阅读说明：本技术 用于造血干细胞移植的组合物和方法 (Compositions and methods for hematopoietic stem cell transplantation ) 是由 伊凡·K·迪莫夫 纳撒尼尔·弗恩霍夫 凯文·希恩 于 2018-03-15 设计创作，主要内容包括：本公开内容提供了形成在造血干/祖细胞移植中有用的药物组合物的独特的治疗性细胞群。例如,本公开内容提供了治疗性细胞群,其包括造血干/祖细胞、记忆T细胞、调节性T细胞的富集群,并且其中所述细胞群耗尽幼稚常规αβ-T细胞。本公开内容还提供了使用治疗性细胞群的治疗方法。在其他实施方案中,本公开内容提供了产生治疗性细胞群的方法。(The present disclosure provides unique therapeutic cell populations that form pharmaceutical compositions useful in hematopoietic stem/progenitor cell transplantation. For example, the present disclosure provides a therapeutic cell population comprising an enriched population of hematopoietic stem/progenitor cells, memory T cells, regulatory T cells, and wherein the cell population is depleted of naive conventional α β -T cells. The present disclosure also provides methods of treatment using the therapeutic cell populations. In other embodiments, the present disclosure provides methods of generating a therapeutic cell population.)

用于造血干细胞移植的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2017年3月15日提交的美国临时申请号62/471,769的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

背景技术

同种异体造血干细胞移植(HSCT)通常涉及在预处理方案后将造血细胞从免疫相容的健康人(供体)转移到患者。健康的造血干细胞(HSC)可以替代患者受损的造血组织，而来源于特定供体的免疫细胞可以对癌症、感染和免疫疾病具有治疗作用。然而，目前的同种异体HSCT方法要么包括细胞的异质混合物，其包括污染的非治疗性细胞，要么包括纯化但有限的细胞混合物，其缺乏完整移植物的潜在治疗益处。在前一种情况下，尽管许多污染治疗相关细胞的非治疗性细胞是无害的，但即使是一小部分特定的异常细胞类型也可能对接受者造成严重的不良后果。例如，污染移植细胞群的残留肿瘤细胞或畸胎瘤起始细胞可以在患者体内播种肿瘤。在另一个示例中，循环T细胞的亚群可以引发移植物抗宿主病(GVHD)，这是同种异体HSCT的严重且通常致命的并发症。在这些情况下，由污染细胞引起的病理学取代了在移植过程中引入的其他T细胞的治疗益处。在许多情况下，同种异体HSCT是一种针对根本病症的治愈疗法，然而，当污染的移植细胞对其新宿主环境产生反应时，确实是对患者有害的医学治疗。因此，迫切需要具有较少有害细胞和最佳治疗性细胞混合物的HSC移植物组合物。

发明内容

在本文公开的一些实施方案中是药物组合物，其包含一个或多个单位剂量的细胞移植物，其中每一单位剂量的细胞移植物包括接受该细胞移植物的受试者的每千克(kg)体重的治疗性细胞群。在一些实施方案中，每个单位剂量的治疗性细胞群包含超过3x 10⁵个造血干/祖细胞(HSPC)、超过3x 10⁵个记忆T细胞(Tmem)、超过5x 10⁵个调节性T细胞(Treg)和少于3x 10⁵个幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，单位剂量还包含0.5x 10³至2000x10³个恒定自然杀伤T细胞(iNKT)。在一些实施方案中，HSPC是CD34⁺，Tmem是CD3⁺CD45RA^-CD45RO⁺，Treg是CD4⁺CD25⁺CD127^-/lo、CD45RA⁺或其组合，并且幼稚常规αβ-T细胞是CD3⁺CD45RA⁺CD25^-Va24Ja18^-。在一些实施方案中，iNKT是CD3⁺Vα24Jα18⁺。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含富集了HSPC、记忆T细胞(Tmem)和Treg的治疗性细胞群，并且其中该细胞群耗尽幼稚常规αβ-T细胞，其中治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与Treg之比小于1:5。在一些实施方案中，药物组合物还包含恒定iNKT，并且治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与iNKT之比小于100:1。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与HSPC之比小于1:400；以及幼稚常规αβ-T细胞与Tmem之比小于1:800。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含iNKT，并且治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与HSPC之比小于1:400；幼稚常规αβ-T细胞与Tmem之比小于1:800；以及幼稚常规αβ-T细胞与iNKT之比小于100:1。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与HSPC之比小于1:400。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含幼稚常规αβ-T细胞与Tmem之比小于1:3。

在一些实施方案中，本文公开的是治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗性细胞群，其中该治疗性细胞群包含浓度为1.0x 10⁶至50x 10⁶个细胞/kg受试者体重的HSPC，浓度为0.1x 10⁶至1000x 10⁶个细胞/kg受试者体重的Tmem，浓度为0.1x10⁶至1000x 10⁶个细胞/kg受试者体重的Treg以及浓度低于3x 10⁵个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞群还包含浓度为0.5x 10³至2000x 10³个细胞/kg受试者体重的iNKT细胞。

在一些实施方案中，本文公开了产生药物组合物的方法，该方法包括通过以下步骤处理至少一个样品以提供治疗性细胞群：

A.在一定条件下使样品与特异性结合CD34的结合分子接触以提供富集CD34⁺细胞的群和CD34耗尽的细胞群，回收富集CD34⁺细胞的群，并回收CD34耗尽的细胞群；和

B.在一定条件下使CD34耗尽的细胞群与特异性结合CD25的结合分子接触以提供富集CD25⁺细胞的群和CD25耗尽的细胞群，回收富集CD25⁺细胞的群，并回收CD25耗尽的细胞群；和

C.在一定条件下使CD25耗尽的细胞群与特异性结合CD45RA的结合分子接触以提供富集CD45RA⁺细胞的群和CD45RA耗尽的细胞群，并回收CD45RA耗尽的细胞群；以及

D.将富集CD34⁺细胞的群、富集CD25⁺细胞的群和CD45耗尽的细胞群配制为适合施用于受试者的药物组合物。

附图说明

图1A-B：图1A显示了产生塑造的(sculpted)移植细胞组合物的方法的示意图。图1B显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图2A-B：图2A显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。图2B显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图3显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图4显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图5显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图6显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图7显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图8显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图9显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图10显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图11显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图12显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图13显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图14显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图15显示了产生塑造的移植细胞组合物的方法的示意图。

图16描绘了用于评估塑造的细胞移植物与骨髓移植(BMT)组合物和造血干细胞移植(HSCT)组合物相比的表现的实验设计。

图17A-D显示了与骨髓移植(BMT)组合物和造血干细胞移植(HSCT)组合物相比，塑造的细胞移植物的表现。图17A。存活率随时间的Kaplan-Meier曲线。图17B。以总体存活、复发、移植失败和GVHD评估的最终结果。图17C。从HSCT小鼠解剖的脾脏中J774 GPF-Luc肿瘤的示例性显微照片。图17D。比较GFP+细胞的存在的代表性生物发光图像，其在第+10天使用Xenogen IVIS100生成。

图18描绘了与仅用MACS产生的塑造细胞移植物相比，用磁性分选(MACS)和荧光激活分选(FACS)产生的塑造细胞移植物所治疗的小鼠的存活率的Kaplan-Meier曲线。

图19描绘了Kaplan-Meier曲线，其显示了被施用塑造细胞移植物的小鼠相对于被施用包括分离后加回的T细胞的CD34⁺细胞组合物的小鼠的存活。

图20描绘了Kaplan-Meier曲线，其显示了过继移植的异种移植模型中的存活小鼠，其中给小鼠队列施用人PBMC或源自人组织的塑造的细胞移植物组合物。

图21A-B描绘了使用MACS从外周血单核细胞(PBMC)富集调节性T细胞和iNKT细胞。图21A显示了流式细胞术数据，其显示了预分选PBMC和富集群中Treg的％纯度和％产率。图21B显示了流式细胞仪数据，其显示了预分选PBMC和富集群中iNKT细胞的％纯度和％产率。

图22A-B描绘了使用磁性分选从PBMC富集记忆T细胞。图22A显示了使用PBMC的磁性分选产生的CD3⁺CD45RO⁺细胞的％产率和幼稚T细胞与记忆T细胞之比。图22B显示了流式细胞术数据，其显示了合并的PBMC和耗尽CD45RA的样品中的CD45RO和CD45RA细胞。

图23A-B描绘了CD25⁺细胞的磁性分离。图23A显示了磁性分离的CD25⁺细胞的流式细胞术分析，证明了CD25+CD127+Treg的有效分离，并表征了记忆Treg细胞和幼稚Treg细胞的亚群。图23B显示了针对来自两个供体的Treg和幼稚Treg的磁性分离策略的示例性表现。

图24A-B描绘了6B11抗体的生物素化滴定。图24A显示了6B11抗体的浓度从零增加到1μg/μL时，6B11.1、6B11.2和6B11.3生物素化抗体与三个独立供体的样品的结合。图24B显示了使用无6B11对照或6B11抗体对样品进行6B11生物素/链霉亲和素PE-Cy7染色和CD127 APC染色的流式细胞仪分析，该抗体用生物素以100μM(条件1)、250μM(条件2)或1mM(条件3)进行生物素化。

具体实施方式

在某些实施方案中，本公开内容提供了形成在造血干/祖细胞移植中有用的药物组合物的独特的治疗性细胞群。例如，本公开内容的一些实施方案提供了治疗性细胞群，其包括造血干/祖细胞(HSPC)、记忆T细胞(Tmem)、调节性T细胞(Treg)的富集的群，并且其中细胞群耗尽幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞群还包含恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。本公开内容还提供了使用治疗性细胞群的治疗方法。在其他实施方案中，本公开内容提供了产生治疗性细胞群的方法。

塑造治疗性细胞群以富集具有治疗益处的细胞的数目，并耗尽对移植接受者有害(例如，诱发继发性疾病)的细胞群。HSPC为血液和免疫系统功能的重建带来短期益处，如恢复红细胞、血小板和嗜中性粒细胞计数。HSPC的持久移植通过产生T细胞群和B细胞群来重建适应性免疫功能。供体T细胞作为总体群对移植既有利又有弊。Tmem细胞提供益处，因为Tmem介导移植物抗感染作用以及移植物抗白血病作用，伴有较低的移植物抗宿主疾病(GVHD)风险。幼稚Treg细胞和记忆Treg细胞提供了益处，因为Treg有助于防止移植物排斥和GVHD。相反，幼稚常规T细胞是GVHD和不当免疫重建的原因。因此，减少或消除本文公开的塑造的移植物中的幼稚常规T细胞通过降低移植物接受者中GVHD的发生率而增强治疗益处。

定义

在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另有说明，否则本文所述的与任何物理特征，如聚合物亚基、大小或厚度有关的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”是指所指示的范围、值或结构的±20％。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，或者不实质性地影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。应理解，如本文所用，术语“一”和“一个”是指“一个或多个”所列举的组分。替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案之一，两者或其任何组合。如本文所用，术语“包括”、“具有”和“包含”被同义地使用，这些术语及其变体旨在被解释为非限制性的。

如本文所用，术语“治疗性细胞”是指基于细胞向受试者提供治疗益处的能力而选择或施用于受试者的细胞。示例性治疗性细胞包括造血干/祖细胞、记忆T细胞、调节性T细胞和恒定自然杀伤T细胞。治疗性细胞群可以包括一种以上类型的治疗性细胞，例如，HSPC、Tmem、Treg、iNKT或其任何组合。治疗性细胞群可基本上包含单一治疗性细胞类型。在治疗性细胞群的背景下，治疗性细胞的百分比(％)指包含在治疗性细胞的组合或组合物中的细胞类型的百分比，其中治疗性细胞的总数合计为100％，并且特定的治疗性细胞类型代表治疗性细胞总数的一部分。例如，包含30％HSPC的治疗性细胞群表明，总的治疗性细胞群中约30％是HSPC。治疗性细胞群可以存在于对受试者有中性作用的更大细胞群中，并且该中性细胞不包括在总治疗性细胞的计算中。

如本文所用，术语“造血干/祖细胞”或“HSPC”是指相对于其他类型的造血细胞，表达更高水平的表型标志物CD34、CD133、CD90或其任何组合的造血干细胞和/或造血祖细胞(例如，如通过流式细胞术、蛋白质印迹或本领域已知的其他方法所确定的，这些细胞对该表型标志物的表达是阳性的)。此外，相对于其他类型的造血细胞，HSPC对于表达的标志物可能是阴性的。例如，此类标志物包括CD19、TCRα、TCRβ、CD45RA、Lin、CD38或其任何组合。优选地，HSPC是CD34⁺细胞和/或CD19^-TCRα^-。HSPC可以自我更新或分化为(i)髓样祖细胞，其最终产生单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板或树突状细胞；或(ii)淋巴样祖细胞，其最终产生T细胞、B细胞和称为自然杀伤细胞(NK细胞)的淋巴细胞样细胞。有关造血和HSPC分化的一般性讨论，请参见Rowe等人,Cell Stem Cell.2016.18:707-720。

如本文所用，术语“幼稚常规αβ-T细胞”或“幼稚Tcon”是指表达表型标志物TCRα/β、CD45RA并表达中至高水平的CD127(CD127⁺)但不表达或低表达CD45RO和CD25的未经历抗原的T细胞。在一些实施方案中，幼稚Tcon的特征在于幼稚Tcon的表型标志物的表达，包括TCRα、TCRβ、CD3、CD4或CD8、CD62L、CCR7、CD28、CD127和CD45RA。在一些实施方案中，幼稚Tcon是CD3⁺CD25^-CD45RA⁺，并且包含多态TCRα和多态TCRβ。在一些实施方案中，如本文定义的，幼稚Tcon不是幼稚T调节细胞。幼稚Tcon细胞不表达在iNKT细胞上发现的Vα24Jα18TCR。

如本文所用，术语“调节性T细胞”或“Treg”是指能够抑制自身免疫反应并表达表型标志物CD4、CD25但不表达或低表达的CD127的T细胞的亚类。Treg还表达FOXP3，然而，已证明CD127表达与CD4⁺CD25⁺细胞上的FOXP3表达呈负相关，并且CD4⁺CD25⁺CD127^-/low表型被认为是Treg的可接受替代标志物，并且是FOXP3的细胞内染色的实际替代方案(Cozzo C,等人,J Immunol.2003年12月1日；171:5678-82；Liu W,等人,J Exp.Med.2006.203(7):1701–1711；Seddiki N,等人,J Exp.Med.2006；203(7):1693–1700)。Treg可以包括至少两个亚类，在本文中被称为幼稚Treg和记忆Treg。

如本文所用，术语“幼稚Treg”是未经历抗原的调节性T细胞，其作为主要细胞表达表型标志物CD4、CD25和CD45RA，但不表达或低表达CD45RO和CD127。幼稚Treg具有优势，因为与经历过抗原的Treg相比，该细胞对抗原的响应具有更高的可塑性。此外，与经历过抗原的Treg相比，幼稚Treg的寿命更长。

如本文所用，术语“记忆Treg”是经历过抗原的调节性T细胞，其能够对自身免疫提供抑制作用，并表达表型标志物CD4、CD25和CD45RO，但不表达或低表达CD127和CD45RA。

如本文所用，术语“记忆T细胞”或“Tmem”是指表达表型标志物TCRα、TCRβ、CD3、CD4或CD8、CD95和IL-2Rβ的经历过抗原的T细胞。记忆T细胞提供免疫力，且能够在非活动状态下长期保留。记忆T细胞在再次受到抗原攻击后能够迅速获得效应功能。记忆T细胞群可以包括T中枢记忆细胞(T_CM)亚类和T效应记忆细胞(T_EM)亚类的任何组合。

