阅读说明：本技术 检测非乳糜泻谷蛋白敏感性的组合物和方法 (Compositions and methods for detecting non-celiac gluten sensitivity ) 是由 W·J·杰森 A·L·卡塔耶夫 于 2018-05-11 设计创作，主要内容包括：公开了用于检测与非乳糜泻谷蛋白敏感性(NCGS)相关的蛋白质的组合物和方法。这类标志物可能有助于允许易患NCGS的个体控制其食物摄取以避免症状和疾病的进一步发展。(Compositions and methods for detecting proteins associated with non-celiac gluten sensitivity (NCGS) are disclosed. Such markers may help to allow individuals predisposed to NCGS to control their food intake to avoid further development of symptoms and disease.)

具体实施方式

中阐述的数值是尽可能精确地报告的。但是，任何数值都固有地包含某些误差，这些误差必然是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，规定的范围“1到10”应被认为包括最小值1和最大值10(包括最小值1和最大值10)之间的任何和所有子范围；也就是说，所有子范围均以最小值1或更大的值(例如1至6.1)开始，并且以最大值10或更小的值(例如5.5至10)结束。另外，任何被称为“并入本文”的参考文献应理解为整体并入。

还应注意的是，如在本说明书中使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非清楚明确地限于一个指示物。术语“和/或”通常用于指代至少一个或另一个。在某些情况下，术语“和/或”与术语“或”可互换使用。术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”并与其可互换使用。术语“例如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”并与其可互换使用。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。专业人员特别针对Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)来获得本领域的定义和术语。

同样如本文所使用的，“至少一个”考虑从1到整个组的任何数字。例如，对于列出四个标记，短语“至少一个”应理解为表示1、2、3或4个标记。

同样如本文所使用的，“包括”包括使用术语“由...组成”更具体地定义的实施例。

抗体：如本文所使用的，术语“抗体”是指由基本上通过免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链通常被分类为κ或λ。重链通常被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们依次分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。每条链的N端定义了大约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。抗体可以对特定抗原具有特异性。抗体或其抗原可以为分析物或结合伴侣。抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或以各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)’2，这是Fab的二聚体，它本身是一条通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下还原，以破坏铰链区的二硫键，从而将(Fab’)2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,RavenPress,N.Y.(1993)，以获得其他抗体片段更详细的描述)。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域普通技术人员将理解，可以通过化学或利用重组DNA方法从头合成此类Fab’片段。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过完整抗体的修饰或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。在一些实施方案中，抗体为单链抗体，例如单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。单链Fv(“scFv”)多肽为共价连接的VH::VL异二聚体，其可以从包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列的核酸中表达。(参见，例如，Huston,等.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883，其全部内容通过引用并入本文。)存在许多用于将天然聚集的但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转化为scFv分子的结构，scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本相似的三维结构。参见，例如，U.S.Pat.Nos.5091513和5132405和4956778。

术语“抗体”包括例如通过组合诱变和噬菌体展示产生的单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体和嵌合抗体。术语“抗体”还包括抗体的模拟物或拟肽。拟肽是基于或衍生自肽和蛋白质的化合物。本公开内容的拟肽通常可以通过使用非天然氨基酸、构象限制、电子等排取代等对已知肽序列进行结构修饰来获得。

等位基因：如本文所使用的，术语“等位基因”是指同一基因位点(例如基因)的核苷酸序列的不同版本。

等位基因特异性引物延伸(ASPE)：如本文所使用的，术语“等位基因特异性引物延伸(ASPE)”是指利用与对应DNA序列杂交的引物进行突变检测的方法，其取决于所述引物的3’末端核苷酸的成功杂交来进行延伸。通常，将具有3'末端核苷酸且与目标序列形成完美匹配的延伸引物进行延伸以形成延伸产物。可以将经修饰的核苷酸并入延伸产物中，这样的核苷酸有效地标记延伸产物以用于检测目的。或者，延伸引物可替代地包含与靶序列形成错配的3'末端核苷酸。在这种情况下，除非用于延伸的聚合酶无意中具有核酸外切酶活性，否则不会发生引物延伸。

扩增：如本文所使用的，术语“扩增”是指本领域已知的用于复制靶核酸从而增加所选核酸序列的拷贝数的任何方法。扩增可以为指数的或线性的。靶核酸可以为DNA或RNA。通常，以这种方式扩增的序列形成“扩增子”。扩增可用多种方法完成，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、基于转录的扩增、等温扩增、滚环扩增等。可以用引物对的相对相似量的每个引物进行扩增，以产生双链扩增子。但是，如本领域中众所周知的，不对称PCR可以主要或专门用于扩增单链产物(例如Poddar等.Molec.And Cell.Probes 14:25-32(2000))。这可以通过相对于引物对中的一个引物显著降低另一个引物的浓度(例如相差100倍)来使用每个引物对来实现。通过不对称PCR的扩增通常是线性的。技术人员将理解不同的扩增方法可以一起使用。

动物：如本文所使用的，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以为转基因动物、基因工程动物和/或克隆。

近似：如本文所使用的，术语“近似”或“大约”应用于一个或多个目标值，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％的情况下)，术语“近似”或“大约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低的范围内的值。同样，在整个申请中，术语“大约”用于表示包括设备的固有误差变化、用于确定该值的方法或样本之间存在的变化的值。

与目标综合症或疾病相关：如本文所使用的，“与目标综合症或疾病相关”是指与非综合征或非疾病对照相比，在具有目标综合症或疾病的患者中发现变体的比例更高。通常，可以通过分析多个患者来确定这种关联的统计显著性。

生物样品和样品：如本文所使用的，术语“生物样品”涵盖从生物来源获得的任何样品。通过非限制性实施例，生物样品可以包括血液、血清、血浆、组织活检、无细胞DNA、羊水、浆液、尿液、粪便、表皮样品、皮肤样品、面颊拭子、***、羊水、培养的细胞、骨髓样本和/或绒膜绒毛。方便的生物样品可以通过例如从颊腔表面刮下细胞而获得。术语生物样品包括已经被处理以释放核酸或蛋白质或以其他方式使核酸或蛋白质可用于本文所述的检测的样品。例如，生物样品可以包括通过从生物样品中的细胞逆转录RNA获得的cDNA。所述生物样品可以从生命阶段(例如胎儿、青少年、成年人等)获得。也可以使用固定或冷冻的组织。

生物标志物：如本文所使用的，术语“生物标志物”是指一种或多种核酸、多肽和/或其他生物分子(例如胆固醇、脂质)，其可单独或与其他生物标志物组合用于诊断或帮助目标疾病或综合症的诊断或预后；监测目标疾病或综合症的进展；和/或监控目标综合症或疾病的治疗效果。

结合剂：如本文所使用的，术语“结合剂”是指可以特异性地和选择性地结合至第二(即不同)目的分子的分子。相互作用可以为非共价(例如由于氢键、范德华相互作用或静电或疏水相互作用的结果)或者可以为共价。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物缔合(即共价或非共价结合)的结合剂。

携带者：术语“携带者”是指无症状但携带可以传递给他/她的孩子的突变的人。通常，对于常染色体隐性遗传疾病，携带者具有一个包含引起疾病的突变等位基因以及正常的或与疾病无关的第二等位基因。

编码序列与非编码序列：如本文所使用的，术语“编码序列”是指可被转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段的核酸序列或其互补序列或其部分序列。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录本中的外显子，其通过细胞的生化机制连接在一起以提供成熟的mRNA。反义链为这种核酸的互补物，并且可以从其推导出编码序列。如本文所使用的，术语“非编码序列”是指在体内不转录成氨基酸或与tRNA不相互作用以放置或试图放置氨基酸的核酸序列或其互补序列或其部分序列。非编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录本以及与基因相关的序列(例如启动子、增强子、沉默子等)中的内含子序列。

补体：如本文所使用的，术语“补体”、“互补”和“互补性”是指根据Watson/Crick配对规则的核苷酸序列配对。例如，序列5'-GCGGTCCCA-3'具有互补序列5'-TGGGACCGC-3'。互补序列也可以是与DNA序列互补的RNA序列。天然核酸中不常见的某些碱基可包括在互补核酸中，包括但不限于肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补不一定是完美的；稳定的双链体可能包含不匹配的碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以考虑多种变量(包括诸如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率)凭经验确定双链体稳定性。

保守的：如本文所使用的，术语“保守残基”是指在具有相同结构和/或功能的多种蛋白质中相同的氨基酸。保守残基的区域对于蛋白质结构或功能可能是重要的。因此，在三维蛋白质中鉴定出的连续保守残基对于蛋白质结构或功能可能是重要的。为了找到保守残基或3-D结构中的保守区域，可以对来自不同物种或相同物种的个体的相同或相似蛋白质的序列进行比较。

对照：如本文所使用的，术语“对照”具有其本领域理解的含义，其是与结果进行比较的标准。通常，对照通过隔离变量来增加实验的完整性，以便得出有关此类变量的结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较物的反应或测定。在一个实验中，应用了“测试”(即正在测试的变量)。在第二个实验，未应用“对照”、正在测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即先前进行的测试或测定或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是又或者是包括打印的或以其他方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。

生物标志物的“对照”或“预定标准”是指健康受试者中生物标志物的表达水平或来自同一受试者的未患病或无症状的组织中所述生物标志物的表达水平。给定生物标志物的对照或预定标准表达水平或蛋白质量可以通过仅使用常规实验的前瞻性和/或回顾性统计研究来确定。这样的预定标准表达水平和/或蛋白质水平可以由本领域普通技术人员使用众所周知的方法来确定。

粗品：如本文所使用的，术语“粗品”当与生物样品联系而使用时，是指基本上未精制的样品。例如，粗品可以是细胞裂解物或活检组织样品。粗品可能以溶液或作为干制剂形式存在。

