阅读说明：本技术 一种用于人月经血的保存液及其制备方法 (Preservation solution for human menstrual blood and preparation method thereof ) 是由 李文东 宋云庆 黎波 卢瑞珊 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于干细胞保存的生物技术领域,提供了一种用于人月经血的保存液及其制备方法。保存液的成分包括生理盐水、水蛭素、葡萄糖、羟乙基淀粉、左氧氟沙星、复合维生素、谷胱甘肽、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂,其制备方法如下：1)制备A液：往生理盐水中分别加入葡萄糖、水蛭素以及左氧氟沙星；2)制备B液：往生理盐水中分别加入羟乙基淀粉、复合维生素以及谷胱甘肽；3)制备C液：将A液、B液混合之后加入坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂,用滤膜过滤后于4℃下保存备用,本发明的保存液能在48小时内维持宫内膜干细胞原有的生物学特性,细胞质量稳定,纯度高。(The invention belongs to the technical field of stem cell preservation, and provides a preservation solution for human menstrual blood and a preparation method thereof. The components of the preservation solution comprise normal saline, hirudin, glucose, hydroxyethyl starch, levofloxacin, multivitamin, glutathione and necrotizing apoptosis inhibitor Necrostatin-1/RIP1 kinase inhibitor, and the preparation method comprises the following steps: 1) preparing a solution A: adding glucose, hirudin and levofloxacin into physiological saline respectively; 2) preparing a solution B: respectively adding hydroxyethyl starch, vitamin complex and glutathione into physiological saline; 3) preparing a solution C: the liquid A and the liquid B are mixed, and then added with necrotizing apoptosis inhibitor Necrostatin-1/RIP1 kinase inhibitor, and the mixture is filtered by a filter membrane and stored at 4 ℃ for later use.)

一种用于人月经血的保存液及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞保存的生物技术领域，具体涉及一种人月经血保存液及其制备方法。

背景技术

月经是由下丘脑、垂体和卵巢三者生殖激素之间的相互作用来调节的，在***中的月经期和增殖期，血中***和孕酮水平很低，从而对腺垂体和下丘脑的负反馈作用减弱或消除，导致下丘脑对促进性腺激素释放激素的分泌增加，继而导致腺垂体分泌的***和***增多，因而使卵泡发育，***分泌逐渐增多。此时，***又刺激子宫内膜进入增殖期。***使孕激素分泌增多，导致***。此期中***与孕激素水平均升高。这对下丘脑和腺垂体产生负反馈抑制加强的作用，因而使***刺激素和***水平下降，导致黄体退化，进而***和孕激素水平降低。子宫内膜失去这二种激素的支持而剥落、出血，即发生月经。此时，***和孕激素的减少，又开始了下一个***。

月经的成分主要是血液(3/4动脉血，1/4静脉血)，子宫内膜组织碎片和各种活性酶及生物因子，其中纤维蛋白溶解酶使月经血呈液态，不致凝固，***素起收缩子宫的作用。月经血在离体情况下在短时间内迅速凝固；活力下降，这直接影响了月经血中的宫内膜干细胞的细胞质量。宫内膜干细胞的活力直接与月经血保存相关；月经血离体后凝结、经血中的激素等对细胞质量的影响；如何避免上述成为了首要解决的问题。此外，这些问题直接制约了月经血来源的宫内膜干细胞体外培养成功与否；因此，兹需开发一种月经血保存液，一方面满足抗凝、抑菌的作用，另一方面可满足月经血离体保存48h后仍能提取出数量充足、质量佳的宫内膜干细胞。

现有技术中的月经保存液一般会添加青霉素、氨基酸、人血白蛋白等物质用于保存离体组织，但是由于其营养成分单一且成本较高、抗生素浓度大等原因，虽抗生素能降低染菌几率，但对胎盘干细胞存在一定的毒性，导致种子细胞在长期保存或运输中出现活力低下、甚至死亡等现象。随后人们为了进一步改善保存液的组成体系，以无机离子构成的缓冲液的基础上添加数种氨基酸和抗生素以维持离体细胞活性、降低染菌率。这些措施虽然在较长时间内很好的维持了种子细胞的活性，但保存液的成分复杂，配制需要经过称量、灭菌等步骤，操作过程繁琐，不能便携应用。因此为了适应临床应用需要，开发一种营养成分多元且方便配置的胎盘保存液成为了当务之急。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种用于人月经血的保存液及其制备方法，提供一种能够很好的维持月经来源的宫内膜干细胞的活力，不引起细胞的功能性变异，现有技术中，白蛋白等常作为维持胎盘间充质干细胞的活力营养来源，本发明在此基础上进一步改进了保存液的离子缓冲体系和营养体系，同时优化制剂中的成分组成和改良运输条件，尽可能的维持细胞存活率，维持其生物特性。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于人月经血的保存液，保存液的成分包括生理盐水、水蛭素、葡萄糖、羟乙基淀粉、左氧氟沙星、复合维生素、谷胱甘肽、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂。

