阅读说明：本技术 杀线虫剂的协同组合物 (Synergistic composition of nematicides ) 是由 韦尼·波利内尼 亚历杭德罗卡尔德隆·乌雷亚 格伦达·W·波洛茨克 于 2018-03-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种杀线虫剂的协同组合物,所述杀线虫剂包括衍生自包括至少两种胜肽的CED-4蛋白序列的一杀线虫胜肽。所述杀线虫肽在1毫克/毫升的浓度下单独显示出100％的杀线虫活性,而所述以1：1的比例组合的至少两种胜肽在低至0.8毫克/毫升的浓度下显示出100％杀线虫活性并产生一协同作用。由于所述协同杀线虫组合物在100％的活性下所需要的胜肽的浓度少了20％,因此所述协同杀线虫组合物是高度经济的,此外,所述协同杀线虫组合物对环境安全的且对人及动物无毒。(The present invention provides a synergistic composition of nematicides comprising a nematicidal peptide derived from a CED-4 protein sequence comprising at least two peptides. The nematicidal peptides show 100% nematicidal activity alone at a concentration of 1 mg/ml, whereas the nematicidal peptides show 100% nematicidal activity at a concentration of 1: 1 at concentrations as low as 0.8 mg/ml, show 100% nematicidal activity and produce a synergistic effect. The synergistic nematicidal composition is highly economical since it requires 20% less concentration of peptide at 100% activity, and moreover, it is environmentally safe and non-toxic to humans and animals.)

杀线虫剂的协同组合物

技术领域

本发明涉及多种杀线虫剂，其在农业领域中用于杀死多个植物寄生虫的多个组合物，特别是多个线虫。更具体地，本发明涉及一种杀线虫剂的一协同组合物，所述协同组合物包括源自于CED-4蛋白的多个杀线虫胜肽。

背景技术

线虫为农业的一主要威胁，由于线虫对产量造成多个严重的损失，从而对经济产生一重大影响。众所周知，线虫为仅次于昆虫会对例如西红柿及其他蔬菜、柑橘类水果、土豆、大米、椰子、小麦及其他谷物、观赏植物等农作物造成严重的破坏。线虫单独或与其他土壤微生物结合已被发现会侵袭植物的几乎每个部分，包括：根、茎、叶、果实及种子。线虫在全球导致的一预测产量损失为12.3％($1570亿美元)，其中有4030万美元被报导为来自印度(Singh等人，2015)。

根结线虫属于根结线虫属，根结线虫属为在园艺及农作物上对经济造成最大破坏的多个植物寄生线虫的三个属之一，根结线虫属是多种植物的根部的专性寄生虫；而南方根结线虫为全球主要的害虫之一。

多个杀线虫剂是用于杀死所述多个植物寄生虫、所述多个线虫的多个组合物，所使用的大多数杀线虫剂是对人类有高毒性且也对有用的土壤细菌有害的多个化学组合物。多种杀线虫剂还显示出污染地下水，并导致臭氧层的消耗。一著名的杀线虫剂甲基溴在包括美国及印度在内的多个国家中被禁止使用。另一广泛用于农作物的高毒性杀线虫剂为呋喃丹；一单一颗粒的呋喃丹可以在几分钟内杀死鸟类。例如福瑞松等的多个杀线虫剂很容易穿过土壤进入地下水并污染地下水。

与多个化学杀线虫剂有关的多个严重缺点使得必须开发多种用于防治多个线虫的新技术。所述方法中的一个是生成表达抗线虫性的多个转殖基因的转基因植物品系。然而，这是耗时且昂贵的方法，需要大量的先前研究活动。在包括印度在内的许多国家，基于一些道德、伦理及未见的环境问题而强烈反对引入多个转基因品系。

一种有效的方法涉及生成多个杀线虫剂的多个组合物，其对环境安全、无毒并且易于生成及使用。

US9125413B1描述了源自于秀丽隐杆线虫的CED-4蛋白的多个胜肽，具有强大的杀线虫活性。CED-4蛋白由SEQ ID NO.1组成，属于凋亡蛋白家族。所述SEQ ID NO.1包括：