缺失：如本文所使用的，术语“缺失”涵盖从天然存在的核酸中去除一个或多个核苷酸的突变。

目标疾病或综合症：如本文所使用的，目标疾病或综合症为NCGS。本文使用的NCGS包括非乳糜泻小麦敏感性(NCWS)。

检测：如本文所使用的，术语“检测”包括“测量”，反之亦然。

可检测部分：如本文所使用的，术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报道分子”是指能够在定量测定中测量的分子。例如，可检测部分可包括可用于将底物转化为可测量的产物(例如可见产物)的酶。或者，可检测部分可以为能被定量的放射性同位素。或者，可检测部分可以为荧光团。或者，可检测部分可以为发光分子。或者，可以使用其他可检测分子。

表观遗传：如本文所使用的，表观遗传因素能够通过不同于基础DNA序列变化的机制改变基因表达。这样的因素可以包括调节变异、印记、基因沉默、X染色体失活、位置效应、重编程、移位、母体效应、组蛋白修饰和异染色质的因素。

表位：如本文所使用的，术语“表位”是指与特定抗体或抗体样蛋白质接触的分子或分子化合物(例如多肽或蛋白质复合物)的片段或部分。

外显子：如本文所使用的，外显子是在RNA的其他部分(例如被称为内含子的中间区域)已通过RNA剪接除去后，在成熟或经加工的RNA中发现的核酸序列。因此，外显子序列通常编码蛋白质或蛋白质的一部分。内含子是通过RNA剪接从周围外显子序列中除去的RNA部分。

表达和表达的RNA：如本文所使用的，表达的RNA是编码蛋白质或多肽的RNA(“编码RNA”)，以及转录但未翻译的任何其他RNA(“非编码RNA”)。本文所用的术语“表达”是指从DNA中产生多肽的过程。所述过程涉及基因转录成mRNA和所述mRNA翻译成多肽。取决于所使用的上下文，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。

可以通过用于检测转录分子或其对应蛋白质表达的多种众所周知的方法中的任一种来评估本公开内容的蛋白质量的测量和/或生物标志物的表达。此类方法的非限制性实施例包括用于检测分泌蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。在某些实施方案中，使用抗体(例如放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物缀合的抗体或与蛋白质-配体对{例如生物素-链霉亲和素}的蛋白质或配体缀合的抗体)或与对应于标记基因的蛋白质(例如由对应于标记基因的开放阅读框编码的蛋白质或已经历其全部或部分正常翻译后修饰的蛋白质)特异性结合的抗体片段(例如单链抗体、经分离的抗体高变域等)来评估标记基因的表达。在某些实施方案中，试剂可以直接或间接地用可检测物质标记。可检测物质可以例如选自由放射性同位素、荧光化合物、酶和酶辅因子组成的组。标记抗体的方法是本领域众所周知的。

在另一个实施方案中，通过从样品中的细胞制备mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)，并且通过使mRNA/cDNA与作为包含所述标记基因及其片段的多核苷酸的互补物的参考多核苷酸杂交来评估标记基因的表达。在与参考多核苷酸杂交之前，可以选择使用多种聚合酶链反应方法中的任何一种来扩增cDNA。优选地，它不被扩增。

家族病史：如本文所使用的，术语“家族病史”通常是指与包括父母和兄弟姐妹在内的个人直系亲属有关的事件(例如疾病相关病症或突变携带者)的发生。家族史也可能包括祖父母和其他亲戚。

侧翼：如本文所使用的，术语“侧翼”是指引物与旨在靶上扩增的目标区域邻接的靶核酸杂交。本领域技术人员将理解，优选的引物为与目标区域3'杂交的引物对，在靶双链DNA分子的每条链上的一个引物使得核苷酸可以通过合适的DNA聚合酶加入引物的3'末端。例如，侧翼突变序列的引物实际上不与突变序列退火，而是与邻接突变序列的序列退火。在某些情况下，通常设计为在外显子侧翼的引物不与外显子序列退火，而是与邻接外显子的序列退火(例如内含子序列)。但是，在某些情况下，扩增引物可设计为与外显子序列退火。

基因：如本文所使用的，基因为遗传单位。通常，基因是编码蛋白质或功能性RNA的DNA的一部分。基因是对应于遗传单位的基因组序列的可定位区域。基因可以与调节区、转录区和/或其他功能序列区相关。

基因型：如本文所使用的，术语“基因型”是指生物的遗传组成。更具体地说，所述术语是指个体中存在的等位基因的身份。个体或DNA样品的“基因分型”是指在已知多态性位点处根据核苷酸碱基鉴定个体拥有的两个等位基因的性质。

基因调控元件：如本文所使用的，基因调控元件或调控序列为DNA的片段，其中结合诸如转录因子的调控蛋白以调控基因表达。这样的调节区通常在被调节基因的上游。

健康个体：如本文所使用的，术语“健康个体”或“对照”是指尚未被诊断患有目标综合征和/或疾病的受试者。

杂合子：如本文所使用的，术语“杂合子”或“HET”是指具有相同基因的两个不同等位基因的个体。如本文所使用的，术语“杂合子”包括“复合杂合子”或“复合杂合子突变体”。如本文所使用的，术语“复合杂合子”是指具有两个不同等位基因的个体。如本文所使用的，术语“复合杂合子突变体”是指具有两个不同拷贝的等位基因的个体，这种等位基因被表征为基因的突变体形式。

纯合子：如本文所使用的，术语“纯合子”是指具有相同等位基因的两个拷贝的个体。如本文所使用的，术语“纯合突变体”是指具有相同等位基因的两个拷贝的个体，这种等位基因被表征为基因的突变体形式。

杂交：如本文所使用的，术语“杂交”是指两条互补核酸链在适当严格的条件下彼此退火的过程。适用于杂交的寡核苷酸或探针的长度通常为10-100个核苷酸(例如长度为18-50、12-70、10-30、10-24、18-36个核苷酸)。核酸杂交技术是本领域众所周知的。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所需水平的互补性序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的示例，参见，例如Sambrook,等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等.1994,Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。

同一性或同一性百分比：如本文所使用的，术语“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。同一性百分比可以通过比对两个序列来确定，并且是指被比较序列共有的位置上相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数目。序列比对和比较可以使用本领域中的算法标准进行(例如Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2444)或通过这些算法的计算机版本(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,WI)以BLAST和FASTA公开提供。另外，通过National Institutes ofHealth,Bethesda MD获得的ENTREZ可用于序列比较。在其他情况下，可以使用商用软件(例如GenomeQuest)确定同一性百分比。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN；可在Internet site for the National Center forBiotechnology Information获得)。在一个实施方案中，可以使用缺口权重为1的GCG确定两个序列的同一性百分比，使得每个氨基酸缺口被加权，犹如它是两个序列之间的单个氨基酸错配一样。或者，可以使用ALIGN程序(2.0版)，该程序为GCG(Accelrys,San Diego,CA)序列比对软件包的一部分。

如本文所使用的，术语至少90％相同包括与所指示序列具有90-100％同一性的序列，并且包括其间的所有范围。因此，术语至少90％相同包括91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％的序列与指示的序列相同。类似地，术语至少70％相同包括范围在70％至100％相同性之间的序列，所有范围在两者之间。使用本文描述的算法确定同一性百分比。

***或添加：如本文所使用的，术语“***”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列的变化，与天然存在分子相比，其分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的添加。

体外：如本文所使用的，术语“体外”是指在人工环境中(例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物内发生的事件。

体内：如本文所使用的，术语“体内”是指在多细胞生物(例如非人类动物)内发生的事件。

分离的：如本文所使用的，术语“分离的”是指(1)在最初生产时已与其相关联的至少一些组分分离(无论是在自然界中和/或在实验环境中)和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与其最初关联的其他组分至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％分开。在一些实施方案中，分离的试剂大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、98％、约99％、基本上100％或100％的纯度。如本文所使用的，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。如本文所使用的，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物中的细胞。

标记的：术语“标记的”和“用可检测试剂或部分标记的”在本文中可互换使用，以指定可通过检测标记(例如可视化、放射性检测等)来测量实体(例如核酸探针、抗体等)，例如在结合至另一实体(例如核酸、多肽等)之后进行的检测。可以选择可检测的试剂或部分，使其产生可以被测量并且其强度与结合实体的量有关(例如成比例)的信号。用于标记和/或检测蛋白质和肽的各种系统是本领域已知的。标记的蛋白质和肽可通过合并或缀合可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学、化学或其他方式检测的标记来制备。标记或标记的部分可以直接检测(即不需要任何进一步的反应或操作即可检测，例如荧光团可直接检测)或间接检测(即通过与另一种可检测的实体反应或结合使其可检测，例如半抗原可通过与包含报道分子(例如荧光团)的适当抗体反应后进行免疫染色来检测)。合适的可检测试剂包括但不限于放射性核苷酸、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标、适配体信标等。

microRNA：如本文所使用的，microRNA(miRNAs)为短的(20-24个核苷酸)非编码RNAs，其参与基因表达的转录后调节。microRNA可以影响mRNAs的稳定性和翻译。例如，microRNAs可以结合靶mRNAs的3'UTR中的互补序列，并导致基因沉默。miRNAs被RNA聚合酶II转录为加帽和聚腺苷酸化的初级转录本(pri-miRNAs)的一部分，所述初级转录本可以是编码蛋白质的也可以是非编码的。初级转录物能被Drosha核糖核酸酶III酶切割以产生约70个核苷酸的茎环前体miRNA(pre-miRNA)，然后可以被细胞质Dicer核糖核酸酶切割以生成成熟的miRNA和反义miRNA星(miRNA*)产物。可以将成熟的miRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其可以通过与miRNA的不完美碱基配对来识别靶mRNA，并且最常见的是导致靶mRNA的翻译抑制或不稳定。