如本文所用，“T中枢记忆细胞”或“T_CM”指与幼稚Tcon细胞相比，表达表型标志物CD4或CD8、CD62L、CD45RO、CCR7、IL-2Rβ、CD28、CD127和CD95但不表达或低表达CD45RA的经历过抗原的T细胞。抗原重新攻击后，中枢记忆T细胞可分化为T_EM细胞。

如本文所用，“T效应记忆细胞”或“T_EM”是指表达表型标志物CD4或CD8、CD45RO、CD127、IL-2Rβ和CD95但不表达或低表达CD45RA、CD62L、CCR7和CD28的经历过抗原的T细胞。T效应记忆细胞在被抗原重新刺激后，最终分化并获得效应功能。

如本文所用，“T中枢记忆干细胞”或“T_SCM”是指表达表型标志物CD4或CD8、CD45RA、CD62L、CD95、IL-2Rβ、CCR7、CXCR3、CD122和LFA-1的经历过抗原的T细胞。T_SCM细胞具有记忆T细胞的能力，可在抗原重新攻击后快速获得效应功能，但与T_CM细胞相比，具有增强的干细胞样特性，如长期持久性。T_SCM细胞可以生成中枢记忆细胞亚群、效应记忆细胞亚群和效应T细胞亚群。

如本文所用，“恒定自然杀伤T细胞”或“iNKT”是CD1d限制的自然杀伤T(NKT)细胞的亚类，其在人体中表达高度保守的αβ-T细胞受体，该受体由Vα24Jα18TCRα链组成(此处称为“Vα24Jα18⁺”)。iNKT细胞可以通过与CD1d-多聚体结合而鉴定，该CD1d-多聚体例如是载有α-半乳糖基神经酰胺(GalCer)、PBS-57、PBS-44或其他天然或合成的糖脂的CD1d-多聚体，并且可以发现为四聚体、树状聚体和其他结构、Fc融合物或其任何组合。另一种鉴定方法是特异性识别Vα24Jα18区域的抗体或抗体组合。示例包括Vα24抗体、Jα18抗体或与Vα24Jα18TCR的独特区域特异性结合并可以用于鉴定iNKT细胞的单克隆抗体克隆6B11(Montoya等人,Immunology.2007.122(1):1-14)。在一些实施方案中，iNKT细胞是载有CD1d-三聚体糖脂⁺(CD1d-tet⁺)、6B11⁺或两者。iNKT细胞在本文中可以互换地称为CD1d-tet⁺、6B11⁺或Vα24Jα18⁺细胞。不希望限于特定的机制，认为iNKT细胞促进/加速Treg和HSPC的活性。

如本文所指，“谱系阳性”或“Lin⁺”细胞表达表型标志物，如CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20或其任何组合。如本文所指，与HSPC、Treg、Tmem或iNKT细胞相比，“谱系阴性”或“Lin^-”细胞不表达或低表达表型标志物CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20或其任何组合。Lin⁺细胞表达存在于成熟红系细胞、粒细胞、巨噬细胞、NK细胞以及B和T淋巴细胞上的表型标志物。

如本文所用，“样品”是指细胞来源(例如，生物组织)，可以从其分离、富集或耗尽细胞群。在一些实施方案中，样品通常预先未被处理过或已被最低限度地处理。例如，样品可以是动员的外周血、动员的单采血液成分术产品、骨髓、脐带血、未动员的血液、未动员的单采血液成分术产品或其任何组合。在一些实施方案中，通过用密度梯度、Ficoll、Percoll、红细胞低渗溶解、氯化铵-钾(ACK)缓冲液进行处理、洗入pH平衡的等渗缓冲液或其任何组合来制备或最低限度地处理样品。在一些实施方案中，样品通过单次组织收获提供。在一些实施方案中，样品通过一次或多次组织收获提供。

如本文所用，“供体”是指一个或多个个体，样品从其获得。例如，供体可以指人白细胞抗原(HLA)匹配的同胞、HLA匹配的不相关供体、部分匹配的不相关供体、单倍同一性的相关供体、自体供体、HLA不匹配的同种异体供体、供体池或其任何组合。在一些实施方案中，供体可以是受试者。“供体组织”是指从供体收获的组织。供体组织可以是样品。供体组织通常与受试者是相同物种。

如本文所用，“受试者”或“接受者”是指需要接受本文公开的治疗、疗法或细胞移植的一个或多个个体。通过本发明可治疗的受试者通常是人。然而，其他受试者包括非人灵长类动物、牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、小鼠、兔子、大鼠或豚鼠。受试者可以是男性或女性，并可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在治疗期间和之后，受试者成为接受者或移植接受者。

如本文所用，“组织收获”是指从供体收集供体组织或样品的过程。组织收获的非限制性示例包括从供体收集骨髓、外周血、脐带血等。组织收获可以通过本领域已知的任何方法进行。

如本文所用，就细胞群或混合物中的细胞类型而言，“富集”是指这样的细胞群，其已被处理以增加富集的细胞类型相对于混合物中的其他细胞(例如，计算细胞类型)的相对量或比例。因此，根据经受富集过程的初始细胞群的来源，混合物或组合物可以包含30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多(数目或计数)的“富集”细胞群(相对于混合物中其他细胞)。在一些实施方案中，富集过程可以导致“富集”细胞群相对于混合物中的其他细胞为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。例如，在一些实施方案中，为iNKT细胞富集的细胞混合物可以包含约0.03至1％的iNKT细胞、0.05％至0.5％的iNKT细胞、0.1％至1％的iNKT细胞或其任何组合。富集细胞群的示例性方法包括磁性激活细胞分选(MACS)和荧光激活细胞分选(FACS)。

如本文所用，就细胞群或混合物中的细胞类型而言，“耗尽”是指这样的细胞群，其已被处理以减少耗尽的细胞类型相对于混合物中的其他细胞(例如，计算细胞类型)的相对量或比例。在一些实施方案中，经受耗尽过程的细胞可以导致混合物或组合物包含50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、0.0000001％、0.00000001％或更少(数目或计数)的“耗尽”细胞群。在一些实施方案中，经受耗尽过程的细胞可以导致混合物或组合物相对于未处理样品包含少10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更少的耗尽群。在一些实施方案中，在耗尽细胞类型的处理步骤之后，使用常规方法不再能检测到耗尽的细胞类型。

在某些实施方案中，混合物中某个细胞类型的量被富集，而不同细胞类型的量被耗尽，如富集CD34⁺细胞，而耗尽CD34^-细胞。

对标志物呈“阳性”的细胞群是指细胞群的均匀染色高于在同型对照上发现的水平。在一些实施方案中，一个或多个标志物的减少或低表达是指相比于参考对照，平均荧光强度(MFI)的损失或测量值低至少1log10。在一些实施方案中，一个或多个标志物的增加或高表达是指相比于同型对照或参考对照，MFI的增加或测量值高至少1log10。在一些实施方案中，相对于参考群MFI增加至少2倍表明细胞对标志物的表达呈阳性。例如，与同型对照相比，对标志物呈阳性的细胞群可以表现出2倍至4倍、4倍至10倍、10倍至100倍，以及100倍至1,000倍、1,000倍至10,000倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多更高的MFI。在一些实施方案中，对一个或多个标志物呈阳性的细胞群是指表现该标志物的细胞的百分比，与参考细胞群相比，其可以是至少50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞，以及介于50％和100％之间的任何％。

对标志物呈“阴性”的细胞群是指相比于同型对照，用特异性抗体对细胞群没有显著的染色。在一些实施方案中，相对于参考群MFI降低至少2倍表明细胞对标志物的表达呈阴性。例如，与阳性对照相比，对标志物呈阴性的细胞群可以表现出低2倍至4倍、4倍至10倍、10倍至100倍，以及100倍至1,000倍、1,000倍至10,000倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更低的MFI。在一些实施方案中，一个或多个标志物的表达降低或低表达是指相比于参考细胞群，该细胞群中表现该标志物的细胞的百分比降低，该百分比降低为至少20％的细胞、25％的细胞、30％的细胞、35％的细胞、40％的细胞、45％的细胞、50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞，以及介于20％和100％之间的任何％。

如本文所用，“纯度百分比”或“％纯度”是指靶细胞的数目乘以100，然后除以所计数的细胞事件的数目，如在流式细胞仪、血细胞计数器、库尔特计数器、显微术或其他细胞计数方法上所测得的(靶细胞数x 100/细胞事件数)。

如本文所用，“总百分比产率”或“总％产率”是指处理步骤后的靶细胞数乘以100，然后除以初始群中的靶细胞数(处理步骤后的靶细胞数x 100/初始群中的靶细胞数)。“处理步骤的百分比产率”或“处理步骤的％产率”是指处理步骤后的靶细胞数乘以100，然后除以预处理群中的靶细胞数(处理步骤后的靶细胞数x 100/预处理群中的靶细胞数)。

如本文所用，“粗略分选”是指富集或耗尽细胞群的方法，其中与起始细胞混合物相比，根据经受粗略分选的初始细胞群的来源，所得的群可以包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的特定细胞群。进行粗略分选的方法是本领域公知的，并可以包括密度分离、单采血液成分术/白细胞去除术、四聚体抗体复合物介导的富集/耗尽，以及磁性激活细胞分选(MACS)，如或EASYSEP^TM/ROBOSEP^TM。

如本文所用，“精细分选”是指富集或耗尽细胞群的方法，其中与起始细胞混合物相比，所得的群可以包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，97％、98％、99％、99.9％或更多的特定细胞群。执行精细分选的方法是本领域公知的，并可以包括基于多参数荧光的分子表型，如荧光激活细胞分选(FACS)和基于微流体的分选。例如，执行精细分选的附加方法在美国临时专利申请号62/421,979中提供，其通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“结合分子”可以是大量不同分子或聚集体中的任一种，并且该术语可互换使用。蛋白质、多肽、肽、核酸(核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸)、抗体、糖、多糖、脂质、受体、测试化合物(特别是通过组合化学产生的化合物)可以各自或组合(单独或通过靶配体彼此结合时)成为结合分子。

如本文所用，“特异性结合”或“对…具有特异性”是指结合分子(例如抗体)或结合域与靶标(分子或复合物)以等于或大于10⁵M^-1的亲和力或K_a(即，特定结合相互作用的平衡结合常数，单位为1/M)(等于此缔合反应的缔合速率[k_on]与解离速率[k_off]之比)结合或联合，而与样品中的任何其他分子或组分未明显缔合或联合。结合分子或结合域可被分类为“高亲和力”结合分子或结合域或“低亲和力”结合分子或结合域。“高亲和力”结合分子或结合域是指K_a为至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1或至少10¹³M^-1的那些结合分子或结合域。“低亲和力”结合分子或结合域是指K_a为至多10⁷M^-1、至多10⁶M^-1、至多10⁵M^-1的那些结合分子或结合域。或者，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(K_d)，以M为单位(例如，10^-5M至10^-13M)。

如本文所用，“塑造的细胞移植物”或“塑造的移植物”是指从起始细胞群处理出的细胞群，以在指定范围内提供特定细胞类型的数目，并将不期望的细胞类型减少或去除至特定范围。范围通常以每kg患者体重的特定变化范围的细胞数提供，但也可以表示为移植物中的总数。塑造的细胞移植物可以包含这样的细胞混合物，其包括自然界中不存在的靶细胞与计数细胞之比，或自然界中不存在的百分比表示。

如本文所用，“单位剂量”是指对接受塑造细胞移植物的受试者的每千克(kg)体重而言，治疗性细胞群的指定最小数目、指定数目或范围。认识到单位剂量的数目根据受试者的体型而变化。单位剂量可根据受试者的体重分为单位剂量的一部分。在一些实施方案中，可以将治疗性细胞群(例如，HPSC、Tmem、Treg、iNKT等)分到单独的容器中，以供向受试者施用。

治疗性细胞组合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了形成在造血干/祖细胞移植中有用的药物组合物的独特的治疗性细胞群。治疗性细胞群可以包括造血干/祖细胞(HSPC)、记忆T细胞(Tmem)、调节性T细胞(Treg)的富集群，并且其中细胞群耗尽幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，Treg包括幼稚Treg、记忆Treg或两者。在一些实施方案中，Tmem包括T中枢记忆干细胞(T_SCM)、T中枢记忆细胞(T_CM)群、T效应记忆细胞(T_EM)群或其任何组合。在一些实施方案中，治疗性的群包括恒定自然杀伤T细胞(iNKT)的富集群。

在一些实施方案中，治疗组合物可以包含HSPC和Tmem。在一些情况下，治疗组合物可以包含HSPC、Tmem和Treg。在一些情况下，治疗组合物可以包含HSPC和Treg。在一些情况下，治疗组合物可以包含HSPC和iNKT细胞。在一些情况下，治疗组合物可以包含HSPC、Treg、Tmem和iNKT细胞。

在本公开内容的某些实施方案中，HSPC是CD34⁺。HSPC可以进一步或替代地描述为CD133⁺、CD90⁺、CD38^-、CD45RA^-、Lin^-或其任何组合。在一些实施方案中，HSPC是CD19^-、TCRα/β^-或其组合。在一些实施方案中，Treg是CD25⁺、CD4⁺和CD127^-/lo细胞或其任何组合。在一些实施方案中，Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺或其任何组合。在一些实施方案中，幼稚Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺、CD45RA⁺、CD45RO^-或其任何组合。在一些实施方案中，记忆Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺或其任何组合。在一些实施方案中，Tmem是CD25^-、CD45RA^-细胞或其任何组合。在一些实施方案中，Tmem是CD3⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_SCM是CD45RA⁺和CD4⁺或CD8⁺。T_SCM还可以描述为CD95⁺、CD122⁺、CXCR3⁺、LFA-1⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_CM是CD45RO⁺和CD4⁺或CD8⁺。T_CM还可以描述为CD45RA^-、CD62L⁺、CCR7⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_EM是CD4⁺、CD45RO⁺、CD45RA^-、CD62L^-、CCR7^-或其任何组合。在一些实施方案中，iNKT是CD1d-tet⁺、6B11⁺或两者。在一些实施方案中，iNKT是Vα24Jα18⁺。在一些实施方案中，iNKT细胞可以是CD25⁺、6B11⁺、CD4⁺、Vα24Jα18⁺、CD127^dim/-细胞或其任何组合。在本文所述的任何实施方案中，幼稚常规αβ-T细胞是CD25^-、CD45RA⁺或其任何组合。在一些实施方案中，幼稚常规αβ-T细胞可以是TCRα/β⁺CD45RA⁺和CD25^-、CD127⁺或两者。幼稚常规αβ-T细胞还可以描述为TCRα⁺TCRβ⁺CD45RA⁺CD45RO^-CD25^-CD95^-IL-2Rβ^-CD127⁺Vα24Jα18^-。

在某些实施方案中，治疗性细胞的浓度被描述为HSPC与另一细胞类型之比。在一些实施方案中，HSPC与Tmem之比包括从500:1至1:1,000、400:1至1:1,000、300:1至1:1,000、200:1至1:1,000、100:1至1:1,000、50:1至1:1,000、10:1至1:1,000、5:1至1:1,000、4:1至1:1,000、3:1至1:1,000、2:1至1:1,000、1:1至1:1,000、500:1至1:900、500:1至1:800、500:1至1:700、500:1至1:600、500:1至1:500、500:1至1:400、500:1至1:300、500:1至1:200、500:1至1:100、500:1至1:50、500:1至1:20、500:1至1:10、500:1至1:9、500:1至1:8、500:1至1:7、500:1至1:6、500:1至1:5、500:1至1:4、500:1至1:3、500:1至1:2、500:1至1:1、400:1至1:900、300:1至1:800、200:1至1:700、100:1至1:600、50:1至1:500、10:1至1:400、5:1至1:300、4:1至1:200、3:1至1:100、2:1至1:50或1:1至1:20的范围。

