NPs悬浮原溶液，经浓缩至原体积的1/4后，得到Au @ Ag NPs溶液，其中浓缩步骤为：取一定体积[email protected]悬浮原溶液，8000r/min离心5min，小心移除一定量上清液，再振荡器上振荡2min，使[email protected]悬浮均匀，即得预期浓缩倍数的[email protected]溶液；

通过透射电子显微镜确定所得[email protected] NPs的形态。图2显示了具有球形几何形状的核壳结构的TEM图像。TEM图像清楚地显示Ag壳厚度为7nm。图3显示Au NPs和[email protected] NPs的紫外吸收光谱。最初，金纳米颗粒在520nm处具有最大吸光度。在搅拌下将3.5 mL AgNO₃加入到AuNPs中后，Ag逐步附着在Au NPs表面而生成[email protected] NP，从而在紫外吸收光谱图中看到在400nm和500nm均出现两种不同的等离子体吸收峰；

（4）SERRS样品制备

将步骤（2）制备的酪胺衍生偶氮化合物溶液与步骤（3）制备的Au @ Ag NPs溶液按体积比以1：4的比例混合，然后取3μL混合溶液滴在石英板上并置于拉曼显微镜下用于光谱检测，得到特征峰SERRS信号强度，采用线性回归方法建立酪胺浓度与特征峰强度之间的线性回归模型，根据酪胺浓度与特征峰强度之间的线性关系，即可计算待测样品中酪胺的含量。图4为酪胺衍生偶氮化合物SERRS检测原理的示意图。

二、对比结果分析

酪胺SERRS检测条件优化：设计单因素实验：[email protected] NPs悬浮原溶液浓缩倍数（2×，4×，6×，8×，10×），Na₂CO₃浓度（2%，4%，6％，8％，10％）和样品混合比例（2：1，1：1，1：4，1：6，1：10）对SERRS信号的影响因素，并设计三因素三水平的正交实验。

1、单因素试验

为了获得良好的SERRS光谱，对[email protected] NPs悬浮原溶液浓缩倍数进行优化。在不同浓缩倍数下的[email protected] NPs进行SERRS检测。实验结果表示，过高的浓缩倍数可能导致纳米粒子的聚集，使得基底不能充分地与被检测分子结合，从而导致SERRS信号的减低或减弱。图5显示了不同Au @ Ag NPs浓缩倍数下的SERRS光谱图以及图5中显示的1245cm^-1处的峰强度值。如图6所示，SERRS信号强度首先增加然后减小。当浓缩倍数为4倍时，SERRS信号达到最大强度，表明[email protected] NPs和酪胺衍生的偶氮化合物有效地混合。

由于重氮盐和苯酚之间的偶联反应通常在弱碱性介质中进行，因此使用Na₂CO₃调节反应溶液的pH值，并对Na₂CO₃的浓度进行优化。如图7和图8所示，得出Na₂CO₃的最佳质量浓度为8％。

最后对酪胺衍生偶氮化合物溶液与[email protected] NPs溶液的混合比例进行优化，分别以2：1，1：1，1：4，1：6和1：10的5种不同比例进行SERRS的检测。如图9和图10所示，当两者混合比例为1：1时，获得的SERRS信号最强。

2、正交试验

基于上述单因素实验，对[email protected] NPs悬浮原溶液浓缩倍数（2×，4×，6×），Na₂CO₃质量浓度（6％，8％，10％）和酪胺衍生偶氮化合物溶液与[email protected] NPs溶液的混合比例（2：1，1：1，1：4）设计三因素三水平的正交实验。通过分析表1中的K值，可以得出结论，[email protected] NPs浓缩倍数和混合比例对SERRS信号的影响很大。正交试验结果得出[email protected] NPs浓缩倍数、Na₂CO₃浓度和混合比例的最优条件分别为4倍，8wt％和1：4，并与单因素试验得出的最优条件进行验证。比较两次实验的结果，确定最优条件为[email protected] NPs悬浮原溶液浓缩倍数为4倍，Na₂CO₃质量浓度为8 %以及混合比例为1：4。