进一步地，所述水蛭素的浓度为(1～5)×水蛭素，水蛭素是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65～66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)，水蛭素对凝血酶由极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂；

所述生理盐水为基础的缓冲溶液，从试剂公司购置，可保证保存液缓冲体系的稳定性，避免了人为配置所引起的质量差异；

所述葡萄糖作为宫内膜干细胞的基础营养成分，能被细胞直接吸收利用，提高细胞的抵抗能力，维持了细胞的活性；

所述羟乙基淀粉的浓度为1～5％，其能够维持保存液渗透压，使得宫内膜干细胞在一个等渗等压的环境下保存，为了胎盘间充质干细胞的活性；

所述左氧氟沙星的浓度为(1～2)×左氧氟沙星，左氧氟沙星喹诺酮类药物中的一种，具有广谱抗菌作用，抗菌作用强，能够有效地抑制女性***各类型的菌群，对多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属和流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟菌等革兰阴性菌有较强的抗菌活性；对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌等革兰阳性菌和肺炎支原体、肺炎衣原体也有抗菌作用；

所述坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂的浓度为5～10ng/mL，坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂能直接一直细胞凋亡、保存细胞的生物特性，能全方位的提升细胞的存活率，维持细胞存活；

所述复合维生素的浓度为1～5mg/mL；

所述谷胱甘肽的浓度为1～5mg/mL，谷胱甘肽是一种强效抗氧化剂，存在身体的每一个细胞中，能够清除多余的自由基，达到抗氧化作用。

本发明还提供了一种人月经血保存液的制备方法，包括如下步骤：

1)制备A液：往生理盐水中分别加入葡萄糖、水蛭素以及左氧氟沙星即得A液；

2)制备B液：往生理盐水中分别加入羟乙基淀粉、复合维生素以及谷胱甘肽即得B液，复合维生素和谷胱甘肽的联合使用能够全方位的提高细胞的抗氧化功能；

3)制备C液：将A液、B液混合之后加入坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂即得C液，用滤膜过滤之后于4℃的环境温度下保存备用，低温保存月经血保存液，一方面可避免营养成分变性，另一方面保持种子细胞的生物活性。

步骤3)所述的A液、B液混合的体积比为1:1，所述的滤膜的孔径大小为0.22μm。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于人月经血的保存液以葡萄糖作为基础营养成分，生理盐水为缓冲溶液，还包含不同的抗凋亡制剂，能够增强细胞的抗逆性，合适的保存环境和营养供给能够很好地维持月经来源的宫内膜干细胞的活力，保证离体胎盘在保存液中长时间的维持存活率，不引起细胞的功能性变异，对离体月经起到抗凝、抑菌的作用，本发明的保存液对离体经血的保存时间达48小时，能在48小时内维持宫内膜干细胞原有的生物学特性，保持细胞的质量，解决了月经血离体保存的技术问题，同时分离出来的细胞并未出现分化，细胞质量稳定，纯度高，能大规模生产。

本发明的保存液的制备步骤简便，能在短时间内配置大量，成本低廉、成分稳定、安全、无任何毒副作用。

说明书附图

图1为本发明的保存液用于月经血后提取宫内膜干细胞的对照组的流式鉴定图；

图2为本发明的保存液用于月经血后提取宫内膜干细胞的样品组的流式鉴定图；

图3为本发明的保存液用于月经血后提取宫内膜干细胞的细胞形态检测图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于人月经血的保存液的制备方法：

1)制备A液：往0.9％生理盐水中分别加入葡萄糖、水蛭素以及左氧氟沙星即得A液，得4％葡萄糖、(2～10)×水蛭素、(2～4)×左氧氟沙星；

2)制备B液：往0.9％生理盐水中分别加入羟乙基淀粉、复合维生素以及谷胱甘肽即得B液，得2～10％羟乙基淀粉、2～10mg/mL复合维生素、2～10mg/mL谷胱甘肽；

3)制备C液：将A液、B液按体积比为1:1混合之后加入Ac-DEVD-CHO即得C液，获得终浓度为2％葡萄糖、(1～5)×水蛭素、(1～2)×左氧氟沙星、1～5％羟乙基淀粉、1～5mg/mL复合维生素、1～5mg/mL谷胱甘肽、5～10ng/mL坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂的保存液，用0.22μm滤膜过滤之后于4℃的环境温度下保存备用。