在一些实施方案中，HSPC与Tmem之比包括从10:1至1:200、100:1至1:2,000或1,000:1至1:20,000的范围。

HSPC与Treg之比可以包括从20:1至1:3、100:1至1:30或200:1至1:300的范围。HSPC与幼稚Treg之比可以包括从1:500至100:1、1:400至100:1、1:300至100:1、1:200至100:1、1:100至100:1、1:50至100:1、1:20至100:1、1:10至100:1、1:5至100:1、1:1至100:1、1:200至50:1、1:200至20:1、1:200至10:1、1:200至5:1、1:100至1:1、40:1至1:3、200:1至1:15或400:1至1:150的范围。HSPC与记忆Treg之比可以包括从1:500至10,000:1、1:400至10,000:1、1:300至10,000:1、1:200至10,000:1、1:100至10,000:1、1:50至10,000:1、1:20至10,000:1、1:10至10,000:1、1:5至10,000:1、1:1至10,000:1、1:500至5,000:1、1:500至1,000:1、1:500至900:1、1:500至800:1、1:500至700:1、1:500至600:1、1:500至500:1、1:500至400:1、1:500至300:1、1:500至200:1、1:500至100:1、1:500至50:1、1:500至20:1、1:500至10:1、1:500至5:1或1:500至1:1的范围。

HSPC与iNKT之比可以包括从1:2至1,000,000:1、1:2至500,000:1、1:1至500,000:1、100:1至1,000,000:1、100:1至500,000:1、100:1至100,000:1、500:1至1,000,000:1、500:1至500,000:1、500:1至100,000:1、1,000:1至100,000:1、1,000:1至1,000,000:1、1,000:1至500,000:1、1,000:1至100,000:1、10,000:1至1:2、100,000:1至1:20或1,000,000:1至1:200的范围。

在某些实施方案中，治疗性细胞的浓度被描述为幼稚常规αβ-T细胞与治疗性细胞类型之比。幼稚常规αβ-T细胞与HSPC之比可以小于1:3、小于1:50、小于1:100、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1,000、小于1:1,500、小于1:2,000、小于1:3,000、小于1:4,000、小于1:5,000、小于1:6,000、小于1:7,000、小于1:8,000、小于1:9,000、小于1:10,000、小于1:50,000、小于1:100,000、小于1:200,000、小于1:300,000、小于1:400,000、小于1:500,000、小于1:600,000、小于1:700,000、小于1:800,000、小于1:900,000、小于1:1,000,000。

幼稚常规αβ-T细胞与Tmem之比可以小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。

幼稚常规αβ-T细胞与Treg之比可以小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。幼稚常规αβ-T细胞与幼稚Treg之比可以小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。幼稚常规αβ-T细胞与记忆Treg之比可以小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、小于1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。

幼稚常规αβ-T细胞与iNKT之比可以小于100:1、小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、小于1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000、小于1:50000。

在本公开内容的一些实施方案中，Tmem与Treg之比不取决于起始细胞的浓度(例如，从起始浓度大幅改变)。这提供了优势，因为Tmem的浓度可以独立于Treg的浓度来控制(例如，剂量递增)。Tmem与Treg之比可以为从30:1至1:1、25:1至1:1、20:1至1:1、15:1至1:1、10:1至1:1、9:1至1:1、8:1至1:1、7:1至1:1、6:1至1:1、5:1至1:1、4:1至1:1、3:1至1:1、2:1至1:1。在某些实施方案中，Tmem与Treg之比可以为从1:1至200:1、1:10至2000:1或1:100至20,000:1。Tmem与幼稚Treg之比可以为从5:1至1:10、3:1至1:10、3:1至1:10、2:1至1:10或1:1至1:10。Tmem与记忆Treg之比可以为从27:1至0.9:1、30:1至1:10、25:1至1:10、20:1至1:10、15:1至1:10、10:1至1:10、30:1至1:9、30:1至1:8、30:1至1:7、30:1至1:6、30:1至1:5、30:1至1:4、30:1至1:3、30:1至1:2或30:1至1:1。

在本公开内容的一些实施方案中，Treg与iNKT之比可以为从20,000:1至1:5、200,000:1至1:50或2,000,000:1至1:500。

在本公开内容的一些实施方案中，iNKT与Tmem之比可以为从2:1至1:100,000、5:1至1:1,000,000或10:1至1:10,000,000。

在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以小于HSPC数目的约2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、27％、30％、32％或35％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞的数目可以为HSPC数目的约2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、27％、30％、32％或35％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞的数目可以为HSPC数目的约2％至约7％、约2％至约10％、约2％至约15％、约2％至约20％、约2％至约25％、约2％至约30％、约2％至约35％、约7％至约10％、约7％至约15％、约7％至约20％、约7％至约25％、约7％至约30％、约7％至约35％、约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约30％、约15％至约35％、约20％至约25％、约20％至约30％、约20％至约35％、约25％至约30％、约25％至约35％或约30％至约35％。

在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以小于Tmem细胞数目的约0.1％、1％、2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％或25％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以为至多约20％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以为Tmem细胞数目的约0.1％至约2％、约0.1％至约5％、约0.1％至约10％、约0.1％至约15％、约0.1％至约20％、约2％至约5％、约2％至约10％、约2％至约15％、约2％至约20％、约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约10％至约15％、约10％至约20％或约15％至约20％。

在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以小于Treg细胞数目的约0.05％、0.5％、1％、2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％或30％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以为Treg细胞数目的约0.05％至约1％、约0.05％至约5％、约0.05％至约10％、约0.05％至约15％、约0.05％至约20％、约0.05％至约30％、约1％至约5％、约1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约20％、约1％至约30％、约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约5％至约30％、约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约30％、约15％至约20％、约15％至约30％或约20％至约30％。

在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以小于iNKT细胞数目的约1％、10％、20％、50％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，组合物中的幼稚常规aβ-T细胞数目可以为iNKT细胞数目的约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约50％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约10％至约20％、约10％至约50％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约20％至约50％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约70％至约80％、约70％至约90％或约80％至约90％。

在某些实施方案中，治疗性细胞群包含10％至65％的HSPC。在某些实施方案中，治疗性细胞群包含2％至20％的Treg。在某些实施方案中，治疗性细胞群包含25％至90％的Tmem。在某些实施方案中，治疗性细胞群包含少于2％的幼稚常规αβ-T细胞。在某些实施方案中，治疗性细胞群包含：10％至65％的HSPC；2％至20％的Treg；25％至90％的Tmem；和少于2％的幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，Treg群包含2％至5％、2％至10％、2％至20％、2％至30％、2％至40％、2％至50％、5％至10％、5％至20％、5％至30％、5％至40％、5％至50％、10％至20％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、15％至20％、15％至30％、15％至40％或15％至50％的幼稚Treg。在一些实施方案中，Treg群包含75％至95％的记忆Treg。在一些实施方案中，幼稚T细胞群包含0.1％至10％的T_SCM。在一些实施方案中，Tmem群包含0％至99％的T_CM。在一些实施方案中，Tmem群包含0％至99％的T_EM。在某些实施方案中，该群还包含0.01％至5％、0.05％至5％、0.1％至5％、0.5％至5％、1％至5％、0.01％至1.5％、0.05％至1.5％、0.1％至1.5％、0.5％至1.5％或1％至1.5％的iNKT。

在本文公开的任何实施方案中，可以通过处理来自一次或多次组织收获的样品来提供细胞群。在一些实施方案中，样品或组织收获来自单个供体。一次或多次组织收获可以来自一个或多个供体。例如，组织收获可以来自HLA匹配的同胞供体、HLA匹配的不相关供体、部分匹配的不相关供体、单倍同一性的相关供体、自体供体、完全HLA不匹配的同种异体供体、供体池或其任何组合。

在本文公开的任何实施方案中，细胞群可以是用于施用于受试者的制剂。在一些情况下，可以使用赋形剂配制细胞群。在一些实施方案中，将细胞配制成用于输注或注射。赋形剂可以包括Normosol-R和人血清。人血清可以占总制剂的0.2％。人血清可以占总制剂的0.5％。人血清可以占总制剂的1％。人血清可以占总制剂的2％。此外，该制剂可以包含pH缓冲液，如0.1mM–100mM磷酸盐pH 6.0–9.0、0.1–100mM HEPES pH 6.0–9.0、0.1mM–100mM碳酸氢盐pH 6.0–9.0、0.1mM–100mM柠檬酸盐pH 6.0–9.0、0.1-100mM乙酸盐pH 4.0–8.0或其任何组合。该制剂可以包含电解质，如5mM–400mM NaCl、0.5mM–50mM KCl、0.05mM–50mMCaCl2、0.05mM–50mM MgCl2、0.05mM–50mM LiCl2、0.05mM–50mM MnCl2或其任何组合。该制剂可以包含能量源，如0.1mM–100mM葡萄糖、0.1mM–100mM丙酮酸、0.1mM–100mM果糖、0.1–100mM蔗糖、0.1–50mM甘油、0.1mM–100mM葡萄糖酸内酯、0.1–100mM葡萄糖酸或其任何组合。该制剂可以包含抗氧化剂，如0.05–10mM谷胱甘肽(还原的)、0.05–10mM谷胱甘肽(氧化的)、0.001mM–10mMβ-巯基乙醇、0.001mM–10mM二硫苏糖醇、0.01–100mM抗坏血酸盐、0.001–10mM三(2-羧乙基)膦或其任何组合。该制剂可以包含稳定剂，如0.01％-10％的人血清白蛋白、0.01％-10％的牛血清白蛋白、0.1％-99％的人血清、0.1％-99％的胎牛血清、0.01％-10％的IgG、0.1％-10％的免疫球蛋白、0.06％-60％的海藻糖，或分子聚合物，如0.1％-20％的聚乙二醇(MW 200-20,000,000)或其任何组合。

在本文公开的一些实施方案中，基于受试者的体重配制施用于受试者的细胞群(例如，细胞数/kg受试者体重)。细胞群可以配制成药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含单位剂量的细胞移植物(例如细胞群)，其中每个单位剂量的细胞移植物包括接受细胞移植物的受试者的每千克(kg)体重的治疗性细胞群。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含每kg受试者约1x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含每kg受试者至少约1x 10⁶个HSPC。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含每kg受试者至多约20x 10⁶个HSPC。在一些实施方案中，该群或单位剂量包含的HSPC细胞范围为从约0.5x 10⁶至50x 10⁶、1.0x 10⁶至20x 10⁶或2.0x 10⁶至10x 10⁶个细胞/kg受试者体重。

在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约1x 10⁶个HSPC至约2x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约5x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约5x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约10x10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约10x10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约10x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC或约15x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC每千克受试者。在一些实施方案中，细胞群包含约1x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC、约10x 10⁶个HSPC、约15x 10⁶个HSPC或约20x 10⁶个HSPC每千克受试者。

在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约1x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至少约1x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至多约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约1x 10⁶个Tmem细胞至约10x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约20x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约20x 10⁶个Tmem细胞、约10x10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞至约100x10⁶个Tmem细胞或约75x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约1x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞、约20x10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞、约75x 10⁶个Tmem细胞或约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者。

在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x10⁶个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至少约0.5x10⁶个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至多约2.5x10⁶个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.5x 10⁶个Treg细胞至约1x 10⁶个Treg细胞、约0.5x 10⁶个Treg细胞至约1.5x 10⁶个Treg细胞、约0.5x10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约0.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞至约1.5x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞或约2x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.5x10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞、约2x 10⁶个Treg细胞或约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含的幼稚Treg范围为从约0.1x 10⁶至约500x 10⁶、约0.2x 10⁶至约500x 10⁶、约0.3x 10⁶至约500x10⁶、约0.4x 10⁶至约500x 10⁶、约0.5x 10⁶至约500x 10⁶、约0.6x 10⁶至约500x 10⁶、约0.7x10⁶至约500x 10⁶、约0.8x 10⁶至约500x 10⁶、约0.9x 10⁶至约500x 10⁶或约1x 10⁶至约500x10⁶个细胞/kg受试者体重。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包括的记忆Treg范围为从0.005x 10⁶至500x 10⁶个细胞/kg受试者体重。

在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含的iNKT细胞范围为从0.5x 10³至2000x 10³个细胞/kg受试者体重、0.5x 10³至1x 10⁷个细胞/kg受试者体重或1.0x 10⁴至2.5x 10⁶个细胞/kg受试者体重。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至少约0.01x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含至多约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约0.1x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约1x10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约1x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞或约2x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含约0.01x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约2x 10⁶个iNKT细胞或约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者。

在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含少于1x 10⁶个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞范围。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含少于3x 10⁵个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞范围。在一些实施方案中，细胞的群或单位剂量包含少于7.5x 10⁴个细胞/kg受试者体重、少于5x 10⁴个细胞/kg、少于1x 10⁴个细胞/kg、少于0.5x 10⁴个细胞/kg或少于1x 10³个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞范围。

在一些实施方案中，每个单位剂量的治疗性细胞群包含：1.0x10⁶至50x 10⁶个造血干/祖细胞(HSPC)、0.1x 10⁶至1000x 10⁶个记忆T细胞(Tmem)、0.1x 10⁶至1000x 10⁶个调节性T细胞(Treg)和少于3x 10⁵个幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量的治疗性细胞群包含：3.0x 10⁶至50x 10⁶个造血干/祖细胞(HSPC)、0.3x 10⁶至1000x 10⁶个记忆T细胞(Tmem)、0.5x 10⁶至1000x 10⁶个调节性T细胞(Treg)和少于3x 10⁵个幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量的治疗性细胞群包含：1.0x 10⁶至50x 10⁶个造血干/祖细胞(HSPC)、0.3x 10⁶至1000x 10⁶个记忆T细胞(Tmem)、0.5x 10⁶至1000x 10⁶个调节性T细胞(Treg)和少于3x 10⁵个幼稚常规αβ-T细胞。

在本文公开的任何实施方案中，HSPC可以由与受试者单倍同一性的供体提供。在一些实施方案中，Treg、Tmem、iNKT或其任何组合由是HLA匹配的同胞供体或HLA匹配的不相关供体或HLA部分匹配的不相关供体的供体提供。在一些实施方案中，HSPC由与受试者单倍同一性的供体提供，并且Treg、Tmem、iNKT或其任何组合由是HLA匹配的同胞供体或HLA匹配的不相关供体的供体提供。

治疗方法

本公开内容提供了在患有疾病、病况或病症的受试者中执行细胞移植疗法的方法，包括：向受试者施用本文所述的任何治疗性细胞移植物组合物。例如，可以将包含细胞的治疗组合物输注到需要该组合物的受试者。

可以治疗的受试者包括罹患白血病、淋巴瘤、慢性感染或自身免疫性疾病、恶性或非恶性血液病、AML、ALL、CML、CLL、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、MDS、淋巴增生性疾病、1型糖尿病、先天性代谢异常、遗传疾病、重症联合免疫缺陷、镰状细胞性贫血、β-地中海贫血、多发性硬化症、实体器官移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、狼疮、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、糖原贮存症、乳腺癌、其他实体瘤、脑白质营养不良、粘多糖病或任何其他将从HSPC移植受益的疾病。在一些实施方案中，受试者罹患复发性ALL或AML或原发性难治性ALL或AML且胚细胞少于10％。在一些实施方案中，受试者罹患≥CR1或微小残留病阳性的高风险AML。在一些实施方案中，受试者罹患>＝CR1或微小残留病阳性的高风险ALL。在一些实施方案中，受试者罹患高风险CML。在一些实施方案中，受试者罹患高风险骨髓增生性病症。在一些实施方案中，受试者罹患对疗法有反应的复发性非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者罹患MDS，其在移植时胚细胞计数为少于10％胚细胞。在某些实施方案中，受试者具有一个或多个以下特征：年龄18-65，卡诺夫斯基评分≥60或ECOG≤2，HCT合并症指数≤4，肌酐<1.5mg/dL，心脏射血分数>45％，校正后DLCO>预期的60％，总胆红素<正常上限(ULN)的3倍(除非归因于吉尔伯特综合征)，AST和ALT<3倍ULN，未怀孕或未哺乳，HIV阴性，并且没有将会将预期寿命限制在6个月以下的并存疾病。在某些实施方案中，受试者具有一个或多个以下特征：年龄患者0-3、3-6、6-12、12-14、12-18、18-65、65-70、70-75、75-80、80-90或以上，或之间的任何范围，卡诺夫斯基评分≥60或≥80，或ECOG≤2，HCT合并症指数≤4，肌酐<1.5mg/dL，心脏射血分数>45％，校正后DLCO>预测的60％，总胆红素<上限的3倍或<正常上限(ULN)的1.5倍(除非归因于吉尔伯特综合征)，AST和ALT<3倍或<1.5倍ULN，未怀孕或未哺乳，HIV阴性，并且没有将会将预期寿命限制在6个月以下的并存疾病。