多重PCR：如本文所使用的，术语“多重PCR”是指同时扩增两个或更多个区域，每个区域使用不同的引物对引发。

多重ASPE：如本文所使用的，术语“多重ASPE”是指结合多重PCR和等位基因特异性引物延伸(ASPE)以检测多态性的测定。通常，使用多重PCR首先扩增将作为ASPE引物靶序列的DNA区域。参见等位基因特异性引物延伸的定义。

突变和/或变体：如本文所使用的，术语突变和变体可互换使用，以描述核酸或蛋白质序列的变化。如本文所使用的术语“突变体”是指基因的突变或潜在的非功能形式。所述术语包括致使基因不起作用的如本领域已知的点突变至大的染色体重排的任何突变。

核酸：如本文所使用的，“核酸”为多核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))。所述术语用于包括单链核酸、双链核酸以及由核苷酸或核苷类似物制成的RNA和DNA。

多肽或蛋白质：如本文所使用的，术语“多肽”和/或“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，而不是特定的长度。因此，在多肽和/或蛋白质的定义内包括肽、寡肽和蛋白质。“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以描述可包含部分或全长蛋白质的蛋白质分子。除非上下文另外指出，否则术语“肽”用于表示小于全长的蛋白质或非常短的蛋白质。

如本领域中已知的，“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“寡肽”为氨基酸(通常为L-氨基酸)的链，其α碳通过由一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接。通常，组成蛋白质的氨基酸按顺序编号，从氨基末端残基开始，并朝着蛋白质的羧基末端残基的方向增加。用于氨基酸残基的缩写是本领域中用来指20种常见L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

如本文所使用的，多肽或蛋白质的“域”包括沿着多肽或蛋白质的区域，所述区域包含独立的单元。可以根据结构、序列和/或生物学活性来定义域。在一个实施方案中，多肽域可包含蛋白质区域，所述区域以基本上独立于其余蛋白质的方式折叠。可以使用域数据库(例如但不限于PFAM，PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISREC PROFILES、SAMRT和PROCLASS)来识别域。

引物：如本文所使用的，术语“引物”是指能够与核酸样品中的互补序列杂交的短的单链寡核苷酸。通常，引物作为模板依赖性DNA合成的起始点。脱氧核糖核苷酸可以通过DNA聚合酶添加至引物。在一些实施方案中，将这类脱氧核糖核苷酸添加至引物也称为引物延伸。如本文所使用的，术语引物包括可以合成的所有形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。用于PCR反应的“引物对”或“引物组”通常是指通常包括“正向引物”和“反向引物”的引物组。如本文所使用的，“正向引物”是指与dsDNA的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链退火。

多态性：如本文所使用的，术语“多态性”是指一种以上形式的基因或其部分并存。

部分和片段：如本文所使用的，术语“部分”和“片段”可互换使用，是指多肽、核酸或其他分子构建体的部分。

有义链与反义链：如本文所使用的，术语“有义链”是指双链DNA(dsDNA)的链，其包括功能性蛋白质的编码序列的至少一部分。如本文所使用的，术语“反义链”是指dsDNA的链，其是有义链的反向互补序列。

显著性差异：如本文所使用的，术语“显著性差异”完全在本领域技术人员的知识范围内，并且将参照每种特定的生物标记物凭经验确定。例如，与健康受试者相比，在具有目标疾病或综合症的受试者中生物标志物表达的显著性差异是蛋白质量的任何统计学上显著的差异。

类似物或同源物：如本文所使用的，术语“类似物”或“同源物”在指氨基酸或核苷酸序列时意思是与野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性的多肽。同源性比较可以用肉眼进行，或更常见的是，借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购获得的计算机程序能够计算两个或更多个序列之间的同源性百分比(例如Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730)。例如，同源序列可以被认为包括氨基酸序列，其在可选择的实施方案中为彼此至少70％相同、75％相同、80％相同、85％相同、90％相同、95％相同、97％相同或98％相同。

特异性：如本文所使用的，术语“特异性”当与寡核苷酸引物结合使用时，是指寡核苷酸或引物在适当的杂交或洗涤条件下，能够与感兴趣的靶标杂交并且与不感兴趣的靶标基本上不杂交。优选较高水平的序列同一性，并且包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，当寡核苷酸和核酸比对时，特异性寡核苷酸或引物与待杂交或扩增的核酸的一部分包含至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更多个具有序列同一性的碱基。

如本领域中已知的，核酸序列彼此杂交的条件能够描述为从低到高的严格性。通常，高度严格的杂交条件是指在高温下在低盐缓冲液中洗涤杂交体。杂交可以使用本领域标准的杂交溶液(例如0.5MNaHPO₄、7％十二烷基硫酸钠(SDS))在65℃下过滤结合的DNA，然后在0.25M NaHPO₄、3.5％SDS中洗涤，随后在从室温至68℃的温度范围内在0.1x SSC/0.1％SDS中洗涤，其取决于探针的长度(参见例如Ausubel,F.M.等,Short Protocols inMolecular Biology,第4版,第2章,John Wiley&Sons,N.Y)。例如，高严格度洗涤包括用6xSSC/0.05％焦磷酸钠在37℃下洗涤14个碱基的寡核苷酸探针、或在48℃洗涤17个碱基的寡核苷酸探针、或在55℃洗涤20个碱基的寡核苷酸探针、或在60℃洗涤25个碱基的寡核苷酸探针或在65℃洗涤长约250个核苷酸的核苷酸探针。核酸探针可以用具有诸如[γ-³²P]ATP的末端标记，或者掺入放射性标记的核苷酸(例如[α-³²P]dCTP)的放射性核苷酸而通过随机引物标记来进行标记。可替代的，可以通过掺入生物素化的或荧光素标记的核苷酸来标记探针，并使用链霉亲和素或抗荧光素抗体来检测探针。

siRNA：如本文所使用的，siRNA(小抑制性RNA)本质上是由大约20个互补核苷酸组成的双链RNA分子。siRNA是由较大的双链(ds)RNA分子裂解产生的。siRNA能够通过siRNA与mRNA的相互作用将其对应的mRNA固有地分为两部分来抑制基因表达，从而导致mRNA降解。siRNA也能够与DNA相互作用，以促进染色质沉默和异染色质的扩增。

受试者：如本文所使用的，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物。受试者可以为患者，其是指为诊断或治疗疾病向医疗提供者提出的人。人类包括产前和产后形式。同样的，如本文所使用的，术语“个体”、“受试者”或“患者”包括所有温血动物。在一个实施方案中，受试者为人。在一个实施方案中，个体为患有NCGS或患有NCGS的风险增加的受试者。

基本上：如本文所使用的，术语“基本上”是指展现出所关注的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)去完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在的完整性缺失。

基本上互补：如本文所使用的，术语“基本上互补”是指可以在严格杂交条件下杂交的两条序列。本领域技术人员将理解，基本上互补的序列不需要沿其整个长度杂交。在一些实施方案中，“严格杂交条件”是指至少与下列条件一样严格的杂交条件：在50％甲酰胺、5XSSC、50mM NaH₂PO₄、pH 6.8、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼***DNA以及5XDenhart’s溶液中在42℃下过夜杂交；在45℃下用2XSSC、0.1％SDS洗涤；并在45℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤。在一些实施方案中，严格杂交条件不应允许两条核酸的杂交，所述两条核酸在一段20个连续核苷酸之间的差异超过两个碱基。

置换：如本文所使用的，术语“置换”是指与天然分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸置换。

患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断出或表现出所述疾病、病症和/或状况的一种或多种症状。

易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断出患有疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体可能不表现出疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不会发展疾病、病症和/或病状。

固体支持物：术语“固体支持物”或“支持物”是指提供可结合生物分子的底物的结构。例如，固体支持物可以为测定孔(即，例如微量滴定板)，或者固体支持物可以为阵列上的位置或者可以为移动性支持物(例如珠子)。

上游和下游：如本文所使用的，术语“上游”是指在分子为蛋白质的第二残基的N端，或在分子为核酸的第二残基的5′的残基。同样如本文所使用的，术语“下游”是指在分子为蛋白质的第二残基的C端或在分子为核酸的第二残基的3′的残基。本文公开的蛋白质、多肽和肽序列均从N端氨基酸至C端氨基酸列出，本文公开的核酸序列均从分子的5'端至分子的3'端列出。

概述

本公开内容提供了在目标疾病和/或综合征基因中鉴定的新型突变，其可用于更准确地诊断与基因相关的疾病和/或综合征。

在一些实施方案中，样品包含核酸。在一些实施方案中，测试步骤包括核酸测序。在一些实施方案中，测试步骤包括杂交。在一些实施方案中，使用对目标生物标志物中的区域具有特异性的一种或多种寡核苷酸探针进行杂交。在一些实施方案中，为了检测突变，在足够严格以不允许单个核苷酸错配的条件下进行杂交。在一些实施方案中，用微阵列进行杂交。在一些实施方案中，测试步骤包括限制酶消化。在一些实施方案中，测试步骤包括PCR扩增。在一些实施方案中，PCR扩增为数字PCR扩增。在一些实施方案中，测试步骤包括引物延伸。在一些实施方案中，引物延伸为单碱基引物延伸。在一些实施方案中，测试步骤包括进行多重等位基因特异性引物延伸(ASPE)。