试验例1

1)人月经血采集

以18～36岁、***规律、经期时间为5～7的妇女的月经血为实验对象，月经以见红为时间起点，12～36小时内采集月经血，采集前用无菌纱布擦拭外阴，内置月事杯至***内，15～30分钟取出，用无菌吸管吸出月经血，与实施例制得的保存液按体积比为1:10轻柔充分混匀，置于4℃下保存；

2)人月经血保存

采集的月经血在0h、24h、48h的时间内进入细胞的分离培养，保存过程保持4℃；

3)宫内膜干细胞的培养

按淋巴分离液：月经血体积比＝1：1；用一次性移液管每管加入淋巴细胞分离液，用一次性移液管或巴氏吸管将稀释后的血液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。将离心管转移至离心机，700g离心15min。离心后将白膜层吸出出，转移至另一支50mL离心管中，用一次性移液管加RPMI 1640培养基至40mL，重悬PBMC，500g离心5min。弃上清，用高糖DMEM+10％FBS重悬细胞沉淀，接种至10cm平皿中，转移至37℃、5.0％CO₂、湿度为95.0％的CO₂培养箱中培养。

4)宫内膜干细胞的质量评价

a.形态检测：取处于对数生长期的宫内膜干细胞，置倒置显微镜下观察细胞的形态。

b.增殖速度：细胞接种后48h后，进行换液处理；每隔48h取一皿细胞进行酶解，直至该批细胞融合度达100％，统计细胞数量，得出细胞增殖速度。

c.流式结果检测：取处于对数生长期的宫内膜干细胞，调整细胞密度为1×10⁶cells的细胞悬液，分别取抗人CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR的单克隆抗体各2.5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，作为样本组，同时设立同型对照为对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL 1640重悬后上机检测，(样品组含有荧光抗体，同型对照设定的门作为界限以确定细胞的具体纯度)；

图1为对照组的流式鉴定图，图2为样本组的流式鉴定图，从流式结果来看，宫内膜干细胞高表达CD73、CD90、CD105，表达率分别为99.9％、99.9％、97.2％；低表达HLA-DR、CD45、CD19、CD11b、CD34，表达率分别为0.1％、0.0％、0.1％、0.4％、0.2％。符合间充质干细胞的表面抗原特征(国际干细胞协会ISCT颁布的间充质干细胞的鉴定标准：阳性表达：CD73、CD90、CD105>95.0％；阴性表达HLA-DR、CD45、CD11b、CD34、CD19<2.0％)，说明宫内膜干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。

试验例2

取实施例1制得的保存液按照试验例2对月经血进行保存，提取出来的宫内膜干细胞进行扩增培养后，取3分样品(样品1、样品2、样品3)进行细胞活率和形态检测，细胞活率的检测如下表(表1)所示，可见本实施例的保存液对于细胞的保存效果显著。

表1样品细胞活率检测结果

组别	活率
		宫内膜干细胞 样品1	94.07％
宫内膜干细胞 样品2	96.55％
		宫内膜干细胞 样品3	95.73％

图3为细胞的形态检测，将宫内膜干细胞在台盼蓝检测下，细胞均拒染，死细胞被染成蓝色，活细胞拒染，说明了宫内膜细胞在本实施例的保存液的作用下依然保持活力。

试验例3

做4组不同保存液用于月经血保存，并检测月经血中单个核细胞的在不同保存时间下的存活率如表2所示，四组保存液分别为空白对照组、保存液A、保存液B和保存液C，其成分分别如下所示：

空白对照组：0.9％生理盐水、2×左氧氟沙星；

保存液A：0.9％生理盐水中含有1×水蛭素、2％葡萄糖、2％羟乙基淀粉、2×左氧氟沙星；

保存液B：0.9％生理盐水中含有1×水蛭素、2％葡萄糖、2％羟乙基淀粉、2×左氧氟沙星、5mg/mL复合维生素、5mg/mL谷胱甘肽；

保存液C：0.9％生理盐水中含有1×水蛭素、2％葡萄糖、2％羟乙基淀粉、2×左氧氟沙星、5mg/mL复合维生素、5mg/mL谷胱甘肽、10ng/mL坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1/RIP1激酶抑制剂。

表2月经血中单个核细胞不同保存时间的存活率

*表示与对空白照组相比，具有显著性差异，P<0.05；

**表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，P<0.001；

#表示与保存液C相比，具有显著性差异，P<0.05；

##表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，P<0.001。

以上P值为统计学根据显著性检验方法所得。

由此可见，本发明的人月经血保存液对离体经血的保存时间能够长达48h，且存活率达到79.86±5.88％，解决了月经血离体保存的技术问题，同时分离出来的细胞并未出现分化，细胞质量稳定，纯度高。