本文所述的治疗性细胞组合物可以代替传统的HCT施用。示例性治疗性细胞组合物与减低强度预处理(RIC)和清髓(MA)方案相容。由于GVHD的风险降低，对于一些患者，尤其是具有潜在恶性肿瘤的患者，可以使用MA预处理代替RIC。由于本文公开的治疗性细胞组合物的GVHD减少，因此在多发性骨髓瘤的情况下，同种异体反应性可能是有益的，在多发性骨髓瘤中GVHD的风险大于同种异体反应性并且目前临床上使用自体移植。非恶性病况可能会受益于增强的免疫重建，因此感染率降低，移植率提高并且嵌合状态持久。

根据已知技术或其对本领域技术人员而言显而易见的变体，将本文所述的治疗性细胞组合物施用于受试者。

“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述的组合物的量，当将其施用于受试者(例如，人)时，足以帮助治疗疾病。组成“治疗有效量”的组合物的量将根据细胞制备、病况及其严重程度、施用方式和待治疗受试者的年龄而变化，但可以由本领域普通技术人员根据自己的知识和本公开内容常规地确定。当涉及单独施用的个别活性成分或组合物时，治疗有效剂量是指单独的该成分或组合物。当涉及组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分、组合物或两者的组合量，无论是连续、并行或同时施用。

在一些实施方案中，HSPC细胞以CD34⁺细胞的浓度施用，该浓度为1.0x 10⁶至50x10⁶个细胞/kg受试者体重、1.0x 10⁶至20x 10⁶个细胞/kg受试者体重或2.0x 10⁶至10x 10⁶个细胞/kg受试者体重。在一些实施方案中，HSPC细胞以约1x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，HSPC细胞以至少约1x 10⁶个HSPC每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，HSPC细胞以至多约20x 10⁶个HSPC每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，HSPC细胞以约1x 10⁶个HSPC至约2x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约5x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约1x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约5x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约7x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约10x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约15x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC、约10x 10⁶个HSPC至约15x10⁶个HSPC、约10x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC或约15x 10⁶个HSPC至约20x 10⁶个HSPC每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，HSPC细胞以约1x 10⁶个HSPC、约2x 10⁶个HSPC、约5x 10⁶个HSPC、约7x 10⁶个HSPC、约10x 10⁶个HSPC、约15x 10⁶个HSPC或约20x 10⁶个HSPC每千克受试者的浓度施用。

在一些实施方案中，Tmem以0.1x 10⁶至1000x 10⁶个细胞/kg受试者体重、1.0x 10⁶至250x 10⁶个细胞/kg受试者体重或2.9x 10⁶至10.1x 10⁶个细胞/kg受试者体重、10.1x10⁶至30.1x 10⁶个细胞/kg受试者体重、30.1x 10⁶至101x 10⁶个细胞/kg受试者体重、1.0x10⁶至100x 10⁶个细胞/kg受试者体重的浓度施用。在一些实施方案中，Tmem细胞以约1x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Tmem细胞以至少约1x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Tmem细胞以至多约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Tmem细胞以约1x 10⁶个Tmem细胞至约10x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约20x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约1x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约20x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约75x10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约50x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞至约75x 10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞或约75x 10⁶个Tmem细胞至约100x 10⁶个Tmem细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Tmem细胞以约1x 10⁶个Tmem细胞、约10x 10⁶个Tmem细胞、约20x 10⁶个Tmem细胞、约50x 10⁶个Tmem细胞、约75x 10⁶个Tmem细胞或约100x10⁶个Tmem细胞每千克受试者的浓度施用。

在一些实施方案中，Treg以0.1x 10⁶至1000x 10⁶个细胞/kg受试者体重、0.1x 10⁶至5x 10⁶个细胞/kg受试者体重或0.5x 10⁶至2.5x 10⁶个细胞/kg受试者体重的浓度施用。在一些实施方案中，Treg以约0.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Treg以至少约0.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Treg以至多约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Treg以约0.5x 10⁶个Treg细胞至约1x 10⁶个Treg细胞、约0.5x 10⁶个Treg细胞至约1.5x 10⁶个Treg细胞、约0.5x 10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约0.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞至约1.5x 10⁶个Treg细胞、约1x10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞至约2x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞或约2x 10⁶个Treg细胞至约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，Treg以约0.5x 10⁶个Treg细胞、约1x 10⁶个Treg细胞、约1.5x 10⁶个Treg细胞、约2x 10⁶个Treg细胞或约2.5x 10⁶个Treg细胞每千克受试者的浓度施用。

在一些实施方案中，幼稚Treg以约0.1x 10⁶至约500x 10⁶、约0.2x 10⁶至约500x10⁶、约0.3x 10⁶至约500x 10⁶、约0.4x 10⁶至约500x 10⁶、约0.5x 10⁶至约500x 10⁶、约0.6x10⁶至约500x 10⁶、约0.7x 10⁶至约500x 10⁶、约0.8x 10⁶至约500x 10⁶、约0.9x 10⁶至约500x 10⁶或约1x 10⁶至约500x 10⁶个细胞/kg受试者体重的浓度施用。

在一些实施方案中，记忆Treg以0.005x 10⁶至500x 10⁶个细胞/kg受试者体重的浓度施用。

在一些实施方案中，iNKT细胞以0.5x 10²至2000x 10³个细胞/kg受试者体重、0.5x10²至1x 10⁴个细胞/kg受试者体重、0.5x 10³至1x 10⁵个细胞/kg受试者体重、0.5x 10⁴至1x10⁶个细胞/kg受试者体重、0.5x 10⁵至1x 10⁷个细胞/kg受试者体重、0.5x 10²至1x 10⁷个细胞/kg受试者体重或1.0x 10⁴至2.5x 10⁶个细胞/kg受试者体重的浓度施用。在一些实施方案中，iNKT细胞以约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，iNKT细胞以至少约0.01x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，iNKT细胞以至多约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，iNKT细胞以约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约0.1x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x10⁶个iNKT细胞至约1x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约0.01x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约1x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞至约2x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞或约2x 10⁶个iNKT细胞至约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者的浓度施用。在一些实施方案中，iNKT细胞以约0.01x 10⁶个iNKT细胞、约0.1x 10⁶个iNKT细胞、约1x 10⁶个iNKT细胞、约1.5x 10⁶个iNKT细胞、约2x 10⁶个iNKT细胞或约3x 10⁶个iNKT细胞每千克受试者的浓度施用。

在一些实施方案中，所施用的细胞包括少于3x 10⁵个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，所施用的细胞包含少于2x 10⁵个细胞/kg受试者体重、少于1x 10⁵个细胞/kg受试者体重、少于7.5x 10⁴个细胞/kg、少于5x 10⁴个细胞/kg、少于1x10⁴个细胞/kg、少于0.5x 10⁴个细胞/kg或少于1x 10³个细胞/kg受试者体重的幼稚常规αβ-T细胞。

如在示例中进一步讨论的，治疗性细胞组合物的纯度对于治疗的临床结果可能是重要的。例如，与使用高保真分选技术(例如FACS)制备的治疗性细胞组合物相比，使用导致低纯度的方法对可能包含幼稚Tcon污染细胞的细胞级分进行处理可能通过导致更高水平的GVHD、3-4级的急性GVHD、3-4级的耐类固醇急性GVHD、慢性GVHD、移植物衰竭、移植物排斥、严重感染、器官衰竭、VOD/SOS和复发而损害治疗效果。

不希望受理论的束缚，据信，由于与传统的清髓性HSPC移植程序相比，与HSPC一起提供的Treg、Tmem和iNKT细胞使得较早地挽救受试者的免疫系统，本文公开的治疗性细胞组合物在清髓性移植程序中提供了优越的治疗益处。当受试者接受传统的清髓性HSPC移植时，免疫系统可能需要长达一年的时间才能开始显著恢复并提供保护性免疫。相比之下，据认为，在此公开的治疗组合物中，将Treg、Tmem或iNKT细胞与HSPC一起引入为受试者消融的免疫细胞提供补充。这些补充的细胞在施用后不久就开始提供显著的免疫功能。因此，与传统的HSPC移植相比，在此公开的治疗性细胞组合物提供了优越的治疗益处。还据信，调节性T细胞可以通过抑制实体组织中的异种异体反应性T细胞来协助移植并预防GVHD。还认为，iNKT细胞向Treg提供正反馈信号，以促进抑制性环境，特别是在实体组织中。还认为，HSPC将重建清髓患者的血液和免疫系统，包括重建NK细胞，而这又被认为提供了移植物抗白血病作用。还认为，记忆T细胞在有限的时间(少于5年)内提供抗感染作用和抗白血病作用。由于它们的寿命有限，这些细胞不能承受长期的移植物抗宿主疾病反应。

在一些实施方案中，将治疗性细胞群作为单独的药物组合物施用于受试者。例如，富集的HSPC、Tmem、Treg或iNKT细胞群可以依次施用。在一些实施方案中，治疗性细胞群以多个剂量施用。在一些情况下，细胞群的剂量可以包含HSPC。在一些情况下，细胞群的剂量可以包含Treg细胞。在一些情况下，细胞群的剂量可以包含Tmem细胞。在一些情况下，细胞群的剂量可以包含iNKT细胞。在一些实施方案中，将治疗性细胞群作为单一药物组合物同时施用于受试者。剂量可以作为疗程施用。疗程可以包括以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天的间隔向受试者施用剂量。疗程可以包括以1周、2周、3周或4周的间隔向受试者施用剂量。疗程可以包括以1个月、2个月、3个月或4个月的间隔向受试者施用剂量。

在一些实施方案中，本文所述的治疗组合物可以作为单独的细胞群施用。例如，治疗组合物的第一剂量可以包括单独或以任何组合的方式施用HSPC群、Treg细胞群或Tmem细胞群中的任何一个。然后，后续剂量可以包含第一剂量中不存在的任意上述细胞类型。剂量还可以包含iNKT细胞。例如，第一剂量可以包含HSPC，而第二剂量可以包含Treg和Tmem细胞。其他剂量组合也可以施用于受试者。

在一些实施方案中，治疗组合物的完整剂量可以包括多个剂量。本文所述的完整治疗组合物可以以至少1个剂量施用。本文所述的完整治疗组合物可以以最多30个剂量施用。在一些情况下，本文所述的完整治疗组合物可以以约2个剂量、5个剂量、10个剂量、15个剂量、20个剂量、25个剂量或30个剂量施用。在一些情况下，完整治疗组合物的剂量可以包含HSPC、Treg细胞、Tmem细胞。在一些情况下，完整治疗组合物的各个剂量可以包含不同的细胞群。

在一些实施方案中，单位剂量可以包含至少3x 10⁵个HSPC每千克受试者。在一些实施方案中，单位剂量可以包含至少3x 10⁵个Treg细胞每千克受试者。在一些实施方案中，单位剂量可以包含至少3x 10⁵个Tmem细胞每千克受试者。在一些实施方案中，单位剂量可以包含至少3x 10⁵个iNKT细胞每千克受试者。在一些实施方案中，单位剂量可以包含少于3x 10⁵个Tcon细胞每千克受试者。

在一些实施方案中，完整的治疗组合物可以在约1天内施用。在一些情况下，完整的治疗组合物可以在最多30天内施用。例如，本文所述的治疗组合物的第一剂量可以在1天内施用，而第二剂量在10天之后施用。在一些情况下，完整的治疗组合物可以在约1天、2天、5天、10天、15天、20天或30天内施用。

在一些实施方案中，细胞是从供体分离的，该供体是HLA匹配的同胞供体、HLA匹配的不相关供体、部分匹配的不相关供体、单倍同一性的相关供体、自体供体、HLA不匹配的供体、供体池或其任何组合。在一些实施方案中，治疗性细胞群是同种异体的。在一些实施方案中，治疗性细胞群是自体的。在一些实施方案中，治疗性细胞群是单倍同一性的。在一些实施方案中，治疗性细胞群是从动员的外周血、动员的单采血液成分术产品、骨髓、脐带血、未动员的血液、未动员的单采血液成分术产品或其任何组合中分离的。

在一些实施方案中，治疗性细胞群源自单次组织收获。在一些实施方案中，治疗性细胞群源自一次或多次组织收获。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含由至少第一供体提供的HSPC和由至少第二供体提供的Treg和Tmem。在一些实施方案中，治疗性细胞群包含由至少第二供体提供的iNKT细胞。在某些实施方案中，第一供体与受试者是单倍同一性的。在某些实施方案中，第二供体是HLA匹配的同胞供体或HLA匹配或部分匹配的不相关供体。

在一些实施方案中，在治疗之前，已用放射、化疗、重组蛋白、抗体或毒素缀合的抗体或其任何组合对受试者进行预处理。在一些实施方案中，为了进行细胞移植疗法，通过先用清髓疗法治疗受试者来对受试者进行预处理。示例性的清髓疗法包括化疗或放疗。据认为，清髓疗法通过对肿瘤进行减灭而提供治疗益处。癌细胞通常比许多正常细胞更容易受到化疗/放疗的影响。然而，如果肿瘤引发细胞在化疗/放疗过程中存活下来，则受试者有复发的风险。因此，高水平的化疗可以帮助消除肿瘤引发群；然而，在这些浓度下，对正常细胞产生毒性。尽管一些易感的正常细胞不是必需的，但造血干细胞会因高水平的化疗而致死。清髓疗法根除足够量的HSC，否则患者将在没有移植的情况下死亡。当将HSPC注入清髓的受试者中时，供体细胞可以挽救该受试者，并终身重建该受试者的血液和免疫系统。在一些实施方案中，清髓疗法包括施用白消安、环磷酰胺、TBI、氟达拉滨、依托泊苷或其任何组合。在一些实施方案中，清髓疗法包括施用抗cKIT抗体。在一些实施方案中，清髓疗法包括施用抗体药物缀合物。抗体药物缀合物可以是，例如，抗CD45-肥皂草毒蛋白治疗性抗体或抗cKit-肥皂草毒蛋白治疗性抗体。在一些实施方案中，清髓疗法是强度降低的预处理疗法。

在某些实施方案中，将治疗性细胞群作为包含免疫抑制剂的联合疗法施用于受试者。示例性的免疫抑制剂包括西罗莫司、他克莫司、环孢菌素、霉酚酸酯、抗胸腺细胞球蛋白、皮质类固醇、钙依赖磷酸酶抑制剂、抗代谢物，如甲氨蝶呤、移植后环磷酰胺或其任何组合。在一些实施方案中，仅用西罗莫司或他克莫司作为针对GVHD的预防法来预先治疗受试者。在一些实施方案中，治疗性细胞群在免疫抑制剂之前施用于受试者。在一些实施方案中，治疗性细胞群在免疫抑制剂之后施用于受试者。在一些实施方案中，治疗性细胞群与免疫抑制剂并行施用于受试者。在一些实施方案中，治疗性细胞群在无免疫抑制剂的情况下施用于受试者。在一些实施方案中，接受治疗性细胞群的患者接受免疫抑制剂，持续少于6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、3周、2周或1周。