MLCEIECRALSTAHTRLIHDFEPRDALTYLEGKNIFTEDHSELISKMSTRLERIANFLRIYRRQASELGPLIDFFNYNNQSHLADFLEDYIDFAINEPDLLRPVVIAPQFSRQMLDRKLLLGNVPKQMTCYIREYHVDRVIKKLDEMCDLDSFFLFLHGRAGSGKSVIASQALSKSDQLIGINYDSIVWLKDSGTAPKSTFDLFTDILLMLKSEDDLLNFPSVEHVTSVVLKRMICNALIDRPNTLFVFDDVVQEETIRWAQELRLRCLVTTRDVEISNAASQTCEFIEVTSLEIDECYDFLEAYGMPMPVGEKEEDVLNKTIELSSGNPATLMMFFKSCEPKTFEKMAQLNNKLESRGLVGVECITPYSYKSLAMALQRCVEVLSDEDRSALAFAVVMPPGVDIPVKLWSCVIPVDICSNEEEQLDDEVADRLKRLSKRGALLSGKRMPVLTFKIDHIIHMFLKHVVDAQTIANGISILEQRLLEIGNNNVSVPERHIPSHFQKFRRSSASEMYPKTTEETVIRPEDFPKFMQLHQKFYDSLKNFACC。

源自于SEQ ID NO.3的三种胜肽已显示出在约1毫克/毫升(mg/ml)的多个有效浓度下具有杀线虫活性，所述多个胜肽包括以下多个序列：

1)胜肽2，由15个氨基酸DLLRPVVIAPQFSRQ(99至113个氨基酸序列段，SEQ IDNO.2)组成，

2)胜肽3，由19个氨基酸RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(112至130个氨基酸序列段，SEQ IDNO.3)组成，及

3)胜肽12，由12个氨基酸FPKFMQLHQKFY(529至540个氨基酸序列段，SEQ ID NO.4)组成。

然而，多个胜肽的合成是一昂贵的技术，并且为了使一组合物具有成本效益，人们需要降低生产成本。通常地，在10至20个氨基酸之间的范围内合成50毫克(mg)的胜肽的成本在$25,000至30,000印度卢比及$240至250美元之间。因此，制备降低生产成本的多个组合物十分重要。

本发明考虑了现有技术的多个缺点，并且提供了一种使用多个抗寄生虫胜肽，所述多个抗寄生虫胜肽无毒且对环境安全。

本发明的目的：

因此，本发明的主要目的是提供一种含有多个杀线虫胜肽的一杀线虫剂的一组合物。

本发明的另一个目的是提供一种协同杀线虫组合物，其包括：源自于如SEQ IDNO.1所述的CED-4蛋白的两种胜肽，所述两种胜肽由以下多个氨基酸序列组成：

a.DLLRPVVIAPQFSRQ(SEQ ID NO.2)，

b.RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(SEQ ID NO.3)，及

c.FPKFMQLHQKFY(SEQ ID NO.4)。

本发明的另一目的为提供一种显示杀线虫活性的协同杀线虫组合物，所述多个胜肽的浓度小于1毫克/毫升。

本发明的另一目的是提供一种具有降低生产成本的协同杀线虫组合物。

本发明的另一目的是提供一种对人类无毒的协同杀线虫组合物。

本发明的另一目的是提供一种不具有广谱活性且对多个土壤微生物无害的协同杀线虫组合物。

本发明的另一目的是提供一种易于合成、不需要产生多个转基因植物并且非常经济的协同杀线虫组合物。

发明内容

本发明涉及一种杀线虫剂的一组合物，其用于农业目的，以杀死多个植物寄生虫，特别是多个线虫。更具体地，本发明涉及一种杀线虫剂的协同组合物，所述协同组合物包括多个杀线虫胜肽。