在一些实施方案中，样品包含蛋白质。在一些实施方案中，测试步骤包括氨基酸测序。在一些实施方案中，测试步骤包括使用一种或多种特异性识别目标生物标志物的抗体进行免疫测定。在一些实施方案中，测试步骤包括蛋白酶消化(例如胰蛋白酶消化)。在一些实施方案中，测试步骤还包括进行2D凝胶电泳。

在一些实施方案中，测试步骤包括使用质谱法确定一种或多种生物标志物的存在。在一些实施方案中，质谱格式选自基质辅助激光解吸/电离、飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾(ES)、IR-MALDI、离子回旋共振(ICR)、傅立叶变换及其组合。

在一些实施方案中，样品从细胞、组织、全血、漱口水、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、脐带血、绒毛膜绒毛样品、绒毛膜绒毛样品培养物、羊水、羊水培养物、经宫颈灌洗液或其组合中获得。在进一步的实施方案中，样品从孕妇的血液或血液制品(例如血浆或血清)和/或胎儿DNA中获得。

在一些实施方案中，测试步骤包括确定生物标志物中预先确定的位置的核苷酸和/或氨基酸的身份。在一些实施方案中，通过将预先确定的位置的核苷酸和/或氨基酸的身份与对照进行比较来确定突变的存在。

在实施方案中，方法可以包括在多个个体中进行测定(例如测序)以确定该关联的统计显著性。

在另一方面，本公开内容提供了用于检测目标生物标志物的试剂，例如但不限于与生物标志物(例如DNA序列中的突变)特异性结合的核酸探针，或包括一个或多个特异性结合生物标志物的探针的阵列。在一些实施方案中，本公开内容提供了与生物标志物特异性结合的抗体。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于包括一种或多种所述试剂的试剂盒。在一些实施方案中，一种或多种试剂以微阵列的形式提供。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括用于引物延伸的试剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括指示健康个体的对照。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于如何基于目标生物标志物确定个体是否患有目标综合征或疾病的说明书。

在某些情况下，在某些实施方案中，可以通过以下方法检测一种或多种生物标志物的量：(a)检测由所述一种或多种生物标志物调节的多肽或蛋白质的量；(b)检测调节所述生物标志物的多肽或蛋白质的量；或(c)检测生物标志物代谢物的量。

在另一方面，本公开内容提供了计算机可读介质，其对与生物标志物的检测相对应的信息进行编码。

诊断NCGS的方法和组合物

本公开内容的实施方案包括用于诊断非乳糜泻谷蛋白敏感性(NCGS)的存在或发展为NCGS的风险增加的组合物和方法。本公开内容的方法和组合物可以用于从受试者获得或提供遗传信息，以便客观地诊断所述受试者或其他受试者NCGS的存在或发展为NCGS的风险增加。所述方法和组合物可以以多种方式实施。

在一个实施方案中，公开了一种在个体中检测与非乳糜泻谷蛋白敏感性(NCGS)相关的生物标志物的方法，其包括以下步骤：从个体获得样品；并测量样品中IL-8、IL-10、TNF-α或总IgE蛋白中至少一种的量。在一些情况下，所述测量可进一步包括测量IP-10、CD4或CD45中一种的表达。另外和/或可替代地，所述方法可以包括测量至少一种归一化(例如管家)基因。在一个非限制性实施方案中，管家基因可以为3-磷酸甘油醛脱氢酶。或者，可以使用其他管家基因。另外和/或可替代地，可以测量其他生物标志物。

如本文所公开的，可以使用多种方法来测量目标生物标志物。在一个实施方案中，测量包括测量肽或多肽生物标志物。例如，在一个实施方案中，测量包括免疫测定。或者，所述测量可以包括流式细胞术。或者，如本文详细讨论的，可以使用核酸方法。

可以使用多种样品类型。在某些实施方案中，样品包括血液、血清、血浆或组织活检。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种识别个体中与NCGS相关的标志物的方法。所述方法可以包括以下步骤：识别至少一种与对照个体或人群相比在NCGS中表达增加或降低但在乳糜泻中表达没有增加或降低的标志物。

在其他实施方案中，本公开内容提供了一种在个体中检测非乳糜泻谷蛋白敏感性(NCGS)的存在或易感性的方法。所述方法可以包括以下步骤：从个体获得样品；测量样品中IL-8、IL-10、TNF-α或总IgE蛋白中至少一种的量；并将样品中IL-8、IL-10、TNF-α或总IgE中至少一种的表达与IL-8、IL-10、TNF-α或总IgE各自的对照值进行比较。在一些情况下，所述测量可以进一步包括测量IP-10、CD4或CD45中至少一种的表达并将这些标志物的水平与对照值进行比较。在一个实施方案中，对照值来自健康个体或没有检测到或没有可检测到的胃肠道病理的个体。在一些实施方案中，对照为疾病对照。这种疾病对照可以包括患有乳糜泻(通过个体是否接受无谷蛋白饮食来分层)的个体和患有其他胃肠道疾病(例如炎症性肠病(IBD)、肝炎、小肠细菌过度生长)和其他疾病的受试者。

另外和/或可替代地，所述方法可以包括测量至少一种归一化(例如管家)基因。在一个非限制性实施方案中，管家基因可以为3-磷酸甘油醛脱氢酶。或者，可以使用其他管家基因。另外和/或可替代地，可以测量其他生物标志物。

如本文所公开的，可以使用多种方法来测量目标生物标志物。在一个实施方案中，测量包括测量肽或多肽生物标志物。例如，在一个实施方案中，测量包括免疫测定。或者，所述测量可以包括流式细胞术。或者，如本文详细讨论的，可以使用核酸方法。

可以使用多种样品类型。在某些实施方案中，样品包括血液、血清、血浆或组织活检。

其他实施方案包括在个体中检测与非乳糜泻谷蛋白敏感性(NCGS)有关的生物标志物的组合物。在某些实施方案中，组合物包括定量生物样品中IL-8、IL-10、TNF-α或总IgE蛋白中至少一种的水平的试剂。在某些情况下，所述组合物可以进一步包括用于测量IP-10、CD4或CD45中至少一种的表达的试剂。

例如，如本文中详细描述的，所述组合物可以包括用于测量肽或多肽生物标志物的试剂。在一个实施方案中，组合物包括进行免疫测定的试剂。或者，组合物可以包括进行流式细胞术的试剂。或者，如本文中详细讨论的，所述组合物可以包括用于确定核酸的特定序列的存在和/或核酸的表达水平的试剂。

其他实施方案包括至少含有本文公开的组合物和/或用于执行本文公开的方法的试剂中的一些的试剂盒。这种试剂盒可以包括来自健康个体或没有检测到或没有可检测到的胃肠道病理的个体的对照生物样品。在一些实施方案中，对照为疾病对照。这种疾病对照可以包括患有乳糜泻(通过个体是否接受无谷蛋白饮食来分层)的个体和患有其他胃肠道疾病(例如炎症性肠病(IBD)、肝炎、小肠细菌过度生长)和其他疾病的受试者。这种试剂盒可以包括说明书和/或计算机可读介质，其包括用于执行方法的说明书和/或其他信息。这种试剂盒可以包括如本文所描述的对照值。

其他实施方案包括计算机可读介质，其包括独立于其中的试剂盒或试剂的用于执行方法的说明书和/或其他信息。

肽、多肽和蛋白质测定

在某些实施方案中，在蛋白质(或肽或多肽)水平检测目标生物标志物，即分析基因产物。例如，可以通过氨基酸测序方法或使用一种或多种特异性识别目标生物标志物上存在的一种或多种表位或在某些情况下对目标突变具有特异性的抗体的免疫测定法对蛋白质或其片段进行分析。还可以通过蛋白酶消化(例如胰蛋白酶消化)来分析蛋白质，并且在一些实施方案中，可以通过2D凝胶电泳来进一步分析所消化的蛋白质产物。

抗体检测

结合目标生物标志物的特异性抗体可用于本领域已知的多种方法中的任何一种。可以使用本领域已知的多种方法中的任何一种来产生针对特定表位、多肽和/或蛋白质的抗体。例如，可以产生所需抗体针对的表位、多肽或蛋白质，并将其注射至动物，通常为哺乳动物(例如驴、小鼠、兔、马、鸡等)，并且由动物产生的抗体可以从动物收集。单克隆抗体也可以通过生成与永生细胞系表达目标抗体的杂交瘤来产生。

在一些实施方案中，抗体用本文所描述的可检测部分标记。

抗体检测方法是本领域众所周知的，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISAs)和蛋白质印迹。一些这样的方法适合于以阵列格式执行。

例如，在一些实施方案中，使用特异性识别生物标志物的第一抗体(或抗体片段)来检测目标生物标志物。抗体可以用可检测部分(例如化学发光分子)、酶或第二结合剂(例如链霉亲和素)来标记。或者，如本领域中已知的，可以使用第二抗体来检测第一抗体。

在某些实施方案中，方法可以进一步包括加入捕获支持物，所述捕获支持物包括至少一种识别并结合至生物标志物以将生物标志物固定在捕获支持物上的捕获支持物结合剂。在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括加入第二结合剂，其可以特异性地识别并结合至捕获支持物上的多个结合剂分子中的至少一些。在一个实施方案中，可以特异性识别并结合在捕获支持物上的多个结合剂分子中的至少一些的结合剂为可溶性结合剂(例如二抗)。第二结合剂可以被标记(例如用酶)，从而通过添加酶的底物并定量形成的产物的量来测量目标生物标志物的结合。

在一个实施方案中，捕获固体支持物可以为测定孔(即，例如微量滴定板)。或者，捕获固体支持物可以为阵列上的位置，也可以为可移动的支持物，例如珠子。或者捕获支持可以为过滤器。