在一些实施方案中，正接受Bu/Flu和/或Bu/Cy的受试者在第+3天开始以0.03mg/kg/天的最初剂量静脉内输注他克莫司，目标为4-8ng/ml。在一些实施方案中，正接受Cy/TBI(也用于TBI/VP-16或TBI/VP-16/Cy)的受试者在第+3天以6mg负荷剂量的最初剂量开始西罗莫司，随后每天2mg，目标为3-8ng/ml。如果由治疗医师确定受试者变得不耐受其特定的GVHD预防法或有其他改变原因，则可以由治疗医师判断是否改变预防法，并建议使用他克莫司、西罗莫司或霉酚酸酯。如果发生GVHD，将开始适当的治疗计划和剂量。发展出急性GVHD的接受者将根据治疗医师的判断进行治疗。

细胞群的选择和分类

在配制或施用治疗性细胞之前，从供体(例如，外周血单核细胞、骨髓、脐带血)获得细胞来源，从中富集或耗尽治疗性细胞。在细胞混合物中富集或耗尽特定亚细胞群的方法是本领域公知的。例如，可以通过密度分离、玫瑰花结四聚体抗体复合物介导的富集/耗尽、磁性激活细胞分选(MACS)、基于多参数荧光的分子表型，如荧光激活细胞分选(FACS)，或其任何组合来富集或耗尽细胞群。提供了富集或耗尽细胞群的附加方法，例如，美国临时申请62/421,979；美国专利申请公开号2014/0011690；和美国专利申请公开号2016/0245805，其通过引用整体并入本文。总体上，这些富集或耗尽细胞群的方法在本文中通常被称为“分选”细胞群或“在一定条件下”接触细胞以形成或产生富集(+)或耗尽(-)的细胞群。

因此，本公开内容的实施方案包括用于产生药物组合物的方法，该方法包括处理至少一种样品以提供：(a)富集的造血干/祖细胞(HSPC)群；(b)富集的调节性T细胞(Treg)群；(c)富集的记忆T细胞(Tmem)群；以及(d)将富集的HSPC、记忆T细胞和Treg的群配制为适合施用于受试者的药物组合物，其中(a)-(c)的群耗尽幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，该方法还可以包括处理样品以提供富集的iNKT细胞群。

在一些实施方案中，该方法还包括处理样品以提供耗尽Lin⁺细胞的细胞群。该方法可以包括提供富集的幼稚Treg群、富集的记忆Treg群或两者。在一些实施方案中，提供富集的Tmem群包括提供富集的T中枢记忆干细胞(T_SCM)群、富集的T中枢记忆细胞(T_CM)群、富集的T效应记忆细胞(T_EM)群或其任何组合。在一些实施方案中，该方法还可以包括处理样品以提供富集的iNKT细胞群。

在一些实施方案中，富集的HSPC群包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多CD34⁺HSPC。在一些实施方案中，耗尽Lin⁺细胞的细胞群包含1％-30％的Lin⁺细胞，优选少于1％的Lin⁺细胞。在一些实施方案中，富集的Treg群包含20％-99.9％的Treg。在一些实施方案中，富集的Tmem群包含10％-99.9％的Tmem。在一些实施方案中，富集的iNKT群包含10％-99.9％的iNKT。

在一些实施方案中，配制药物组合物包括将富集的HSPC群、记忆T细胞群、Treg群、iNKT群或其任何组合组合成富集细胞的混合群。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的HSPC与Tmem之比包括从500:1至1:1,000、400:1至1:1,000、300:1至1:1,000、200:1至1:1,000、100:1至1:1,000、50:1至1:1,000、10:1至1:1,000、5:1至1:1,000、4:1至1:1,000、3:1至1:1,000、2:1至1:1,000、1:1至1:1,000、500:1至1:900、500:1至1:800、500:1至1:700、500:1至1:600、500:1至1:500、500:1至1:400、500:1至1:300、500:1至1:200、500:1至1:100、500:1至1:50、500:1至1:20、500:1至1:10、500:1至1:9、500:1至1:8、500:1至1:7、500:1至1:6、500:1至1:5、500:1至1:4、500:1至1:3、500:1至1:2、500:1至1:1、400:1至1:900、300:1至1:800、200:1至1:700、100:1至1:600、50:1至1:500、10:1至1:400、5:1至1:300、4:1至1:200、3:1至1:100、2:1至1:50或1:1至1:20的范围。在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的HSPC与Tmem之比包括从10:1至1:200、100:1至1:2,000或1,000:1至1:20,000的范围。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的HSPC与Treg之比可以包括从20:1至1:3、100:1至1:30或200:1至1:300的范围。HSPC与幼稚Treg之比可以包括从1:500至100:1、1:400至100:1、1:300至100:1、1:200至100:1、1:100至100:1、1:50至100:1、1:20至100:1、1:10至100:1、1:5至100:1、1:1至100:1、1:200至50:1、1:200至20:1、1:200至10:1、1:200至5:1、1:100至1:1、40:1至1:3、200:1至1:15或400:1至1:150的范围。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的HSPC与记忆Treg之比可以包括从1:500至10,000:1、1:400至10,000:1、1:300至10,000:1、1:200至10,000:1、1:100至10,000:1、1:50至10,000:1、1:20至10,000:1、1:10至10,000:1、1:5至10,000:1、1:1至10,000:1、1:500至5,000:1、1:500至1,000:1、1:500至900:1、1:500至800:1、1:500至700:1、1:500至600:1、1:500至500:1、1:500至400:1、1:500至300:1、1:500至200:1、1:500至100:1、1:500至50:1、1:500至20:1、1:500至10:1、1:500至5:1或1:500至1:1的范围。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的HSPC与iNKT之比可以包括从1:2至1,000,000:1、1:2至500,000:1、1:1至500,000:1、100:1至1,000,000:1、100:1至500,000:1、100:1至100,000:1、500:1至1,000,000:1、500:1至500,000:1、500:1至100,000:1、1,000:1至100,000:1、1,000:1至1,000,000:1、1,000:1至500,000:1、1,000:1至100,000:1、10,000:1至1:2、100,000:1至1:20或1,000,000:1至1:200的范围。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的幼稚常规αβ-T细胞与HSPC之比小于1:3、小于1:50、小于1:100、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1,000、小于1:1,500、小于1:2,000、小于1:3,000、小于1:4,000、小于1:5,000、小于1:6,000、小于1:7,000、小于1:8,000、小于1:9,000、小于1:10,000、小于1:50,000、小于1:100,000、小于1:200,000、小于1:300,000、小于1:400,000、小于1:500,000、小于1:600,000、小于1:700,000、小于1:800,000、小于1:900,000或小于1:1,000,000。

在一些实施方案中，富集细胞的混合群包含的幼稚常规αβ-T细胞与Tmem之比可以小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000、或小于1:50000。

幼稚常规αβ-T细胞与Treg之比可以小于1:1、1:10、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。幼稚常规αβ-T细胞与幼稚Treg之比可以小于1:1、1:10、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。幼稚常规αβ-T细胞与记忆Treg之比可以小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、小于1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000或小于1:50000。幼稚常规αβ-T细胞与iNKT之比可以小于100:1、小于1:1、小于1:2、小于1:3、小于1:4、小于1:5、小于1:6、小于1:7、小于1:8、小于1:9、小于1:10、小于1:15、小于1:20、小于1:30、小于1:200、小于1:300、小于1:400、小于1:500、小于1:600、小于1:700、小于1:800、小于1:900、小于1:1000、小于1:5000、小于1:10000、小于1:15000、小于1:20000、小于1:25000、小于1:30000、小于1:35000、小于1:40000、小于1:45000、小于1:50000。

在本公开内容的一些实施方案中，Tmem与Treg之比不取决于起始细胞的浓度(例如，从起始浓度大幅改变)。这提供了优势，因为Tmem的浓度可以独立于Treg的浓度来控制(例如，剂量递增)。Tmem与Treg之比可以为从30:1至1:1、25:1至1:1、20:1至1:1、15:1至1:1、10:1至1:1、9:1至1:1、8:1至1:1、7:1至1:1、6:1至1:1、5:1至1:1、4:1至1:1、3:1至1:1、2:1至1:1。在某些实施方案中，Tmem与Treg之比可以为从1:1至200:1、1:10至2000:1或1:100至20,000:1。Tmem与幼稚Treg之比可以为从5:1至1:10、3:1至1:10、3:1至1:10、2:1至1:10或1:1至1:10。Tmem与记忆Treg之比可以为从27:1至0.9:1、30:1至1:10、25:1至1:10、20:1至1:10、15:1至1:10、10:1至1:10、30:1至1:9、30:1至1:8、30:1至1:7、30:1至1:6、30:1至1:5、30:1至1:4、30:1至1:3、30:1至1:2或30:1至1:1。

在本公开内容的一些实施方案中，Treg与iNKT之比可以为从20,000:1至1:5、200,000:1至1:50或2,000,000:1至1:500。

在本公开内容的一些实施方案中，iNKT与Tmem之比可以为从2:1至1:100,000、5:1至1:1,000,000或10:1至1:10,000,000。

在一些实施方案中，HSPC是CD34⁺。HSPC还可描述为CD133⁺、CD90⁺、CD38^-、CD45RA^-、Lin^-或其任何组合。在一些实施方案中，HSPC是CD19^-、TCRα/β^-或其组合。在一些实施方案中，Lin⁺细胞表达CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20或其任何组合。在一些实施方案中，Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺或其任何组合。在一些实施方案中，幼稚Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺、CD45RA⁺、CD45RO^-或其任何组合。在一些实施方案中，记忆Treg是CD4⁺、CD25⁺、CD127^-/lo、FoxP3⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺或其任何组合。在一些实施方案中，Tmem是CD3⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_SCM是CD45RA⁺和CD4⁺或CD8⁺。T_SCM还可以描述为CD95⁺、CD122⁺、CXCR3⁺、LFA-1⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_CM是CD45RO⁺和CD4⁺或CD8⁺。T_CM还可以描述为CD45RA^-、CD62L⁺、CCR7⁺或其任何组合。在一些实施方案中，T_EM是CD4⁺、CD45RO⁺、CD45RA^-、CD62L^-、CCR7^-或其任何组合。在一些实施方案中，iNKT是CD1d-tet⁺、6B11⁺、Va24Ja18⁺或其任何组合。在本文所述的任何实施方案中，幼稚常规αβ-T细胞是TCRα/β⁺CD45RA⁺和CD25^-、CD127⁺或两者。幼稚常规αβ-T细胞还可以描述为TCRα⁺TCRβ⁺CD45RA⁺CD45RO^-CD25^-CD95^-IL-2Rβ^-CD127⁺。

在一些实施方案中，可以对生物样品进行分选，以分离感兴趣的群，如HSPC、Treg细胞、Tmem细胞或其组合。在一些情况下，可以使生物样品与特异性结合CD34的分子接触以分离HSPC。样品可以针对CD34⁺进行富集，以产生CD34⁺细胞群和CD34^-细胞群。在一些情况下，可以使CD34^-细胞群与特异性结合CD25的分子接触。然后样品可以通过对CD34^-细胞群进行CD25⁺细胞群的分选，来富集CD25⁺细胞，从而产生CD34^-CD25^-细胞群和CD34^-CD25⁺细胞群。还可以将CD34^-CD25⁺细胞群分选以产生Treg细胞群。可以使CD34^-CD25⁺细胞与特异性结合CD4的分子和特异性结合CD127的分子接触。然后可以将细胞分选以产生CD34^-CD25⁺CD4⁺CD127^dim/-Treg细胞群。在一些情况下，还可以分选CD34^-CD25^-细胞群以富集Tmem细胞。可以使细胞与特异性结合CD45RA的分子接触。可以将细胞样品分选以产生CD34^-CD25^-CD45RA^-Tmem细胞群。可以丢弃CD45RA⁺幼稚常规αβ-T细胞，以耗尽幼稚常规αβ-T细胞。

在一些实施方案中，可以对生物样品进行分选，以分离感兴趣的群，如HSPC、Treg细胞、Tmem细胞、iNKT细胞或其组合。在一些情况下，可以使生物样品与特异性结合CD34的分子接触以分离HSPC。样品可以针对CD34⁺进行富集，以产生CD34⁺细胞群和CD34^-细胞群。在一些情况下，可以使CD34^-细胞群与特异性结合CD25的分子和特异性结合6B11的分子接触。然后样品可以通过对CD34^-细胞群进行CD25⁺细胞群的分选，来富集CD25⁺和6B11⁺细胞，从而产生CD34^-CD25^-6B11^-细胞群和CD34^-CD25⁺6B11⁺细胞群。还可以分选CD34^-CD25⁺6B11⁺细胞群以产生Treg和iNKT细胞群。可以使CD34^-CD25⁺6B11⁺细胞与特异性结合CD4的分子和特异性结合CD127的分子接触。然后可以将细胞分选以产生CD34^-CD25⁺6B11⁺CD4⁺CD127^dim/-Treg细胞群。在一些情况下，还可以分选CD34^-CD25^-6B11^-细胞群以富集Tmem细胞。可以使细胞与特异性结合CD45RA的分子接触。可以将细胞样品分选以产生CD34^-CD25^-6B11^-CD45RA^-Tmem细胞群。可以丢弃CD45RA⁺幼稚常规αβ-T细胞，以耗尽幼稚常规αβ-T细胞。在一些实施方案中，产生本文所述的治疗组合物的方法可以包括单独分选不同的细胞群。例如，HSPC、Treg细胞、Tmem细胞和/或iNKT细胞可以单独分选。可以将单独分选的群混合以形成治疗组合物。在一些情况下，可以从不同的供体分离单独的细胞群。例如，可以从供体1分离HSPC，并且可以从供体2分选Treg和Tmem细胞。或者，所有细胞群可以从同一供体分离。在一些实施方案中，样品包括动员的外周血、动员的单采血液成分术产品、骨髓、脐带血、未动员的血液、未动员的单采血液成分术产品或其任何组合。在一些实施方案中，样品包含源自PBMC的培养细胞。在一些实施方案中，样品包含源自诱导多能干细胞(iPSC)的培养细胞。在一些实施方案中，样品被制备用于处理密度梯度、Ficoll、Percoll、红细胞低渗溶解、氯化铵-钾(ACK)缓冲液或其任何组合。在一些实施方案中，样品通过单次组织收获提供。在一些实施方案中，样品通过一次或多次组织收获提供。

示例分选方案1

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.在一定条件下使样品与特异性结合CD34的分子接触以形成CD34⁺细胞群和CD34^-细胞群，从样品中回收CD34⁺细胞群，并从样品中回收CD34^-细胞群；以及B.处理CD34^-细胞群以提供至少一个包含Treg、Tmem、iNKT或其任何组合的富集的治疗性细胞群，(参见图1A和图1B)。在一些实施方案中，步骤B包括执行精细分选，以提供富集的治疗性细胞群(参见图1A)。例如，步骤B可以包括使CD34^-细胞群与特异性结合CD45RA的分子、特异性结合CD45RO的分子、特异性结合CD4的分子、特异性结合CD8的分子、特异性结合CD25的分子、特异性结合CD127的分子、CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的任何组合接触。

在某些实施方案中，步骤B包括：i.在一定条件下使CD34^-细胞群与至少一种特异性结合CD45RA的分子接触以形成CD45RA⁺细胞群和CD45RA^-细胞群，并回收CD45RA^-细胞群；以及ii.执行精细分选，以从CD45RA⁺细胞群中提供富集的治疗性细胞群。精细分选可以包括使CD45RA⁺细胞群与特异性结合CD4的分子、特异性结合CD8的分子、特异性结合CD25的分子、特异性结合CD127的分子、CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的任何组合接触。精细分选还可以包括使CD45RA^-细胞群与特异性结合CD45RA的分子、特异性结合CD45RO的分子或其组合接触。