表1 正交试验结果表

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三、酪胺的SERRS检测的灵敏度和准确性

[email protected] NPs是一种常见的SERS底物，被引入酪胺衍生的偶氮化合物的检测中，目的是提高酪胺衍生的偶氮化合物的灵敏度。所得酪胺衍生的偶氮化合物的SERRS光谱和RR光谱存在差异，这种差异的原因是酪胺衍生的偶氮化合物的分子或官能团被吸附到金属表面。从SERRS光谱图中可观察到最强的特征峰出现在1245cm^-1处，这归因于苯环内C-C-C的伸缩振动。在1473cm^-1处的特征峰与-N=N-的伸缩振动有关。另外，1352cm^-1处的特征峰属于苯环内C-C-H的弯曲振动。在1120、1591cm^-1处的特征峰可能与酚环内的C-N伸缩振动和C-H弯曲振动有关。

将[email protected] NPs与酪胺衍生的偶氮化合物混合后，肉眼可观察到明显的胶体聚集，其诱导了SERRS信号的增强。如图11所示，所有特征峰的SERRS强度随着浓度的变化而变化。如图12所示，当酪胺浓度范围为100至0.1mg / L时，在1245cm^-1的特征峰处与对应的拉曼峰强度具有良好的线性关系，得到的线性回归方程为y=2089.55x+264.60，相关系数R ² =0.9835。根据信噪比确定该方法的检测限（LOD）为0.01mg / L。

为了验证所得标准曲线的准确性，通过在线性范围内制备不同浓度的三个样品来进行回收率实验。如表2所示，加标回收率在95％和97.5％之间，并且实现了SERRS检测的再现性（RSD <10％）。通过回收率和精密度试验，该方法具有很好的重复性和准确性。

表 2应用拉曼峰强度所得到的回收率和预测值实验

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四、方法验证

表3比较了SERRS法与近几年来常用的检测酪胺方法。通过表格数据比较得出SERRS方法的检出限与其他测定方法相近。与其他具有高成本设备和样品处理时间长等缺点的酪胺检测方法相比，结合偶氮偶联反应的SERRS法具有简便、快速、低检测限等优点。通过HPLC方法验证SERRS法。表4展示了两种检测方法的结果。与HPLC相比，所开发的方法更快更简单，且能达到令人满意的定性和定量目的。因此，SERRS方法是一种用于测量食品中酪胺的经济有效的方法。

表3 几种常见的酪胺含量测定方法的比较

UPLC方法参考文献，HS-SPME-MIR-IMS方法参考文献，SERRS方法如上述具体实施例一所述。

[1] Zhang H , Yin C , Xu L , et al. An improved determination methodfor tyramine in foods using ultra-high performance liquid chromatography withbenzylamine as internal standard[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2019。

[2] Parchami R , Kamalabadi M , Alizadeh N . Determination ofbiogenic amines in canned fish samples using head-space solid phasemicroextraction based on nanostructured polypyrrole fiber coupled to modifiedionization region ion mobility spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2017, 1481:37-43。

表4 比较两种方法的检测结果

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由上可知，本发明开发了一种基于偶氮偶联反应和表面增强共振拉曼散射检测食品中酪胺含量的方法，该方法利用酪胺的偶氮偶联反应在[email protected] NPs和酪胺之间形成“桥”，具有通用性、高选择性和简便快速的优点。通过用PABA制备的重氮离子，将酪胺转化成相应的偶氮分子，再进行SERRS测试。通过正交试验对酪胺的SERRS检测条件进行优化，优化结果为[email protected] NPs悬浮原溶液浓缩倍数为4倍、Na₂CO₃质量浓度为8 %，以及酪胺衍生偶氮化合物与[email protected] NPs的混合比例为1：4。当酪胺浓度范围为100至0.1mg / L时，在特征峰1245cm^-1对应拉曼峰强度与相应的酪胺浓度具有良好的线性关系（R² = 0.9835）。得到检测限（LOD）为0.01mg / L，且加标回收率在95.0％和97.5％之间，表明该方法具有非常好的重复性和准确性。此外，在5分钟内即可完成偶氮偶联反应，显示出方法简单快速的优点。与先前报道的方法相比，所开发的方法为酪胺的检测提供了简单、快速、高灵敏度的优点。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。