在某些情况下，可以允许生物标志物与第一结合剂(例如对生物标记物具有特异性并用可检测部分标记的第一抗体)和第二结合剂(例如识别第一抗体或第二抗体的第二抗体)复合，其中第二结合剂与第三结合剂(例如生物素)复合，第三结合剂然后可以与具有识别第三结合剂的试剂(例如链霉亲和素)的捕获支持物(例如磁珠)相互作用链接至捕获支持物。然后可以使用磁体(例如磁性探针)捕获复合物(标记的第一抗体：生物标志物：第二第一抗体-生物素：链霉亲和素-珠子)以测量复合物的量。

在本公开内容的方法中可以使用多种结合剂。例如，附着于捕获支持物的结合剂或第二抗体可以为识别生物标志物的抗体或抗体片段。或者，结合剂可包括结合非蛋白质靶标的蛋白质(即，诸如特异性结合小分子生物标志物的蛋白质或结合蛋白质的受体)。

在某些实施方案中，固体支持物可以用钝化剂处理。例如，在某些实施方案中，目标生物标志物可以被捕获在经钝化的表面(即已经被处理以减少非特异性结合的表面)上。这类钝化剂中的一种为BSA。另外和/或可替代地，在使用的结合剂为抗体的情况下，固体支持物可以用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或与结合剂(例如抗体)高亲和力结合的另一种试剂包被。这些蛋白质结合抗体的Fc域，因此能够定向识别蛋白质或目标蛋白质的抗体的结合。

核酸测定

在某些实施方案中，本文公开的生物标志物在核酸水平检测。在一个实施方案中，本公开内容包括用于诊断受试者中是否存在或发展为目标综合征或疾病(例如NCGS)的风险增加的方法。所述方法可以包括以下步骤：从受试者的组织或体液样品中获得核酸，并进行测定以鉴定受试者的核酸中是否存在变体序列(即突变)。在某些实施方案中，所述方法可以包括将变体和与目标综合征或疾病相关的已知变体进行比较，并确定所述变体是否为先前已被识别为与目标综合征或疾病相关的变体。或者，所述方法可以包括将变体识别为新的、先前未表征的变体。如果变体为新的变体，则所述方法可以进一步包括进行分析以确定突变是否预期对基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能有害。所述方法可以进一步包括使用变体概况(即在受试者中鉴定的突变的汇编)来诊断目标综合征或疾病的存在或发展为目标综合征或疾病的风险增加。

可以对基因组DNA、信使RNA和/或cDNA进行核酸分析。另外，在各种实施方案中，核酸包含基因、RNA、外显子、内含子、基因调节元件、表达的RNA、siRNA或表观遗传元件。另外，可以评估包括剪接位点、转录因子结合、A-I编辑位点、microRNA结合位点和功能性RNA结构位点的调控元件的突变(即变体)。因此，对于本公开内容的每种方法和组合物，所述变体可以包括包含以下核酸序列中的至少一种：(1)A至I编辑位点；(2)剪接位点；(3)保守的功能性RNA结构；(4)经验证的转录因子结合位点(TFBS)；(5)microRNA(miRNA)结合位点；(6)聚腺苷酸化位点；(7)已知的调控元件；(8)miRNA基因；(9)在ROIs中编码的小核仁RNA基因；和/或(10)在胎盘哺乳动物内的超保守元件。

在许多实施方案中，核酸是从生物样品中提取的。在一些实施方案中，核酸是无细胞DNA。在一些实施方案中，在未被扩增的情况下分析核酸。在一些实施方案中，使用本领域已知的技术(例如聚合酶链反应(PCR))扩增核酸，并在随后的分析中使用经扩增的核酸。可以使用多重PCR，其中采用多组引物对一次扩增几个扩增子(例如来自不同基因组区域)。例如，可以通过测序、杂交、PCR扩增、限制酶消化、引物延伸(例如单碱基引物延伸或多重等位基因特异性引物延伸(ASPE))或DNA测序来分析核酸。在一些实施方案中，以使得野生型等位基因的扩增产物大小不同于突变等位基因的方式扩增核酸。因此，可以通过检测扩增产物的大小差异来确定是否存在特定突变等位基因(例如在电泳凝胶上)。例如，基因区域的缺失或***可能特别适合于使用基于大小的方法。

在下面详细描述某些示例性核酸分析方法。

等位基因特异性扩增

在一些实施方案中，例如，在用于目标疾病和/或综合征的生物标志物为突变的情况下，使用等位基因特异性扩增测定法检测生物标志物。所述方法被不同地称为特异性等位基因的PCR扩增(PASA)(Sarkar,等,1990Anal.Biochem.186:64-68)、等位基因特异性扩增(ASA)(Okayama,等,1989J.Lab.Clin.Med.114:105-113)、等位基因特异性PCR(ASPCR)(Wu,等.1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:2757-2760)以及扩增阻碍突变系统(ARMS)(Newton,等,1989Nucleic Acids Res.17:2503-2516)。这些参考文献中的每一个的全部内容都并入本文。所述方法适用于单碱基置换以及微缺失/***。

例如，对于基于PCR的扩增方法，可以设计扩增引物使得它们可以区分不同的等位基因(例如在野生型等位基因和突变等位基因之间)。因此，扩增产物的存在或不存在可用于确定给定核酸样品中是否存在基因突变。在一些实施方案中，可以设计等位基因特异性引物，使得扩增产物的存在指示基因突变。在一些实施方案中，可以设计等位基因特异性引物，使得扩增产物的不存在指示基因突变。

在一些实施方案中，使用两个互补反应。一个反应采用对野生型等位基因具有特异性的引物(“野生型特异性反应”)，另一反应使用对突变等位基因具有特异性的引物(“突变特异性反应”)。这两个反应可以采用共同的第二引物。对特定等位基因(例如野生型等位基因或突变等位基因)具有特异性的PCR引物通常完全匹配靶标的一个等位基因变体，但是与其他等位基因变体(例如突变等位基因或野生型等位基因)错配。错配可能位于/靠近引物的3'末端，导致完美匹配的等位基因的优先扩增。是否可以从一个或两个反应中检测到扩增产物，指示突变等位基因存在或不存在。仅从野生型特异性反应中检测到扩增产物指示仅存在野生型等位基因(例如野生型等位基因的纯合性)。仅在突变特异性反应中检测到扩增产物指示仅存在突变体等位基因(例如突变体等位基因的纯合性)。来自两个反应的扩增产物的检测指示(例如杂合子)。如本文所使用的，所述方法将被称为“等位基因特异性扩增(ASA)”。

通过使用部分穿过连接处进行杂交的引物，等位基因特异性扩增也可用于检测重复、***或倒位。能改变连接重叠的程度以允许特异性扩增。

扩增产物可以通过本领域已知的方法来检查，包括通过可视化(例如用一种或多种染料)已通过凝胶迁移(例如通过电泳)按大小分离的核酸的核酸带。

等位基因特异性引物延伸

在一些实施方案中，等位基因特异性引物延伸(ASPE)方法用于检测基因突变。ASPE采用等位基因特异性引物能在延伸反应中区分等位基因(例如突变等位基因和野生型等位基因之间)，从而仅在特定等位基因(例如突变等位基因或野生型等位基因)存在时获得延伸产物。延伸产物可以为可检测的或使得可检测的，例如通过在延伸反应中采用经标记的脱氧核苷酸。多种标记中的任何一种均可用于这些方法，包括但不限于放射性标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记等。在一些实施方案中，用实体标记核苷酸，所述实体随后可以被可检测的标记(例如可以被链霉亲和素缀合荧光染料结合的生物素分子)结合(直接或间接)。在一些实施方案中，反应以多重方式进行，例如在同一延伸反应中使用许多等位基因特异性引物。

在一些实施方案中，延伸产物杂交至固体或半固体支持物(例如珠子、基质、凝胶等)。例如，延伸产物可以用特定核酸序列标记(例如作为等位基因特异性引物的一部分包括在内)，并且固体支持物可以附着至“抗标签”(例如与延伸产物中的标签互补的核酸序列)。延伸产物可以在固体支持物上捕获和检测。例如，珠子可以被分类和检测。能以这种方式采用的这类系统中的一种为LUM1NEX^TM MAP系统，其可适用于通过TM Bioscience进行的囊性纤维化突变检测，并作为通用珠阵列(TAG-IT^TM)商业销售。

单核苷酸引物延伸

在一些实施方案中，使用单核苷酸引物延伸(SNuPE)测定，其中将引物设计为仅延伸一个核苷酸。在这种方法中，引物3'末端下游核苷酸的身份是已知的，与野生型等位基因相比，突变等位基因有所不同。SNuPE可以使用其中只有一种特定类型的脱氧核苷酸被标记的延伸反应来进行(例如经标记的dATP、经标记的dCTP、经标记的dGTP或经标记的dTTP)。因此，可检测到的延伸产物的存在可以用作在目标位置(例如在引物的3'末端下游的位置)处核苷酸的身份的指示，并因此作为在该位置突变存在或不存在的指示。SNuPE可以如U.S.Pat.No.5888819；U.S.Pat.No.5846710；U.S.Pat.No.6280947；U.S.Pat.No.6482595；U.S.Pat.No.6503718；U.S.Pat.No.6919174；Piggee,C.等.Journal of Chromatography A781(1997),p.367-375(“Capillary Electrophoresis for the Detection of KnownPoint Mutations by Single-Nucleotide Primer Extension and Laser-InducedFluorescence Detection”)；Hoogendoom,B.等,Human Genetics(1999)104:89-93,(“Genotyping Single Nucleotide Polymorphism by Primer Extension and HighPerformance Liquid Chromatography”)中所描述的进行，其中每一个的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，引物延伸可以与质谱法结合以准确和快速的检测突变的存在或不存在。参见U.S.Pat.No.5885775至Haff等.(analysis of single nucleotidepolymorphism analysis by mass spectrometry)；U.S.Pat.No.7501251至Koster(DNAdiagnosis based on mass spectrometry)；两者的教导均通过引用并入本文。合适的质谱格式包括但不限于基质辅助激光解吸/电离、飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾(ES)、IR-MALDI、离子回旋共振(ICR)、傅里叶变换及其组合。