在某些实施方案中，步骤B包括：i.在一定条件下使CD34^-细胞群与至少一种特异性结合Lin⁺标志物的结合分子接触以形成Lin⁺细胞群和Lin^-细胞群，并回收Lin^-细胞群；以及ii.执行精细分选，以从Lin^-细胞群中提供富集的治疗性细胞群。在一些实施方案中，精细分选包括使Lin^-细胞群与特异性结合CD45RA的分子、特异性结合CD45RO的分子、特异性结合CD4的分子、特异性结合CD8的分子、特异性结合CD25的分子、特异性结合CD127的分子、CD1d-tet分子、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的任何组合接触。

在某些实施方案中，步骤B包括：i.在一定条件下使CD34^-细胞群与至少一种特异性结合至少一种Lin⁺标志物的结合分子接触以形成Lin⁺细胞群和Lin^-细胞群，并回收Lin^-细胞群；和ii.在一定条件下使Lin^-细胞群与特异性结合CD25的结合分子接触以形成CD25⁺细胞群和CD25^-细胞群，回收CD25⁺细胞群，从而产生包含Treg的细胞群，并回收CD25^-细胞群；以及iii.在一定条件下使CD25^-细胞群与特异性结合CD45RA的结合分子接触以形成CD45RA⁺细胞群和CD45RA^-细胞群，并回收CD45RA^-细胞群(参见图1A)。在一些实施方案中，步骤ii.还包括在一定条件下使Lin^-细胞与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触以形成CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合和CD1d-tet^-细胞、6B11^-细胞或其组合的群，并回收CD1d-tet⁺细胞群。在一些实施方案中，同时回收CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或两者的群。在一些实施方案中，该方法还包括对步骤ii的CD25⁺细胞群执行精细分选，以提供幼稚Treg细胞群、记忆Treg细胞群、iNKT细胞群或其任何组合。在一些实施方案中，回收CD45RA⁺细胞群，并进一步执行精细分选，以提供Treg、iNKT或两者的群。

示例分选方案2

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.对至少第一样品执行第一粗略分选，从而提供富集的CD34⁺细胞群；B.对第二样品执行第二粗略分选，从而提供Lin^-细胞群；C.对Lin^-细胞群执行第三粗略分选，从而提供CD45RA^-记忆T细胞群，并提供CD45RA⁺细胞群；以及D.对CD45RA⁺细胞群执行精细分选，从而提供Treg群(参见图2和3)。

在一些实施方案中，第二样品包含从步骤A回收的CD34^-细胞群(参见图3)。在一些实施方案中，第一样品包括至少一个单倍同一性的样品(参见图2A)。在一些实施方案中，第一样品包括至少两个单倍同一性的样品(参见图2B)。在一些实施方案中，第一样品包括动员的外周血、动员的单采血液成分术产品、骨髓、脐带血、未动员的血液、未动员的单采血液成分术产品或其任何组合。在一些实施方案中，第二样品包括外周血单核细胞(PBMC)、动员的外周血、动员的单采血液成分术产品、骨髓、脐带血、未动员的血液、未动员的单采血液成分术产品或其任何组合。在一些实施方案中，第一样品或第二样品是同种异体的、自体的或其组合。在一些实施方案中，第二样品来自HLA匹配的不相关供体、HLA匹配的同胞供体或其组合(参见图2A和B)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三粗略分选包括密度分离、四聚体抗体复合物介导的富集/耗尽、磁性激活细胞分选、单采血液成分术、白细胞去除术或其任何组合。

在一些实施方案中，精细分选可以包括使用基于多参数荧光的分子表型进行纯化。精细分选可以提供幼稚Treg细胞群、记忆Treg细胞群、iNKT细胞群或其任何组合。精细分选可以包括在一定条件下使CD45RA⁺细胞与特异性结合CD25的结合分子接触以提供CD25⁺细胞群和CD25^-细胞群，并回收CD25⁺细胞群，从而提供Treg群。在一些实施方案中，在一定条件下进一步分选CD25⁺细胞群，以提供幼稚Treg细胞群。在一些实施方案中，精细分选包括在一定条件下使CD45RA⁺细胞与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触，以提供CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或两者的群，并回收CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或两者的群。

示例分选方案3

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.在一定条件下使样品与特异性结合Lin⁺标志物的结合分子接触以提供Lin⁺细胞群和Lin^-细胞群，并回收Lin^-细胞群；B.在一定条件下使Lin^-细胞与特异性结合CD34的结合分子和特异性结合CD25的结合分子接触以提供CD34⁺细胞群、CD25⁺细胞群和CD34^-CD25^-细胞群，并回收CD34⁺细胞和CD25⁺细胞，并回收CD34^-CD25^-细胞群；以及C.在一定条件下使CD34^-CD25^-细胞群与特异性结合CD45RA的结合分子接触以提供CD45RA⁺细胞群和CD45RA^-细胞群，并回收CD45RA^-群(参见图4)。

在一些实施方案中，步骤B还包括在一定条件下使Lin^-细胞与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触以提供CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群，并回收CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合(参见图4)。在一些实施方案中，该方法还包括对CD34⁺细胞、CD25⁺细胞、CD1d-tet⁺细胞、6B11+细胞或其任何组合执行精细分选，从而提供CD34⁺细胞、CD25⁺细胞、CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其任何组合的群(参见图4)。在一些实施方案中，精细分选包括在一定条件下使CD34⁺细胞、CD25⁺细胞、CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其任何组合与特异性结合CD34的结合分子、特异性结合CD4的结合分子、特异性结合CD25的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触，以提供高度富集CD34⁺细胞、CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞、CD1d-tet⁺细胞或其组合的细胞群(参见图4)。

示例分选方案4

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.对样品执行粗略分选以提供Lin⁺细胞群和Lin^-细胞群，并回收Lin^-细胞群；B.对Lin^-细胞群执行粗略分选，提供富集HSPC和Tmem的群以及CD45RA⁺细胞群，并回收HSPC和Tmem的群，并回收CD45RA⁺细胞群；以及C.对CD45RA⁺细胞群执行精细分选，以提供Treg群(参见图5)。在一些实施方案中，精细分选还包括在一定条件下使CD45RA⁺细胞群与特异性结合CD34的结合分子、特异性结合CD4的结合分子和特异性结合CD127的结合分子接触以提供CD34⁺细胞群和CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞群，并回收CD34⁺细胞群和CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞群。在一些实施方案中，精细分选还包括使CD45RA⁺细胞群与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触，并回收CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群。在一些实施方案中，粗略分选包括密度分离、四聚体抗体复合物介导的富集/耗尽、磁性激活细胞分选、单采血液成分术、白细胞去除术或其任何组合。

示例分选方案5

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.在一定条件下使样品与特异性结合CD34的结合分子接触以提供CD34⁺细胞群和CD34^-细胞群，回收CD34⁺细胞群，并回收CD34^-细胞群；B.在一定条件下使CD34^-细胞群与特异性结合CD25的结合分子接触以提供CD25⁺细胞群和CD25^-细胞群，回收CD25⁺细胞群，并回收CD25^-细胞群；以及C.在一定条件下使CD25^-细胞群与特异性结合CD45RA的结合分子接触以提供CD45RA⁺细胞群和CD45RA^-细胞群，并回收CD45RA^-细胞群(参见图6、10、11、12)。

在一些实施方案中，步骤B还包括：i.在一定条件下使CD34^-细胞群与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触以提供CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合以及CD1d-tet^-细胞群、6B11^-细胞群或其组合，并回收CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合，从而提供iNKT耗尽的细胞群并回收CD1d-tet^-细胞群、6B11^-细胞群或两者，从而提供iNKT耗尽的细胞群；以及ii.在一定条件下使iNKT耗尽的细胞群与特异性结合CD25的结合分子接触以提供CD25⁺细胞群和CD25^-细胞群，并回收CD25⁺细胞群，并回收CD25^-细胞群(参见图6)。

在一些实施方案中，步骤B包括在一定条件下使CD34^-细胞群与特异性结合CD25和CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合的结合分子接触以提供CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群以及CD34^-CD25^-iNKT耗尽的细胞群，并回收CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群，并回收CD34^-CD25^-iNKT耗尽的细胞群(参见图10)。

在一些实施方案中，步骤B包括：i.在一定条件下使CD34^-细胞群与特异性结合CD25和CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合的结合分子接触以提供CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群，以及CD34^-CD25^-iNKT耗尽的细胞群，并回收CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群，并回收CD34^-CD25^-iNKT耗尽的细胞群；以及ii.通过使细胞与特异性结合CD4的结合分子、特异性结合CD25的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的任何组合接触，而对CD25⁺细胞群和CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其组合的群执行精细分选，以提供富集CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞、CD1d-tet⁺细胞、6B11⁺细胞或其任何组合的细胞群(参见图11)。

在一些实施方案中，步骤B包括：i.使CD34^-细胞群与包含标记(例如荧光藻红蛋白)和生物素化6B11单克隆抗体(6B11-生物素)的抗CD25抗体接触。然后使6B11-生物素与链霉亲和素接触，该链霉亲和素缀合有与抗CD25抗体相同的标记。在一些实施方案中，链霉亲和素与藻红蛋白/Cy7(SAv-PE/Cy7)缀合。然后使细胞与抗标记磁性颗粒接触。在一些实施方案中，磁性颗粒是抗PE磁性颗粒(例如，磁珠)。然后使用MACS分离CD25⁺细胞和6B11结合的细胞，以产生CD25⁺细胞和6B11⁺细胞的群，以及CD34^-CD25^-iNKT耗尽的细胞群(参见图15)。在一些实施方案中，步骤B还包括：ii.通过在一定条件下使细胞与特异性结合CD4的结合分子和特异性结合CD127的结合分子接触，而对CD25⁺细胞和6B11⁺细胞的群执行精细分选，以提供富集CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞的细胞群和富集6B11⁺CD127⁺细胞的细胞群，或其任何组合。在一些实施方案中，CD4结合分子是抗CD4 PerCP标记的抗体。在一些实施方案中，CD127结合分子是抗CD127 APC标记的抗体。精细分选可以包括FACS，其中检测到CD25-PE、6B11-生物素-SAv-PE/Cy7、CD4-PerCP和CD127-APC。

在一些实施方案中，在步骤A中回收的CD34⁺细胞群、在步骤B中回收的CD25⁺细胞群，或两者通过精细分选进一步处理，该精细分选包括使CD34⁺细胞、CD25⁺细胞或其组合与特异性结合CD34的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、特异性结合CD45RA的结合分子或其任何组合接触(参见图12)。

示例分选方案6

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括：A.在一定条件下使样品与特异性结合CD34的结合分子和特异性结合CD25的结合分子接触以提供CD34⁺细胞群、CD25⁺细胞群和CD34^-CD25^-细胞群，回收CD34⁺细胞群和CD25⁺细胞群，并回收CD34^-CD25^-细胞群；以及B.在一定条件下使CD34^-CD25^-细胞群与特异性结合CD45RA的结合分子接触以提供CD45RA⁺细胞群和CD45RA^-细胞群，并回收CD45RA^-细胞群(参见图7)。在一些实施方案中，步骤A还包括在一定条件下使样品与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触以提供CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合，并回收CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合(参见图7)。在一些实施方案中，该方法还包括通过使细胞与特异性结合CD34的结合分子、特异性结合CD4的结合分子、特异性结合CD25的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、CD1d-tet或其任何组合接触，来对步骤A中提供的细胞群执行精细分选，以提供富集CD34⁺细胞、CD4⁺CD25⁺CD127^-/Lo细胞、CD1d-tet⁺细胞或其任何组合的细胞群(参见图8)。

示例分选方案7

在某些实施方案中，用于产生药物组合物的方法包括同时处理样品以提供包含HSPC、Tmem、幼稚Treg、记忆Treg并包含少于5％的不期望的细胞类型的富集细胞群(参见图13)。在一些实施方案中，使样品与特异性结合CD34的结合分子、特异性结合CD4的结合分子、特异性结合CD8的结合分子、特异性结合CD25的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、特异性结合CD45RA的结合分子、特异性结合CD45RO的结合分子或其任何组合接触。在一些实施方案中，该方法还包括使样品与CD1d-tet、6B11单克隆抗体或其功能片段，或它们的组合接触，并回收CD1d-tet⁺细胞群、6B11⁺细胞群或其组合。在一些实施方案中，使样品与特异性结合CD34的结合分子接触，并回收CD34⁺细胞群，从而产生HSPC群。在一些实施方案中，使样品与特异性结合CD3且不结合特异性结合CD45RA的结合分子的结合分子、特异性结合CD45RO的结合分子或其组合接触，并回收CD3⁺CD45RA^-CD45RO⁺细胞群。在一些实施方案中，使样品与特异性结合CD4的结合分子、特异性结合CD25的结合分子、特异性结合CD127的结合分子、特异性结合CD45RA的结合分子、特异性结合CD45RO的结合分子或其任何组合接触，并回收CD4⁺CD25⁺CD127^-/lo CD45RA⁺CD45RO^-细胞群、CD4⁺CD25⁺CD127^-/lo CD45RA^-CD45RO⁺细胞群。

在任何前述实施方案中，治疗性细胞群包含少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％的幼稚常规αβ-T细胞。

在任何上述实施方案中，Lin⁺标志物可以是CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20或其任何组合。

在任何上述实施方案中，特异性结合CD34、Lin⁺标志物、CD25、CD45RA、CDR45RO、CD4、CD8、CD127、CD90、CD133、CD38、CD95、CD122、CXCR3、LFA-1、CD62L、CCR7或任何其他细胞标志物的分子是抗体或抗体片段。

如本文所用，术语“抗体”是广义的术语，并且以其普通含义使用，包括但不限于指代天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体、双功能和人源化抗体及其抗原结合片段。应当理解，选择抗体所针对的分子表位或区域将决定其特异性，例如对于各种分子形式(如果存在)或对于全体(例如，全部或基本上全部的分子)的特异性。

用于产生抗体的方法是公认的。本领域技术人员将认识到，许多程序可以用于产生抗体，例如，如Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow和David Lane编著,ColdSpring Harbor Laboratory(1988),Cold Spring Harbor,N.Y.中所述。本领域技术人员还应理解，可以通过各种程序(Antibody Engineering:A Practical Approach(Borrebaeck,C.编著),1995,Oxford University Press,Oxford；J.Immunol.149,3914-3920(1992))从遗传信息制备模拟抗体的结合片段或Fab片段。针对分子(例如蛋白质和标志物)的单克隆和多克隆抗体也可商购获得(R and D Systems,Minneapolis,Minn.；HyTest Ltd.,Turk,Finland；Abcam Inc.,Cambridge,Mass.,USA、Life Diagnostics,Inc.,West Chester,Pa.,USA；Fitzgerald Industries International,Inc.,Concord,Mass.,USA；BiosPacific,Emeryville,Calif.)。

在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在实施方案中，本公开内容的抗体与根据本方法提取的细胞群的下游应用相容。例如，本公开内容的抗体可以是非免疫原性的人源化抗体。在一些实施方案中，本公开内容的抗体包含表位标记，该表位标记用于在提取样品之前或之后固定抗体，从而从提取的细胞群中耗尽抗体。