在本发明的主要实施例中，本发明提供了一种杀线虫剂的组合物，其包括：源自于如SEQ ID NO.1所述的CED-4蛋白的多个胜肽。更特别地，所述组合物包括至少两种胜肽的一协同组合，所述至少两种胜肽由以下多个氨基酸序列组成：

a.DLLRPVVIAPQFSRQ(SEQ ID NO.2)，胜肽2，其包括15个氨基酸，

b.RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(SEQ ID NO.3)，胜肽3，其包括19个氨基酸，及

c.FPKFMQLHQKFY(SEQ ID NO.4)，胜肽12，其包括12个氨基酸。

所述多个胜肽在低至1毫克/毫升的多个浓度下分别显示出100％杀线虫活性。

然而，所述至少两种胜肽的组合以一协同的方式作用，对于100％杀线虫活性，所述多个胜肽中每一个的浓度可降低至0.4毫克/毫升。显着减少活性所需的胜肽的用量而大幅降低了生产成本，从而使独特的组合物非常经济。

附图说明

图1示出了在多个96孔盘中的包括胜肽2与胜肽3；胜肽2与胜肽12；胜肽3与胜肽12；及胜肽2、3及12的混合物对多个线虫进行处理的效果的一图表。

具体实施方式

现在将在下文中更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解释为限制于在此阐述的实施例，而是提供所述实施例使得本揭露将是透彻的，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。

本发明涉及一种具有杀死多个植物寄生虫的能力的协同组合物，特别是多个线虫。更特别地，本发明涉及一种包含多个杀线虫胜肽的一杀线虫剂的一协同组合物，所述多个胜肽源自于所述CED-4蛋白序列。

在本发明的主要实施例中，本发明提供了一杀线虫剂的一协同组合物，其包括：源自于如SEQ ID NO.1所述的CED-4蛋白的至少两种胜肽。更特别地，所述组合物包括以下多个胜肽的组合：

a.胜肽2，长度为15个氨基酸的一胜肽，包括：DLLRPVVIAPQFSRQ序列(SEQ IDNO.2)，

b.胜肽3，长度为19个氨基酸的一胜肽，包括：RQMLDRKLLLGNVPKQMTC序列(SEQ IDNO.3)，及

c.胜肽12，长度为12个氨基酸的一胜肽，包括：FPKFMQLHQKFY序列(SEQ ID NO.4)；

含有SEQ ID NO.2至4的多个氨基酸的至少两种胜肽以一比例为1：1作为一高效杀线虫剂，在多个总胜肽浓度低至0.8毫克/毫升时显示100％的杀线虫活性。所述两种胜肽的组合带来一协同作用，并且与多个单独的单个胜肽相比，所述组合在一较低的浓度下起作用。所述协同组合物降低了所需的总胜肽浓度的20％，从而使本发明非常经济。而且所述组合物比其他现有方法对环境更安全，并且与具有多个杀线虫活性的多个转基因品系相比，所述组合物较容易生成。

示例1–所涉及的多个步骤：

A)南方根瘤线虫的繁殖

多个番茄植株接种了多个南方根瘤线虫(M.incognita)的幼虫，并保持在一生长室中。至少两个月后，从所述多个根中提取南方根瘤线虫卵进行多个实验，下面说明了提取南方根瘤线虫卵的步骤。