寡核苷酸连接测定

在一些实施方案中，使用寡核苷酸连接测定法(“OLA”或“OL”)。OLA采用两个寡核苷酸，其设计成能够与靶分子单链的邻接序列杂交。通常，其中一个寡核苷酸被生物素化，而另一个寡核苷酸被可检测地标记(例如用链霉亲和素缀合的荧光部分)。如果在靶分子中找到精确的互补序列，则寡核苷酸将杂交使其末端邻接，并产生可被捕获和检测的连接底物。参见，例如，Nickerson等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8923-8927,Landegren,U.等.(1988)Science241:1077-1080和U.S.Pat.No.4998617，其全部内容通过引用整体并入本文。

杂交方法

在一些实施方案中，通过杂交分析核酸，其使用一种或多种对目标生物标志物具有特异性的寡核苷酸探针，并在足够严格的条件下不允许单核苷酸错配。在某些实施方案中，合适的核酸探针可以区分正常基因和突变基因。因此，例如，本领域普通技术人员可以使用本发明的探针来确定个体对于特定等位基因是纯合的还是杂合的。

核酸杂交技术是本领域众所周知的。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所需水平的互补性序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的示例，参见，例如，Sambrook,等,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等.1994,Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。

在一些实施方案中，与突变或野生型序列杂交的探针分子可用于通过溶液相或更优选地固相杂交检测在扩增产物中的这类序列。固相杂交可以诸如通过将探针连接至微芯片来实现。

核酸探针可以包括核糖核酸和/或脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，提供的核酸探针为寡核苷酸(即“寡核苷酸探针”)。通常，寡核苷酸探针足够的长以与目标基因的同源区域特异性结合，但是足够的短以至于探针和被测试的核酸样品之间一个核苷酸的差异即破坏杂交。通常，寡核苷酸探针的大小在大约10至100个核苷酸之间变化。在一些实施方案中，寡核苷酸探针的长度在15至90、15至80、15至70、15至60、15至50、15至40、15至35、15至30、18至30或18至26个核苷酸之间变化。如本领域普通技术人员所理解的，寡核苷酸探针的最佳长度可以取决于能采用的寡核苷酸探针的特定方法和/或条件。

在一些实施方案中，核酸探针可用作引物(例如用于核酸扩增和/或延伸反应)。例如，在某些实施方案中，评估变体的基因序列包括外显子序列。在某些实施方案中，在测定中分析外显子序列和另外的侧翼序列(例如UTR和/或内含子序列的大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或更多个核苷酸)。或者，可以评估内含子序列或其他非编码区的潜在有害突变。或者，可以使用这些序列的一部分。这类变体基因序列可包括具有至少一种如本文所述的突变的序列。

本公开内容的其他实施方案提供了经分离的基因序列，其包含与目标综合征和/或疾病有关的突变。这样的基因序列可以用于客观地诊断受试者NCGS的存在或发展为NCGS的风险增加。在某些实施方案中，经分离的核酸可以包括任何一种非变体序列或变体序列或其组合。例如，在某些实施方案中，基因序列包括外显子序列。在某些实施方案中，在测定中分析外显子序列和另外的侧翼序列(例如UTR和/或内含子序列的大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或更多个核苷酸)。或者，可以使用内含子序列或其他非编码区。或者，可以使用这些序列的一部分。在某些实施方案中，基因序列包括来自本公开内容的至少一种生物标志物基因的外显子序列。

在一些实施方案中，核酸探针用本文所描述的可检测部分标记。

阵列

本文提及的多种方法可适于与允许在单个实验中分析和/或检测生物标志物组的阵列一起使用。例如，可以同时分析包括生物标志物的多个突变。特别地，涉及使用核酸试剂(例如探针、引物、寡核苷酸等)的方法对适应于基于阵列的平台(例如微阵列)特别适合。在一些实施方案中，阵列包含一种或多种特异性用于检测在目标生物标志物中的突变的探针。

DNA测序

在某些实施方案中，通过核酸测序检测在核酸或一组核酸的序列、基因组位置或排列和/或基因组拷贝数中的变异来进行目标生物标志物的诊断。

在一些实施方案中，方法可以包括从受试者的组织或体液样品中获得核酸，并对至少一部分核酸进行测序，以获得至少一个基因的样品核酸序列。在某些实施方案中，方法可以包括将变体和与NCGS相关的已知变体进行比较，并确定所述变体是否为先前已被识别为与NCGS相关的变体。或者，所述方法可以包括将所述变体识别为新的、先前未表征的变体。如果变体为新的变体，或者在某些情况下是先前已表征的(即已鉴定的)变体，则所述方法可以进一步包括进行分析以确定突变是否预期对基因和/或由基因编码的蛋白质的功能有害。所述方法可以进一步包括使用变体概况(即在受试者中鉴定的变体的汇编)来诊断NCGS的存在或发展为NCGS的风险增加。

例如，在某些实施方案中，可以使用下一代(大规模平行测序)。或者，可以使用Sanger测序。或者，可以结合使用下一代(大规模平行测序)和Sanger测序。另外和/或可替代地，测序包括通过单分子边合成边测序中的至少一种。因此，在某些实施方案中，在库中分析多个DNA样品以鉴定显示出变异的样品。另外地或可替代地，在某些实施方案中，在多个库中分析多个DNA样品，以鉴定在至少两个库中显示相同变异的单个样品。

一种进行测序的常规方法是通过链终止和凝胶分离，如Sanger等,1977,ProcNatl Acad Sci U S A,74:5463-67所描述的。另一种常规测序方法涉及核酸片段的化学降解。参见Maxam等,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.,74:560-564。另外，已经基于杂交测序开发了方法。参见，例如Harris等,美国专利申请公开No.20090156412。这些参考文献中的每一个通过引用整体并入本文。

在其他实施方案中，核酸的测序通过单分子或衍生自通过诸如PCR的方法扩增的单分子的大体上相同的分子组的大规模平行测序(也称为“下一代测序”)来完成。大规模平行测序在例如Lapidus等,美国专利号7169560,Quake等.美国专利号6818395,Harris美国专利号7282337和Braslavsky,等,PNAS(USA),100:3960-3964(2003)中示出，其中每一个的内容通过引用并入本文。

在下一代测序中，可以对核酸进行PCR或全基因组扩增，以获得足够量的核酸用于分析。在下一代测序中的某些形式，不需要扩增，因为该方法能够从未扩增的DNA评估DNA序列。一旦确定，就将来自测试样品的核酸的序列和/或基因组排列和/或基因组拷贝数与从一个或多个在其样品被采集时未知患有NCGS的个体来源的标准参考进行比较。来自测试样品和标准参考的核酸的序列和/或基因组排列和/或基因组排列和/或拷贝数之间的所有差异均视为变体。

在下一代(大规模平行测序)中，所有目标区域都被一起测序，并且通过与参考序列进行比较(比对)来确定每个读取序列的来源。目标区域可以在一个反应中一起富集，或者可以分开富集，然后在测序前合并。在某些实施方案中，并且如本文实施例中更详细地描述，通过随机片段化的基因组DNA与特异性RNA探针的大量杂交来富集来源于测定中所包括的基因的编码外显子的DNA序列。相同的衔接子序列连接到所有片段的末端，从而允许通过PCR在一个反应中用一对引物富集所有杂交捕获的片段。用特异性引物通过PCR扩增经由杂交捕获的效率较低的区域。另外，具有特异性引物的PCR可用于扩增基因组中其他地方存在相似序列(“伪外显子”)的外显子。

在使用大规模平行测序的某些实施方案中，将PCR产物连接以形成长的DNA片段，将其剪切成短片段(例如通过声能)。这个步骤确保片段末端分布在整个目标区域中。随后，将一段dA核苷酸加入每个片段的3'末端，这允许所述片段结合至覆盖有oligo(dT)引物的平面(“流通池”)。然后可以通过用荧光标记的核苷酸延伸oligo(dT)引物来对每个片段进行测序。在每个测序循环中，仅加入一种类型的核苷酸(A、G、T或C)，并且仅允许通过链终止核苷酸的使用掺入一种核苷酸。例如，在第一个测序循环中，可以加入荧光标记的dCTP。这个核苷酸将仅掺入需要C作为下一个核苷酸的那些正在生长的互补DNA链中。在每个测序循环后，对流通池进行拍摄以确定哪个片段已延伸。掺入C的DNA链会发光，而未掺入C的DNA链会显得黯淡。链终止反向以使生长的DNA链再次可延伸，并且这个过程共重复120个循环。

图像被转换为碱基串，通常称为“读取”，其概括每个片段的3'端的25-60个碱基。然后将读数与所分析DNA的参考序列进行比较。由于任何给定的25个碱基串通常在人类基因组中仅出现一次，因此大多数读取可与人类基因组中的一个特定位置“对齐”。最后，可以从可获得的读数中建立每个基因组区域的共有序列，并将其与该位置上参考的确切序列进行比较。共有序列和参考之间的任何差异称为序列变体。