在一些实施方案中，该抗体是生物素化的6B11抗体。6B11是与恒定TCR Va24Ja18结合的抗体。在一些实施方案中，6B11抗体在pH 5.5-6.0、6.0-6.5、6.5-7、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5或9.5-10下被生物素化。在一些实施方案中，6B11抗体在磷酸盐、硼酸盐或hepes缓冲剂中生物素化。在一些实施方案中，缓冲剂是无胺缓冲剂。生物素化反应可以在约0mM NaCl、50mM NaCl、100mM NaCL、150mM NaCl、300mM NaCl或500mM NaCl或中间值下进行。蛋白质(例如，抗体)的修饰位点包括游离胺、游离硫醇和碳水化合物、人工引入的叠氮化物和人工引入的炔烃。生物素的浓度可以在10μM-50μM、50μM-100μM、100μM-250μM、250μM-500μM、500μM-1mM、1mM-2mM、2mM-5mM、5mM-10mM之间变化。反应时间可以在10-30分钟、30分钟-1小时、1小时-1.5小时、1.5小时-2.5小时、2.5小时-6小时、6小时-10小时、10小时-18小时之间变化。本文公开的生物素化6B11抗体可以用于本文公开的任何方法中，以分选、纯化或分离Va24Ja18⁺细胞(iNKT细胞)群。

捕获结合配偶体和检测结合配偶体对，例如，捕获和检测抗体对，可以用于本公开内容的实施方案。因此，在一些实施方案中，使用这样的分选和纯化方案，其中通常使用两种结合配偶体，例如两种抗体。一种结合配偶体是通常固定在颗粒上的捕获配偶体，另一种结合配偶体是通常附接有可检测标签的检测结合配偶体。这样的抗体对可从几种商业来源获得，如BiosPacific,Emeryville,Calif.。抗体对也可以通过本领域公知的方法设计和制备。在特定的实施方案中，抗体被生物素化或生物素标记。

在一些实施方案中，存在第二成像组分，其非特异性地结合起始细胞群的所有成员。因此，可读取该信号以将腔间的荧光量标准化。一个示例是将会结合在起始细胞群的细胞表面普遍表达的一个或多个蛋白质的抗体。

在一些实施方案中，抗体或抗体片段与荧光染料、半抗原或磁性颗粒偶联或用其标记。

可以用于标记结合配偶体以使其能够在颗粒混合物中被检测或辨别的若干个策略是本领域公知的。标签可以通过任何已知的方式附接，包括利用非特异性或特异性相互作用的方法。此外，标记可以直接完成，也可以通过结合配偶体完成。

来自部分的发射，例如荧光，应足以允许使用本文所述的检测器进行检测。通常，本公开内容的组合物和方法利用高度荧光的部分，例如当被电磁辐射源在该部分的激发波长下激发时，能够发射电磁辐射的部分。若干个部分适用于本公开内容的组合物和方法。

除电磁辐射外，可被能量激活的标签在本公开内容中也有用。这样的标签可以通过例如电、热或化学反应来激活(例如，化学发光标签)。同样，许多酶促活化的标签是本领域技术人员公知的。

通常，该部分的荧光涉及量子效率和缺乏足够的光漂白(使该部分在公开的检测器中在高于背景水平下可被检测到)与对于测定所期望的检测限度、准确性和精确度所需的一致性的结合。

此外，该部分的性质与其在所选测定中的用途一致。在一些实施方案中，该测定是免疫测定，其中荧光部分附接至抗体；该部分必须具有使其不与其他抗体或蛋白质聚集的特性，或具有经历的聚集不超过符合所需的测定准确性和精确度的聚集的特性。在一些实施方案中，荧光部分染料分子具有以下的组合：1)高吸收系数；2)高量子产率；3)高光稳定性(低光漂白)；和4)与对感兴趣分子(例如，蛋白质)进行标记的相容性，以便可以使用本公开内容的分析仪器和系统进行分析(例如，不会引起感兴趣的蛋白质的沉淀，或该部分所附接的蛋白质的沉淀)。

荧光部分可以包括单个实体(量子点或荧光分子)或多个实体(例如，多个荧光分子)。应当理解，当本文中使用的术语“部分”是指一组荧光实体(例如，多个荧光染料分子)时，每个单独实体可以分别附接至结合配偶体，或者可以将实体附接在一起，只要实体作为一个组提供足够的荧光以供检测。

在一些实施方案中，荧光染料分子包含至少一个取代的吲哚环体系，其中在吲哚环的3-碳上的取代基包含化学反应基团或共轭物质。示例包括Alexa Fluor分子。

在一些实施方案中，标签包括第一类型和第二类型的标签，例如两种不同的ALEXA染料(Invitrogen)，其中第一类型和第二类型的染料分子具有不同的发射光谱。

用于荧光部分的有用荧光实体的非包含式清单包括：ALEXA488、ALEXA532、ALEXA555、ALEXA647、ALEXA700、ALEXA750、荧光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Atto 590和Qdot605。

标签可以通过本领域已知的任何方法附接于颗粒或结合配偶体上，包括吸收、共价结合、生物素/链霉亲和素或其他结合对。此外，标签可以通过连接体附接。在一些实施方案中，标签被分析物裂解，从而从颗粒释放标签。或者，分析物可以防止连接体的裂解。

分离的细胞群可以立即使用，或者可以在分离后使用本领域公知的方法在体外培养。细胞群可以在诸如RPMI-1640、DMEM、X-Vivo 10、X-vivo 15或其变体和组合的培养基中培养。培养基可以包含1-20％的人血清。培养基可以包含激活受体的细胞因子或分子，如雷帕霉素、SCF、SDF-1、TPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-33、TGF-b、IFNg、IFNa及其组合。细胞群可以用激动剂如颗粒(微米颗粒、纳米颗粒、蛋白质或细胞)刺激，该颗粒包含结合分子如抗CD3、抗CD28、CD64、CD86、抗IL-21R、CD137或其组合的多价展示。

此外，细胞可以冷冻，或者可以在分离前或分离后冷冻。在要将细胞储存更长时间的情况下，优选地在-80℃左右或在液氮中进行储存，以确保细胞在解冻后可以再次使用。为此，通常将细胞与培养基、葡萄糖等一起储存在DMSO和/或FCS/HS中。细胞解冻后，可立即将细胞直接用于治疗目的或体外实验，或者使用生长因子、抗原、细胞等使细胞扩增和/或分化。

实施例1

塑造的细胞移植物的产生

细胞的富集和耗尽发生在配制用于输注的最终产品的过程中的多个步骤中。下面以简要描述程序的方式对每个选择程序进行描述。此过程在图14中概述。

步骤A：在CLINIMACS细胞选择系统(Miltenyi Biotec,Bergish-Gladbach,Germany)上使用免疫磁性细胞选择来执行CD34⁺细胞富集。简而言之，当收集两个单采血液成分术产品并洗涤以去除过量的血浆和血小板时，合并供体单采血液成分术产品。根据制造商的指南，用补充有0.5％HSA(工作缓冲液)并添加IVIg的CLINIMACS缓冲液将体积调节至对于细胞数目和CD34⁺细胞含量所指定的体积，以减少Miltenyi微珠试剂与细胞的非特异性结合。根据制造商对于产品内容物的指南，用CLINIMACS CD34试剂标记细胞产品。通过用工作缓冲液稀释和离心去除来减少未结合的试剂。标记的细胞产品连接到CLINIMACS设备，该设备控制细胞向单次使用的管组中的加载，以进行标记细胞的免疫磁性选择。通过去除磁场来释放保留的细胞，并将其引导至附接到CLINIMACS管组的阳性级分袋。将富集CD34⁺的细胞重悬在作为指定输注介质的补充有2％HSA的Normosol-R中。保留阴性级分(CD34选择流过物)用于进一步细胞处理。

步骤B：使用CLINIMACS系统通过免疫磁性选择，从步骤A阴性级分(CD34选择流过物)富集调节性T细胞和iNKT细胞。调节级分体积，并用PE/Cy7缀合的CD1d(负载糖脂的)四聚体试剂和Miltenyi Biotec的抗CD25 PE试剂标记细胞。在洗涤以去除细胞悬浮液中未结合的试剂后，将细胞用抗PE微珠试剂标记，洗涤以去除未结合的珠，并使用LS管组加载到CLINIMACS上。标记的细胞保留在磁化柱上。去除磁场后，CD25⁺和CD1d(负载糖脂的)四聚体⁺细胞从该柱释放到与管组相附接的阳性级分袋中。保留含有耗尽CD25⁺和CD1d(负载糖脂的)四聚体⁺细胞的细胞的流过物(阴性级分)，用于随后的细胞选择程序(下文步骤C)。CD25⁺细胞和CD1d(负载糖脂的)四聚体⁺细胞的富集是下文步骤D中的进一步富集的中间步骤。

步骤C：使用CD45RA表达作为供体记忆细胞的指标，通过免疫磁性选择将CD25/CD1d富集的阴性级分中的细胞分为幼稚亚群和记忆亚群。制备细胞，并用CLINIMACSCD45RA试剂标记。在洗涤以去除细胞悬浮液中未结合的试剂后，将细胞分阶段加载到配备有耗尽管组的CLINIMACS上。标记的细胞保留在磁化柱上，并将其从柱上移到与管组相附接的靶细胞袋中。将包含耗尽CD45RA⁺细胞的细胞的流过物级分添加到最终产品中，以确保包含供体记忆细胞。

步骤D：使用BD FACS ARIA通过细胞分选进一步纯化Treg和iNKT细胞。对通过步骤B中CD25⁺和CD1d(负载糖脂的)四聚体⁺细胞的富集而回收的CD25⁺细胞进行体积调节，以用PerCP缀合的小鼠抗人CD4和APC缀合的小鼠抗人CD127单克隆抗体试剂以及附加的CD25 PE(Miltenyi Biotec)和CD1d(负载糖脂的)四聚体PE-Cy7进行标记。在洗涤以去除未结合的试剂后，用分选门分选细胞，该分选门被设置成针对包含CD4-PerCP⁺x CD25 PE+、CD127-APC dim/neg细胞(Treg)和CD127+x CD1d(负载糖脂的)四聚体-PE/Cy7⁺(iNKT)的分子表型的单一淋巴细胞。

将从细胞选择程序中回收并旨在用于输注的细胞亚群重悬于补充有0.5％HAS(白蛋白-人，25％，Grifols,Clayton,NC)的pH值为7.2的Normosol-R(Hospira,Lake Forest,IL)中。将细胞级分合并在单个输血袋中，最大密度为1x10⁸个细胞/ml，并置于2至8℃的连续监控的安全冰箱中。

实施例2

用抗iNKT抗体产生塑造的细胞移植物

细胞的富集和耗尽发生在配制用于输注的最终产品的过程中的多个步骤中。下面以简要描述程序的方式对每个选择程序进行描述。此过程在图15中概述。

步骤A：在CLINIMACS细胞选择系统(Miltenyi Biotec,Bergish-Gladbach,Germany)上使用免疫磁性细胞选择来执行CD34⁺细胞富集。简而言之，洗涤供体单采血液成分术产品，以去除过量的血浆和血小板。如果收集到两个供体单采血液成分术产品，则将其合并。根据制造商的指南，用补充有0.5％HSA(工作缓冲液)并添加IVIg的CLINIMACS缓冲液将体积调节至对于细胞数目和CD34⁺细胞含量所指定的体积，以减少Miltenyi微珠试剂与细胞的非特异性结合。根据制造商对于产品内容物指南，用CLINIMACS CD34试剂标记细胞产品。通过用工作缓冲液稀释和离心去除来减少未结合的试剂。标记的细胞产物连接到CLINIMACS设备，该设备控制细胞向单次使用的管组中的加载，以进行标记细胞的免疫磁性选择。通过去除磁场来释放保留的细胞，并将其引导至附接到CLINIMACS管组的阳性级分袋。将富集CD34⁺的细胞重悬在作为指定输注介质的补充有2％HSA的Normosol-R中。保留阴性级分(CD34选择流过物)用于进一步细胞处理。

步骤B：使用CLINIMACS系统通过免疫磁性选择，从步骤A阴性级分(CD34选择流过物)富集调节性T细胞和iNKT细胞。调节级分体积，并用抗CD25-PE(Miltenyi Biotec)和生物素缀合的6B11单克隆抗体(抗-iNKT)标记细胞。在洗涤以去除细胞悬浮液中未结合的试剂后，将细胞用PE/Cy7缀合的链霉亲和素标记，并再次洗涤。然后将细胞用抗PE微珠试剂(Miltenyi Biotec)标记，洗涤以去除未结合的珠，并使用LS TS管组，采用CD133富集程序加载到CLINIMACS上。标记的细胞保留在磁化柱上。去除磁场后，CD25⁺和6B11⁺细胞从该柱释放到与管组相附接的目标级分袋中。保留含有耗尽CD25⁺和6B11⁺细胞的流过物(非目标级分)，用于随后的细胞选择程序(下文步骤D)。CD25⁺细胞和6B11⁺细胞的富集是下文步骤骤C中的进一步富集的中间步骤。

步骤C：通过荧光激活细胞分选进一步纯化Treg和iNKT细胞。对通过步骤B中的CD25⁺和6B11⁺细胞的富集而回收的CD25⁺细胞进行体积调节，以用PerCP缀合的小鼠抗人CD4(Miltenyi Biotec)和APC缀合的小鼠抗人CD127单克隆抗体试剂(Miltenyi Biotec)和附加的CD25 PE(Miltenyi Biotec)和链霉亲和素PE-Cy7进行标记。在洗涤以去除未结合的试剂后，用分选门分选细胞，该分选门被设置成针对包含CD4-PerCP⁺x CD25 PE+、CD127-APCdim/neg细胞(Treg)和CD127+x 6B11-PE/Cy7⁺(iNKT)的分子表型的单一淋巴细胞。

步骤D：使用CD45RA表达作为供体记忆细胞的指标，通过免疫磁性选择将CD25/6B11阴性级分中的细胞分为幼稚亚群和记忆亚群。制备细胞，并用CLINIMACS CD45RA试剂标记。在洗涤以去除细胞悬浮液中未结合的试剂后，将细胞分阶段加载到配备有耗尽管组的CLINIMACS上。标记的细胞保留在磁化柱上，并将其从柱上移到与管组相附接的靶细胞袋中。将包含耗尽CD45RA⁺细胞的细胞的流过物级分添加到最终产品中，以确保包含供体记忆细胞。

将从细胞选择程序中回收并旨在用于输注的细胞亚群重悬于补充有0.5％HAS(白蛋白-人，25％，Grifols,Clayton,NC)的pH值为7.2的Normosol-R(Hospira,Lake Forest,IL)中。将细胞级分合并在单个输血袋中，最大密度为1x10⁸个细胞/ml，并置于2至8℃的连续监控的安全冰箱中。

表1.示例性塑造的移植物组合物的试剂和靶细胞数。

实施例3

清髓性造血细胞移植(ALLOMA-HCT)的鼠模型中塑造的细胞移植物与满含T细胞和耗尽 T细胞的同种异体移植物的比较

使用清髓和细胞移植物移植的鼠模型来评估本文所述的示例性塑造细胞移植物相比于已知细胞移植物的表现。图16描绘了实验程序的图解。为了模拟清髓的患者，称重8-12周大的BALB/c接受者小鼠，然后在第2天用来自Rad Source RS2000辐照器的400/400rad(160KeV，滤过0.5mm Cu)的分次剂量进行辐照。将小鼠切换成抗生素食物，持续6周。为了模拟残留疾病，在第1天，通过尾静脉向每只小鼠静脉内注射2,500–10,000个J774 GFP-Luc细胞。J774细胞系是最初衍生自BALB/c小鼠的骨髓样细胞系，并且与BALB/c接受者小鼠是同基因的。修饰J774细胞，以表达GFP和荧光素酶转基因。表2总结的三种不同的细胞组合物被用于模拟同种异体造血细胞移植(HCT)。如下所述，从C57Bl/6小鼠的造血组织制备细胞组合物，并在第0天通过BALB/c小鼠的眶后丛在静脉内输注。实验队列通常为5-9只小鼠。将7个独立实验的数据合并，如图17所示。