所述多个根部组织可以使用一手术刀片及一观察镜而用手切碎，也可以使用一食物加工机来切碎，然后将所述切碎的组织放置在一瓶子中，并用一10％稀释的漂白剂洗涤。然后在多个无菌条件下，将所述根部溶液倒入多个筛子中(顶部为60号筛子，底部为500号筛子)。从所述500号筛子的底部收集粗虫卵，并在15毫升的猎鹰(Falcon)管中分别放入5毫升的漂白剂及虫卵混合物。然后将5毫升的70％的蔗糖溶液放置在每一猎鹰管中，然后将1毫升的双重蒸馏无菌水层轻轻地放置在每一猎鹰管中的多个蔗糖混合物上。然后将所述多个样品以1200每分钟转速(rpm)离心5分钟。将悬浮在所述蔗糖溶液及1毫升的水层之间的多个胚胎从每一猎鹰管中总共收集3毫升(3毫升的所述溶液的顶层)收集到多个新的15毫升的猎鹰管中，加入10毫升的5％漂白剂溶液，并将所述多个虫卵进行涡旋振荡10分钟。然后将所述猎鹰管以2000rpm离心5分钟。然后除去上清液，并将所述多个虫卵在10毫升的无菌双重蒸馏水中漂洗，并在2000rpm下再次离心5分钟。所述过程再重复两次。在最后的洗涤后，去除5毫升的上清液，而将剩余的5毫升水与所述多个虫卵混合，并放置在一个5毫升的培养皿中。然后将所述多个虫卵放置在25至27℃的一培养箱中，约10天后孵化出多个幼虫(J2期)，将所述幼虫保存在25至27℃的恒温箱中进行保存。

B)制备多个测试溶液及放置多个线虫

将多个冻干的胜肽溶解于所需的数量的双重蒸馏水中，以达到多个所需浓度。

将100微升的具有多个所需的浓度的所述多个胜肽溶液吸移到一96孔盘的30孔中，然后从提取的J2期的南方根瘤线虫的一储备液中将一幼虫转移到每一孔中。对于一阴性对照组，在每一实验中，将30只幼虫放置100微升的在无菌双重蒸馏水。

C)监测多个线虫

所述生物测定法旨在测试所述多个胜肽及查耳酮类化合物杀死所述多个幼虫的能力(死亡率％)。每一测试均在一96孔盘中进行，每一孔中都有一线虫(共30孔)。所述多个线虫在所述多个处理溶液中温育5天。通过在以一探针进行干扰后检查每一线虫的运动，在一解剖显微镜下检查所述多个线虫的活力。

示例2-包含多个杀线虫胜肽的组合的杀线虫组合物的功效：

如图1所示，在水中温育的J2期的幼虫线虫在第5天导致约10至20％的多个线虫死亡，以此作为一阴性对照组。将多个幼虫线虫温育在浓度为0.8毫克/毫升的单独的胜肽2、胜肽3或胜肽12中，在第5天导致大约60至66％的多个幼虫线虫死亡。然而，在包括一比例为1：1的的胜肽2与胜肽3、胜肽2与胜肽12、或胜肽3与胜肽12的一组合的所述杀线虫组合物在第5天导致多个幼年线虫的接近100％死亡，所述多个胜肽的所述总浓度为0.8毫克/毫升。此外，以一比例为1：1：1的胜肽2、3及12的所述组合也在第5天导致多个幼年线虫的100％死亡。