可检测部分

在某些实施方案中，根据本发明和/或由本发明提供的某些分子(例如核酸探针、抗体等)包括一个或多个可检测实体或部分，即这类分子被这类实体或部分“标记”。

在本公开内容的实践中可以使用多种可检测试剂中的任何一种。合适的可检测试剂包括但不限于：各种配体、放射性核素；荧光染料；化学发光剂(诸如，例如吖啶酯，稳定的二氧杂环丁烷等)；生物发光剂；光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即量子点)；微粒；金属纳米颗粒(例如金、银、铜、铂等)；纳米团簇；顺磁性金属离子；酶；比色标签(诸如，例如染料、胶体金等)；生物素；地高辛；半抗原；以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质。

在一些实施方案中，可检测部分为生物素。生物素可与亲和素(例如链霉亲和素)结合，亲和素通常缀合(直接或间接)至自身可检测的其他部分(例如荧光部分)。

下面描述了可以使用的一些可检测部分的一些非限制性实施例。

荧光染料

在某些实施方案中，可检测部分为荧光染料。具有各种化学结构和物理特性的多种已知荧光染料适用于本公开内容的实践。荧光可检测部分能被激光激发，而发射光通过检测器捕获。所述检测器可以为电荷耦合器件(CCD)或共聚焦显微镜，可以记录其强度。

合适的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如异硫氰酸荧光素或FITC、萘基荧光素、4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧喏染料、藻红蛋白、赤藓红、曙红、罗丹明染料(例如羧基四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、Q-DOTS、俄勒冈绿色染料(例如俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUM REDTM、SPECTRUM GREENTM、花青染料(例如CY-3TM、CY-5TM、CY-3.5TM、CY-5.5TM等)，ALEXAFLUORTM染料(例如ALEXA FLUORTM 350、ALEXA FLUORTM 488、ALEXA FLUORTM 532、ALEXAFLUORTM 546、ALEXA FLUORTM 568、ALEXA FLUORTM 594、ALEXA FLUORTM 633、ALEXAFLUORTM 660、ALEXA FLUORTM 680等)、BODIPYTM染料(例如BODIPYTM FL、BODIPYTM R6G、BODIPYTM TMR、BODIPYTM TR、BODIPYTM 530/550、BODIPYTM 558/568、BODIPYTM 564/570、BODIPYTM 576/589、BODIPYTM 581/591、BODIPYTM 630/650、BODIPYTM 650/665等)、IRDyes(例如IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。有关合适的荧光染料和将荧光染料偶联至其他化学实体(例如蛋白质和肽)的方法的更多示例，参见，例如“The Handbook of FluorescentProbes and Research Products”,第9版,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记剂的有利性质包括高摩尔吸收系数、高荧光量子产率以及光稳定性。在一些实施方案中，标记荧光团在可见光(即在400和750nm之间)而不是在光谱的紫外范围(即低于400nm)中显示吸收和发射波长。

可检测部分可以包括一种以上的化学实体，例如在荧光共振能量转移(FRET)中。共振转移导致发射强度的整体增。例如，参见Ju等.(1995)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)92:4347，其全部内容通过引用并入本文。为了实现共振能量转移，第一荧光分子(“供体”荧光)吸收光并通过激发电子的共振将其转移至第二荧光分子(“受体”荧光)。在一种方法中，供体和受体染料都可以结合在一起并连接至寡核苷酸引物上。将供体和受体染料结合至核酸的方法已在例如U.S.Pat.No.5945526至Lee等中描述，其全部内容通过引用并入本文。可以使用的供体/受体对染料包括例如荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL、荧光素/荧光素、BODIPY FL/BODIPY FL和荧光素/QSY 7染料。参见，例如U.S.Pat.No.5945526至Lee等。这些染料中的许多也可以从例如Molecular Probes Inc.(Eugene,Oreg.)商购获得。合适的供体荧光团包括6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2’-氯-7’-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)等。

酶

在某些实施方案中，可检测部分为酶。合适的酶的示例包括但不限于ELISA中使用的那些酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其他示例包括β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶等。可以使用诸如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等的连接基团将酶缀合至分子上。

放射性同位素

在某些实施方案中，可检测部分为放射性同位素。例如，分子可以为同位素标记的(即可以包含一个或多个原子，其已被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子替换)或同位素可以连接在分子上。可掺入分子中的同位素的非限制性示例包括氢、碳、氟、磷、铜、镓、钇、锝、铟、碘、铼、铊、铋、砹、钐和镥的同位素(即3H、13C、14C、18F、19F、32P、35S、64Cu、67Cu、67Ga、90Y、99mTc、111In、125I、123I、129I、131I、135I、186Re、187Re、201T1、212Bi、213Bi、21lAt、153Sm、177Lu)。

在一些实施方案中，使用经标记的树枝状大分子作为可检测部分来实现信号放大(参见，例如Physiol Genomics 3:93-99,2000)，其全部内容通过引用整体并入本文。荧光标记的树枝状大分子可从Genisphere(Montvale,N.J.)获得。这些可以通过本领域已知的方法化学偶联至寡核苷酸引物。

试剂盒

在某些实施方案中，本公开内容提供了根据本文公开的方法和组合物使用的试剂盒。通常，试剂盒包括一种或多种检测目标生物标志物的试剂。合适的试剂可以包括核酸探针和/或抗体或其片段。在一些实施方案中，以阵列(例如微阵列或突变组)的形式提供合适的试剂。

在一些实施方案中，提供的试剂盒进一步包括用于实施本文描述的各种检测方法(例如测序、杂交、引物延伸、多重ASPE、免疫测定等)的试剂。例如，试剂盒可任选地包含用于本文描述的方法(例如用于通过引物指导的扩增来扩增核酸、用于进行ELISA实验等)的缓冲液、酶和/或试剂。

在一些实施方案中，提供的试剂盒进一步包括指示健康个体的对照(例如来自不具有目标疾病和/或综合征的个体的核酸和/或蛋白质样品)。在一个实施方案中，对照来自健康个体或没有检测到或可检测到的胃肠道病理的个体。在一些实施方案中，对照为疾病对照。这样的疾病对照可以包括患有乳糜泻的个体(通过个体是否接受无谷蛋白饮食来分层)和患有其他胃肠道疾病(例如炎症性肠病(IBD)、肝炎、小肠细菌过度生长)和其他疾病的受试者。

试剂盒也可包含有关如何确定个体是否患有目标疾病和/或综合症或有发展为目标疾病和/或综合症的风险的说明。

在一些实施方案中，提供了计算机可读介质，其编码与目标生物标志物相对应的信息。这样的计算机可读介质可以被包括在本发明的试剂盒中。

识别NCGS标志物的方法

数据挖掘

在本公开内容的某些实施方案中，使用数据挖掘方法来识别生物标志物。例如，在某些情况下，可以在公共数据库(例如PubMed)中搜索已显示与某种疾病相关(直接或间接)的基因。然后可以将这类基因评估为生物标志物。在一个实施方案中，这种分析的结果鉴定IP-10、IL-8、IgE、TNF-α、IL-10、CD4和CD45为潜在的目标标志物。图1示出了识别与NCGS相关联的标志物的多节点交互网络的实施例，如在2017年5月12日提交的美国临时专利申请No.62/505536和2017年6月22日提交的美国临时专利申请62/523382中所详细描述的，并且通过引用以其整体并入本文。在图中，带圆圈的标志物包括更相关的疾病标志物。

分子

在某些实施方案中，本公开内容包括鉴定目标综合征或疾病的生物标志物(即以统计学上显著的方式与NCGS相关的核酸序列变体)的方法。用于新的标志物测定的基因和/或基因组区域可以根据基因和/或基因组区域在生化途径中的重要性选择，所述生化途径显示与目标综合征和/或疾病的遗传连锁和/或生物学因果关系。或者，用于标志物测定的基因和/或基因组区域可以根据在家族中与NCGS遗传相关的DNA区域的遗传连锁来选择。或者，可以系统地评估用于标志物测定的基因和/或基因组区域，以覆盖尚未被评估的染色体的某些区域。

在其他实施方案中，用于新的标志物评估的基因或基因组区域可以是与目标综合征和/或疾病(例如NCGS)的发展相关的生化途径的一部分。可以基于以下方法中的一种或多种来评估变体和/或变体组合的临床意义。如果已报道或已知变体或变体组合在患有目标综合征和/或疾病的受试者中比在没有目标综合征和/或疾病的受试者中的核酸中更频繁地发生，则认为至少潜在地易患目标综合征和/或疾病。如果已报道或已知变体或变体组合被排他地或优先地传递给具有目标综合征和/或疾病的个体，则认为至少潜在地易患目标综合征和/或疾病。相反地，如果在两个人群中以相似的频率发现变体，则不太可能与目标综合征和/或疾病的发展相关。

如果在适用于测量蛋白质或生物系统功能的实验模型系统中已报道或已知变体或变体组合对所述蛋白质或所述生物系统的功能具有总体有害影响，并且如果这种变体或变体组合影响已知与目标综合征和/或疾病相关的一个或多个基因，则认为至少潜在地易患目标综合征和/或疾病。例如，如果基于对蛋白质或核酸的序列和/或结构的预测影响而预测变体或变体组合对蛋白质或基因表达具有总体有害影响(即导致无义突变、移码突变或剪接位点突变或甚至错义突变)，并且如果所述变体或变体组合影响已知与目标综合征和/或疾病相关的一个或多个基因，则认为至少潜在地易患目标综合征和/或疾病。

同样，在某些实施方案中，变体的总数可能很重要。如果在测试样品中检测到一个或几个、单独或组合的变体被评估为至少可能与目标综合征和/或疾病有关，那么在其遗传物质中具有这个变体或这些变体的个体可以诊断为患有目标综合征和/或疾病或有很大的风险发展为目标综合征和/或疾病。