表2.施用于BALB/c小鼠的细胞组合物。

每天检查小鼠是否有不适。每周两次测量身体状况(BC)评分和体重。将BC≤1.5的小鼠安乐死。在体重小于其初始体重的70％的情况下死亡的小鼠被评为GVHD。移植后30天内死亡的体重大于70％的小鼠被评为移植失败。解剖所有死亡小鼠，并用荧光显微镜检查肝脏和脾脏中的肿瘤生长。将GFP+肿瘤结节的存在评为复发(参见图17C)。在第+10天，在Xenogen IVIS100上对一些小鼠队列进行生物发光成像(参见图17D)。

接受塑造的细胞移植物组合物的小鼠表现优于所有其他队列(参见图17A和图17B)。这些小鼠中有94％存活到第+175天，没有复发的证据。这些小鼠中有3％死于GVHD，3％死于移植失败。与BMT和HSPC组合物相比改善的表现表明GvL效果得以维持，但GVHD和移植失败率显著降低。

相比之下，所有接受BMT细胞组合物的小鼠在第+30天之前都死于GVHD。在第+10天的生物发光成像中，在这些小鼠中未发现复发的证据。此外，在尸检后未观察到造血器官上的肿瘤结节生长。该结果表明，移植物中的T细胞足以对抗癌细胞，并表明尽管在一致致死的GVHD的背景下，移植物具有强GvL。值得注意，在人患者中，同种异体移植物来源的HLA-单倍型与接受者紧密匹配，而BALB/c和C57Bl/6小鼠完全错配。因此，相对于这里观察到的GVHD反应，临床上观察到的GVHD反应被大大缓解。

接受HSCT细胞组合物的小鼠的结果不一。51％的小鼠长期存活至第+175天。9％的HSCT接受者因移植失败而死亡，由在体重大于70％的情况下在第+30天之前死亡证明。3％的小鼠死于GVHD，由在死亡前的最后一次测量中体重小70％证明。36％的小鼠在死亡时有复发的证据。该队列中的高复发率是由HSCT后较长时间的免疫抑制造成，因为移植后的最初几周T细胞计数一直较低。相比之下，人HSCT接受者也遭受在移植后第一年内的低T细胞计数和高复发率。因此，HSCT移植模型反映了由于T细胞耗尽而导致人患者缺乏GvL的情况。观察到在人患者中，相对于满含T细胞的同种异体移植物，用CD34⁺同种异体移植物治疗的复发率更高。

实施例4

ALLOMA-HCT鼠模型中由MACS/FACS与仅MACS产生的塑造细胞移植物的比较

该实验将上面所示的塑造的细胞移植物组合物数据与另一小鼠队列进行比较。在采用由仅MACS产生的塑造细胞移植物或由MACS和FACS的组合产生的塑造细胞移植物治疗的动物中评估GVL和GVHD(参见表3)。如上所述准备和跟踪这些小鼠。队列为5-7只小鼠，并且数据合并自3个独立实验。

表3.由仅MACS或MACS和FACS的组合产生的塑造的细胞移植物

如实施例3所述，MACS/FACS塑造的细胞移植物的小鼠使用MACS和FACS的组合来准备。FACS纯度通常大于95％。相比之下，仅MACS富集样品的纯度通常为20％-80％。仅MACS小鼠的同种异体淋巴细胞未通过FACS进一步纯化，并且该组合物的治疗益处严重受损。到第+175天，仅MACS小鼠中只有54％存活，相比之下，MACS/FACS塑造的细胞移植物小鼠的存活率为94％(参见图18)。所有致命病例的体重均小于起始体重的70％，表明GVHD是死亡原因。这些小鼠的尸检均未显示复发的证据。与MACS/FACS制造方法相比，仅MACS制造时高水平的致死GVHD证明了在清髓性造血细胞移植物(MA-HCT)的移植物工程化的背景下，纯度对这些细胞群的重要性。尽管不希望受到理论的束缚，但仅MACS塑造的细胞移植物所治疗的小鼠中普遍的GVHD被认为是Tcon细胞污染的结果。

实施例5

ALLOMA-HCT鼠模型中塑造的细胞移植物与加回T细胞的BMT的比较

将塑造的细胞移植物组合物与施用BMT组合物的队列进行比较，该组合物具有添加至cKIT+HSPC级分的不同量的T细胞(HSPC+ T细胞加回)。作为背景，T细胞加回是用于骨髓移植的实验性临床方法。例如，临床中心执行T细胞耗尽(例如，通常是CD34+细胞CLINIMACS分离)，然后将一些T细胞加回到移植物或以后移植。注意，在加回程序中，T细胞是大量(bulk)T细胞，因为T细胞是从收集的CD34^-级分提供的并且没有进一步处理。T细胞通常以比BMT移植物中天然存在的水平低10-1000倍的水平重新引入。

在本示例中，向每个加回队列施用cKIT+HSPC级分，该级分包含来自脾细胞的1x10⁵、2x 10⁵、4x 10⁵或2x 10⁶个加回的T细胞。相比之下，塑造的细胞移植物平均含有2.5x10⁵个T细胞。然而，一些塑造的细胞移植物实验使用多达5x 10⁶个塑造T细胞，而另一些则使用少至1x 10⁵个塑造的T细胞。

在完全错配的C57Bl/6淋巴细胞被过继转移到BALB/c小鼠的情况下，即使1×10⁵个T细胞也足以在100％的接受者中诱导致死GVHD(图19)。值得注意，在1x 10⁵至4x 10⁵个加回的T细胞之间施用的小鼠中，致死亡的时间延长，但没有小鼠长期存活。相比之下，塑造的细胞移植物治疗的小鼠中有94％(30/32)表现出长期存活至第+175天。没有小鼠尸检显示复发的证据。因此，塑造的细胞移植物组合物的T细胞组分既减轻了GVHD响应，又赋予了GVL治疗益处。简单地将减少数目的T细胞加回到cKIT+磁性富集的骨髓细胞中时未观察到相似的结果。

实施例6

ALLO-HCT异种移植模型中衍生自人的塑造的细胞移植物与未处理的PBMC相比GVHD发 作时间延迟

在血小板去除法程序后，从4位人供体回收了LRS室的白细胞浓缩物。通过密度梯度(Ficoll)和ACK裂解去除红细胞。洗涤所得的PBMC，并将来自每个供体的2.5×10⁸个细胞处理为塑造的细胞移植物淋巴细胞级分。更具体地说，最初使用MACS处理Treg和iNKT(即，粗略分选)。样品用抗-CD25 PE和生物素缀合的抗-iNKT抗体6B11染色，然后洗涤；用链霉亲和素PE-Cy7染色，然后再洗涤；并用抗PE微珠染色。然后使用MiltenyiAutoMACS上的Possel_S程序对样品进行阳性富集。将阳性富集的级分进一步用抗-CD127APC和抗-CD4 PerCP染色，并根据以下参数在BD FACSAriaII上进一步纯化至>98％的纯度：Treg：CD4⁺CD25⁺CD127^-和iNKT：CD127⁺6B11⁺。

来自AutoMACS柱的阴性级分进一步用抗-CD45RA微珠染色，并使用Deplete_S程序耗尽CD45RA+级分中的幼稚T细胞。剩余细胞是指示记忆T细胞的CD45RA-CD45RO+。

塑造的细胞移植物根据每个亚型的最终产率配制，该亚型在供体之间有所不同。PBMC队列被配制为将CD3⁺ T细胞数目与来自匹配供体的塑造细胞移植物组合物中的记忆T细胞数目匹配成相等。最终制剂的范围如表4所示。

表4.淋巴细胞制剂

对于异种移植实验，使用免疫缺陷(NSG)小鼠，因为功能性鼠免疫系统会根据物种特异性差异迅速排斥进入的人组织。NSG小鼠缺少B、T和NK细胞，使其适合作为异种移植实验的宿主。为了进一步使宿主准备植入淋巴细胞，给予小鼠非致命剂量的辐射。从RadSource RS2000辐照器用250rad(160KeV，滤过0.5mm Cu)辐射NSG，并切换成抗生素饲料。在同一天，对于每个供体，将配制的细胞注射到每个队列5只小鼠中，并如上所述追踪。在这种情况下，已知人PBMC引起强烈的GVHD响应。结果表明，接受塑造的细胞移植物淋巴细胞的小鼠中有70％存活至第+90天，相比之下，接收等剂量的在PBMC中的CD3+细胞的小鼠中只有15％存活至第+90天(参见图20)。在所有死亡病例中，GVHD被评为死亡原因。人淋巴细胞对鼠组织的异种响应很强；然而，塑造的细胞移植物不仅会延迟致死GVHD的发作(这将具有临床价值)，而且还会使很大一部分小鼠持久存活。

实施例7

调节性T细胞和iNKT的分离

以下实验展示了用于产生Treg和iNKT细胞级分的方法，用于塑造的细胞移植物组合物和疗法。如实施例6所示，从来自3个供体的血沉棕黄层LRS室中分离外周血单核细胞(PBMC)。合并PBMC，然后以2x 10⁸个细胞/ml的浓度重悬并染色。Treg用抗-CD25 PE染色，并将iNKT细胞在室温下用生物素缀合的6B11抗体(抗-iNKT)染色30分钟，洗涤，然后在室温下用链霉亲和素PE-Cy7染色10分钟。通过用缓冲液洗涤细胞来去除过量的抗体，然后用抗-PE微珠以2x 10⁸个细胞/mL染色。细胞在室温下用抗-PE微珠染色30分钟。染色后，细胞用缓冲液洗涤，并通过40μm孔滤网过滤以去除团块，然后分离。使用CLINIMACS LS TS管组按照制造商的CD133富集方案(加载速度：每分钟10mL，重新加载3次)对细胞进行分选。在阳性级分中收集Treg和iNKT富集的细胞，并在阴性级分中收集其余细胞。相对于每个样品的样品测量体积，移取已知体积的一定级分，并使用参考珠在Beckman Coulter Cytoflex上计数并用于计算产率。

通过计算富集级分中的Treg和iNKT细胞相对于富集前细胞的纯度和产率，可以评估从PBMC中分离Treg和iNKT细胞的表现。在使用抗-PE珠的代表性实验中，Treg的纯度从约5％增加至60％(图21A和表5)。所测试的抗-PE珠将NKT细胞的纯度从0.02％增加至0.04％(图21B和表6)。

表5.Treg细胞的纯度百分比和产率。

表6.iNKT细胞的纯度百分比和产率

这些数据表明，通过仔细滴定磁性选择试剂，可以获得更高纯度的富集细胞，而不会不利地影响产率。此外，该阴性级分可以在与粗PBMC产品相似或相同的条件下进行再处理，以回收更多的靶细胞。这一意料之外的发现使该过程能够满足CLINIMACS后Treg/iNKT级分的目标规格。

实施例8

记忆T细胞的分离

如实施例6所示，从来自3个供体的血沉棕黄层LRS室中分离PBMC。合并PBMC，然后将1x 10⁹个细胞以2x 10⁸个细胞/mL重悬。用制造商推荐的CD45RA微珠用量的一半(0.5μL抗-CD45RA每6.6x 10⁶个PBMC，而不是1.0μL抗-CD45RA每6.6x 10⁶个PBMC)将细胞染色。洗涤细胞，并在CLINIMACS耗尽2.1(6mL/min流速)上运行。收获并分析阳性和阴性级分。相对于每个样品的样品级分的测量体积，移取已知体积的一定级分，并用针对CD3、CD45RA和CD45RO的荧光缀合的单克隆抗体染色，洗涤，并使用参考珠在Beckman Coulter CYTOFLEX流式细胞仪上计数，以计算纯度和产率(图22)。

通过计算富集级分中的CD3⁺CD45RA⁺和CD3⁺CD45RO⁺细胞相对于富集前细胞的纯度和产率，评估幼稚T细胞(Tn)和记忆T细胞分离的表现。使用制造商推荐的CD45RA微珠剂量的一半，Tmem与Tn之比从起始PBMC样品中的2.25:1变为仅处理样品中的50298:1(表7)。此外，该过程之后的Tmem的产率为27.5％。这些研究证明了用减少量的CD45RA微珠制造塑造的细胞移植物的可行性。

表7.使用磁性分选对耗尽的CD45RA⁺细胞进行记忆T细胞富集的表现

CD45RA耗尽	Tmem:Tn	产率
			1μl试剂每12.3M	50298	27.5％
目标	10000	66.0％
			最小	10000	22.0％

实施例9

调节性T细胞和幼稚调节性T细胞的分离

以下实验表征了通过本文公开的示例性方法产生的Treg群。如实施例6所示，从来自2个供体的血沉棕黄层LRS室中分离PBMC。合并PBMC，然后以2x 10⁸个细胞/ml的浓度重悬并染色。使用抗-CD25磁性微珠对Treg进行分选。使用CLINIMACS LS TS管组按照制造商的CD133耗尽方案对细胞进行分选(加载速度：每分钟10mL，重新加载3次)。在阳性级分中收集富集Treg的细胞，在阴性级分中收集其余细胞。

根据制造商的说明，将富集Treg的级分用抗-CD25 PE、CD4PerCP、CD127APC、CD45RA-FITC和CD45RO-APC-Cy7染色。通过用缓冲液洗涤细胞来去除过量的抗体。使用参考珠在Beckman Coulter Cytoflex上对Treg富集的级分进行计数，并用于计算纯度和产率。通过计算富集级分中的Treg细胞相对于富集前细胞的纯度和产率，评估从PBMC分离Treg的表现。

图23A表明Treg阳性级分包含88.5％的CD4⁺CD25⁺细胞，其中81.0％是CD127⁺。此外，图23A表明CD4⁺CD25⁺CD127⁺细胞群(Treg)包含67.1％的记忆Treg(CD45RO⁺)和17.8％的幼稚Treg(CD45RA⁺)。图23B提供了Treg阳性级分中总Treg和幼稚Treg的纯度和产率的总结。

该数据表明，本文描述的方法提供了包括大量幼稚Treg的Treg群，该幼稚Treg在CD45RA耗尽步骤中会丧失。

实施例9

6B11的生物素化

6B11是与恒定TCR Va24Ja18结合的抗体。然而，当与第二荧光团或其他分子柄缀合时，该试剂的效力和特异性通常表现较差。然而，当改变使用的生物素化条件时，可以实现出乎意料的良好表现。

将6B11杂交瘤在pH 7.5的PBS中修饰2小时，其中用三种不同浓度的EZ-LINK硫代-NHS-生物素(ThermoFisher)修饰1小时，然后脱盐。生物素化的抗体和条件如下：6B11.1＝100μM(条件1)；6B11.2＝250μM(条件2)；和6B11.3＝1mM(条件3)。

用6B11.1(条件1)、6B11.2(条件2)或6B11.3(条件3)抗体分析iNKT细胞，以评估在增加浓度的6B11抗体(0μg/μL、0.015μg/μL、0.032μg/μL、0.062μg/μL、0.0125、0.25μg/μL、0.5μg/μL和1μg/μL)下与来自三个不同供体(供体73、供体74和供体75)的细胞样品的结合。图24A显示，6B11.2生物素化的抗体具有优异的表现。

结合CD127和链霉亲和素PE-Cy7，用6B11.1(条件1)、6B11.2(条件2)或6B11.3(条件3)抗体对iNKT细胞进行分析。图24B显示，条件2提供了对iNKT细胞的最清晰的分离(4.85％)。所描绘的散点图是在CD3+单一细胞淋巴细胞上预先经分选门分选的。

上述各种实施方案可以组合以提供进一步的实施方案。本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括但不限于于2016年11月14日提交的美国临时专利申请号62/421,979和于2017年3月15日提交的美国临时申请号62/471,769，通过引用整体并入本文，除非参考文献或其一部分的并入与本公开内容相抵触。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念来提供更进一步的实施方案，可以修改实施方案的各方面。

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