所述多个结果表明，源自于CED-4蛋白的所述多个胜肽彼此组合时协同地作用为一杀线虫组合物。

序列表

<110> 特鲁里斯生物科技印度私人有限公司

<120> 杀线虫剂的协同组合物

<130> P.1505.IB

<150> 201741009365

<151> 2017-03-17

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 549

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 1

Met Leu Cys Glu Ile Glu Cys Arg Ala Leu Ser Thr Ala His Thr Arg

1 5 10 15

Leu Ile His Asp Phe Glu Pro Arg Asp Ala Leu Thr Tyr Leu Glu Gly

20 25 30

Lys Asn Ile Phe Thr Glu Asp His Ser Glu Leu Ile Ser Lys Met Ser

35 40 45

Thr Arg Leu Glu Arg Ile Ala Asn Phe Leu Arg Ile Tyr Arg Arg Gln

50 55 60

Ala Ser Glu Leu Gly Pro Leu Ile Asp Phe Phe Asn Tyr Asn Asn Gln

65 70 75 80

Ser His Leu Ala Asp Phe Leu Glu Asp Tyr Ile Asp Phe Ala Ile Asn

85 90 95

Glu Pro Asp Leu Leu Arg Pro Val Val Ile Ala Pro Gln Phe Ser Arg

100 105 110

Gln Met Leu Asp Arg Lys Leu Leu Leu Gly Asn Val Pro Lys Gln Met

115 120 125

Thr Cys Tyr Ile Arg Glu Tyr His Val Asp Arg Val Ile Lys Lys Leu

130 135 140

Asp Glu Met Cys Asp Leu Asp Ser Phe Phe Leu Phe Leu His Gly Arg

145 150 155 160

Ala Gly Ser Gly Lys Ser Val Ile Ala Ser Gln Ala Leu Ser Lys Ser

165 170 175

Asp Gln Leu Ile Gly Ile Asn Tyr Asp Ser Ile Val Trp Leu Lys Asp

180 185 190

Ser Gly Thr Ala Pro Lys Ser Thr Phe Asp Leu Phe Thr Asp Ile Leu

195 200 205

Leu Met Leu Lys Ser Glu Asp Asp Leu Leu Asn Phe Pro Ser Val Glu

210 215 220

His Val Thr Ser Val Val Leu Lys Arg Met Ile Cys Asn Ala Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Pro Asn Thr Leu Phe Val Phe Asp Asp Val Val Gln Glu Glu

245 250 255

Thr Ile Arg Trp Ala Gln Glu Leu Arg Leu Arg Cys Leu Val Thr Thr

260 265 270

Arg Asp Val Glu Ile Ser Asn Ala Ala Ser Gln Thr Cys Glu Phe Ile

275 280 285

Glu Val Thr Ser Leu Glu Ile Asp Glu Cys Tyr Asp Phe Leu Glu Ala

290 295 300

Tyr Gly Met Pro Met Pro Val Gly Glu Lys Glu Glu Asp Val Leu Asn

305 310 315 320

Lys Thr Ile Glu Leu Ser Ser Gly Asn Pro Ala Thr Leu Met Met Phe

325 330 335

Phe Lys Ser Cys Glu Pro Lys Thr Phe Glu Lys Met Ala Gln Leu Asn

340 345 350

Asn Lys Leu Glu Ser Arg Gly Leu Val Gly Val Glu Cys Ile Thr Pro

355 360 365

Tyr Ser Tyr Lys Ser Leu Ala Met Ala Leu Gln Arg Cys Val Glu Val

370 375 380

Leu Ser Asp Glu Asp Arg Ser Ala Leu Ala Phe Ala Val Val Met Pro

385 390 395 400

Pro Gly Val Asp Ile Pro Val Lys Leu Trp Ser Cys Val Ile Pro Val

405 410 415

Asp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Val Ala Asp

420 425 430

Arg Leu Lys Arg Leu Ser Lys Arg Gly Ala Leu Leu Ser Gly Lys Arg

435 440 445

Met Pro Val Leu Thr Phe Lys Ile Asp His Ile Ile His Met Phe Leu

450 455 460

Lys His Val Val Asp Ala Gln Thr Ile Ala Asn Gly Ile Ser Ile Leu

465 470 475 480

Glu Gln Arg Leu Leu Glu Ile Gly Asn Asn Asn Val Ser Val Pro Glu

485 490 495

Arg His Ile Pro Ser His Phe Gln Lys Phe Arg Arg Ser Ser Ala Ser

500 505 510

Glu Met Tyr Pro Lys Thr Thr Glu Glu Thr Val Ile Arg Pro Glu Asp

515 520 525

Phe Pro Lys Phe Met Gln Leu His Gln Lys Phe Tyr Asp Ser Leu Lys

530 535 540

Asn Phe Ala Cys Cys

545

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 2

Asp Leu Leu Arg Pro Val Val Ile Ala Pro Gln Phe Ser Arg Gln

1 5 10 15

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 3

Arg Gln Met Leu Asp Arg Lys Leu Leu Leu Gly Asn Val Pro Lys Gln

1 5 10 15

Met Thr Cys

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 4

Phe Pro Lys Phe Met Gln Leu His Gln Lys Phe Tyr

1 5 10