例如，本公开内容提供了用于诊断受试者中NCGS的存在或发展为NCGS的风险增加的方法。所述方法可以包括从组织或体液的样品中获得核酸。所述方法可以进一步包括对核酸测序或确定核酸的基因组排列或拷贝数以检测核酸序列或基因组排列或拷贝数中是否存在变体。所述方法可以进一步包括评估一个或多个变体的临床意义的步骤。这类分析可包括在受影响人群(即患有所述疾病的受试者)中评估变体序列的关联程度。这类分析还可包括突变可能对基因表达和/或蛋白质功能的影响程度的分析。所述方法还可以包括基于评估而诊断NCGS的存在或发展为NCGS的风险增加。

以下实施例用于说明本公开内容的某些方面。这些实施例决不是限制性的。

实施例

肿瘤坏死因子α(TNF-α)

肿瘤坏死因子α(TNF-α)，也称为恶病质素和TNFSF1A，是TNF超家族的原型配体。TNF-α在炎症、免疫系统发育、细胞凋亡和脂质代谢中起着核心作用。TNF-α还与多种病理状况有关，包括哮喘、克罗恩病、类风湿性关节炎、神经性疼痛、肥胖、2型糖尿病、败血性休克、自身免疫性和癌症。

TNF-α可以使用Quantikine测定法测量。QuantikineTNF-α免疫测定为4.0小时固相ELISA，旨在测量血清和血浆中的人TNF-α。所述测定包含大肠杆菌(E.coli)衍生的重组人TNF-α和针对重组因子产生的抗体，并采用定量夹心酶免疫测定技术。将对人TNF-α具有特异性的单克隆抗体预包被至微孔板上。将标准品和样品吸取到孔中，并且存在的TNF-α被固定化的抗体结合。洗去任何未结合的物质后，将对人TNF-α具有特异性的生物素化多克隆抗体加入孔中，洗涤孔以去除未结合的抗体-生物素试剂，然后将酶联链霉亲和素加入孔中。洗涤后，将底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺)加入孔中，并且颜色显示与初始步骤中结合的TNF-α的量成比例。停止显色，并在450nm处测量颜色强度，减去540nm和570nm处的读数。

样品可以为血清或血浆。对于血清，使用血清分离管(SST)，并在室温下将样品凝结30分钟，然后以1000x g离心15分钟。取出血清并测定。立即使用样品或将样品等分保存在≤-20℃下。使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。在收集后30分钟内将样品以1000x g的速度离心15分钟，并立即测定样品或将样品等分保存在≤-20℃下。对于血清和血浆样品，均应避免反复冻融循环。通常，不应使用严重溶血的样品、高白蛋白样品和柠檬酸盐血浆。

白介素10(IL-10)

白细胞介素10(IL-10)，最初特指细胞因子合成抑制因子(CSIF)。IL-10为多效细胞因子，其能对多种细胞类型发挥免疫抑制或免疫刺激作用。IL-10是单核细胞/巨噬细胞功能的有效调节剂。作为细胞介导的免疫反应的负调节物，IL-10能够抑制***素E2和由单核细胞激活后产生的许多促炎性细胞因子(包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)的产生。IL-10也增强可溶性TNF受体的释放并抑制表面ICAM-1和B的表达。据报道，IL-10抑制超氧阴离子加活性氧中间体(ROI)的合成，并抑制或促进NO合成，其取决于暴露于活化的巨噬细胞的时间。IL-10对B细胞也有显著影响。例如，其在CD40活化的细胞中诱导IgA合成，并选择分泌IgG1和IgG3。IL-10在内皮细胞(其模拟IL-4)以及在胸腺细胞和肥大细胞(其作为生长共刺激分子)中的活性也有记载。

IL-10可以使用Quantikine测定法进行测量。Quantikine IL-10免疫测定为3.5-4.5小时固相ELISA，旨在测量细胞培养上清、血清和血浆中的IL-10。它包含Sf 21表达的重组人IL-10和针对重组因子的抗体。所述测定采用定量夹心酶免疫测定技术。将对IL-10具有特异性的单克隆抗体预包被至微孔板上。将标准品和样品吸取到孔中，并且任何存在的IL-10都被固定化抗体结合。洗去任何未结合的物质后，将对IL-10具有特异的酶联单克隆抗体加入孔中。洗涤后，将底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺)加入孔中，并且颜色显示与初始步骤中结合的TNF-α的量成比例。停止显色，并在450nm处测量颜色强度，减去540nm和570nm处的读数。

对于细胞培养上清，通过离心去除颗粒。立即分析样品或将样品等分并保存在≤-20℃下。应避免反复冻融循环。对于血清，使用血清分离管(SST)，在室温下将样品凝结30分钟，然后以1000x g离心15分钟。取出血清并测定。立即使用样品或将样品等分保存在≤-20℃下。使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。样品在收集后30分钟内以1000x g的速度离心15分钟，并立即分析样品或将样品等分并保存在≤-20℃下。对于血清和血浆样品，均应避免反复冻融循环。通常，不应使用严重溶血样品和高白蛋白样品。

白介素8(IL-8)

白细胞介素8(IL-8)是趋化因子中性粒细胞特异性CXC亚家族的成员，是一种有效的中性粒细胞趋化和激活因子。它是由许多细胞(包括单核细胞/巨噬细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、角质形成细胞、肝细胞、星形胶质细胞和软骨细胞)响应促炎性刺激(例如IL-1、TNF、LPS和病毒)而产生的主要炎性细胞因子。其功能部分为将中性粒细胞吸引至炎症部位并激活它们。IL-8与两个七跨膜、G蛋白偶联受体CXCR1和CXCR2以及红细胞上非信号性Duffy抗原结合。Duffy抗原可能在调节功能性受体的IL-8活性中发挥作用。

IL-8可以使用Quantikine测定法进行测量。Quantikine IL-8免疫测定为3.5小时固相ELISA，旨在测量细胞培养上清、血清和血浆中的人IL-8。基于针对大肠杆菌衍生的人IL-8的72个氨基酸变体而产生的抗体。用相同的重组因子校准。所述测定采用定量夹心酶免疫测定技术。对IL-8具有特异性的单克隆抗体已预包被至微孔板上。将标准品和样品吸取到孔中，并且任何存在的IL-8都被固定化抗体结合。洗去任何未结合的物质后，将对IL-8具有特异性的酶联单克隆抗体加入孔中。洗涤后，将底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺)加入孔中，并且颜色显示与初始步骤中结合的TNF-α的量成比例。停止显色，并在450nm处测量颜色强度，减去540nm和570nm处的读数。

对于细胞培养上清，通过离心去除颗粒。立即测定样品或将样品等分并保存在≤-20℃下。应避免反复冻融循环。对于血清，使用血清分离管(SST)，并在室温下将样品凝结30分钟，然后以1000x g离心15分钟。取出血清并测定。立即使用样品或将样品等分保存在≤-20℃下。使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。样品在收集后30分钟内以1000x g的速度离心15分钟，立即测定样品或将样品等分并保存在≤-20℃下。对于血清和血浆样品，均应避免反复冻融循环。通常，不应使用严重溶血样品和高白蛋白样品。

总IgE

免疫球蛋白E(IgE)在针对寄生虫感染和过敏(1型超敏反应)的免疫保护中起着重要作用。例如，过敏原与致敏肥大细胞或嗜碱性细胞的结合可导致细胞膜上IgE的交联，导致细胞脱颗粒和释放因子(例如组胺)，从而产生典型的1型超敏症状。血清中的IgE浓度通常非常低(<血清总免疫球蛋白的0.001％)。IgE浓度通常为年龄依赖的，在出生时测得最低值。尽管IgE值在特定年龄组内变化较大，但其浓度在5-7岁之间逐渐增加并变得稳定。在患有反复呼吸道疾病的婴幼儿中，IgE的测定可能与预后有关。由于IgE在过敏反应中很重要，因此在患有诸如花粉热、特应性支气管炎和皮炎等过敏性疾病的患者中，IgE的浓度会升高。血清IgE浓度升高也可能发生在非过敏性疾病(例如支气管肺曲菌病、wiskott-aldrich综合征、高IgE综合征、IgE骨髓瘤和寄生虫感染)中。

IgE II测定(Elecsys)使用特异性针对人IgE的单克隆抗体。Elecsys测定为夹心免疫测定。在第一次孵育期间，将样品(10μL)中的IgE与生物素化的单克隆IgE特异性抗体和用钌复合物(三(2,2’-联吡啶基)钌(II)-复合物(Ru(bpy)2+)标记的单克隆IgE特异性抗体混合以形成三明治复合物。加入链霉亲和素包被的微粒后，所述复合物通过生物素和链霉亲和素的相互作用而与固相结合，然后将反应混合物吸到测量池中，其中微粒被磁性捕获至电极表面。然后用ProCell去除未结合的物质。在电极上施加电压会产生化学发光，其通过光电倍增管测量。结果通过校准曲线确定，所述校准曲线是由两点校准专门生成的仪器曲线和通过试剂条形码提供的主曲线生成。

可选地，可以使用基于ImmunoCAP的测定法(Phadia US,Inc.,)。在所述测定中，和ImmunoCAP共价偶联的抗-IgE与患者样品中的总IgE反应。洗涤后，加入针对IgE的酶标记抗体以形成复合物。孵育后，洗去未结合的酶-抗-IgE，然后将结合的复合物与显影剂孵育。终止反应后，测量洗出液的荧光。荧光与样品中IgE的浓度直接成正比。反应越高，样品中存在的IgE越多。为评估测试结果，使用校准曲线将患者样本的反应转换为浓度。

可以使用多种患者样品。可以使用标准采样管或包含分离凝胶、Li⁺-肝素、Na⁺-肝素、K⁺-EDTA和柠檬酸钠血浆的试管收集血清。使用柠檬酸钠时，结果必须通过+10％校正。

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