一种甘草地上部分总黄酮的提取及其脂质体的制备方法
阅读说明：本技术 一种甘草地上部分总黄酮的提取及其脂质体的制备方法 (Method for extracting total flavonoids from aerial parts of liquorice and preparing liposome of total flavonoids ) 是由 宋吉明 董庄庄 朱泽华 方晶 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种甘草地上部分总黄酮的提取及其脂质体的制备方法,属于中医药技术领域。其包括以下步骤：将甘草地上部分茎叶烘干、粉粹,过筛,按一定料液比加入乙醇溶液进行加热回流提取,取滤液进行减压浓缩至提取液的1/10,在浓缩液中加入乙酸乙酯溶液,取上清液过滤、减压浓缩、烘干,得甘草地上部分粗黄酮。本发明的有效结果是：甘草地上部分利用度高,操作简单,成本低,黄酮提取率高,可达85.5%。本发明同时着眼于甘草黄酮新型纳米给药系统的构建,采用薄层分散法制备黄酮脂质体。经本发明制备得到的黄酮脂质体颜色为乳黄色,呈圆形或类圆形,平均粒径为157.8 nm,分布均匀,脂质体的包封率为72.33%,该方法简单、原料易得、稳定性好,具有良好的生物利用度。(The invention discloses an extraction method of total flavonoids in aerial parts of liquorice and a preparation method of liposome of the total flavonoids, and belongs to the technical field of traditional Chinese medicines. Which comprises the following steps: drying, crushing and sieving the overground part stems and leaves of the liquorice, adding an ethanol solution according to a certain material-liquid ratio, heating and refluxing for extraction, taking the filtrate, concentrating under reduced pressure to 1/10 of the extracting solution, adding an ethyl acetate solution into the concentrated solution, taking the supernatant, filtering, concentrating under reduced pressure, and drying to obtain the overground part crude flavone of the liquorice. The effective results of the invention are: the utilization rate of the aerial part of the liquorice is high, the operation is simple, the cost is low, and the extraction rate of the flavone is high and can reach 85.5 percent. The invention simultaneously focuses on the construction of a novel liquorice flavone nano drug delivery system, and the thin-layer dispersion method is adopted to prepare the flavone liposome. The flavone liposome prepared by the method is creamy yellow, is round or quasi-round, has the average grain diameter of 157.8 nm, is uniformly distributed, has the entrapment rate of 72.33 percent, and has the advantages of simple method, easily obtained raw materials, good stability and good bioavailability.)
技术领域
本发明涉及一种从甘草地上部分中提取活性成分的方法，具体涉及一种甘草地上部分总黄酮的提取及其脂质体的制备方法。
背景技术
甘草地上部分富含黄酮类化合物，甘草黄酮具有明显的抗氧化作用，可以预防肿瘤的发生，并具有***样作用，对胃溃疡、肝损害、解痉、病原微生物、酶及抗炎、抗***反应等方面都有明显的药理作用。然而，在甘草的传统使用方法中只取用甘草根，而对地上部分未合理利用，同时由于许多黄酮类活性成分溶解度不高，稳定性低，吸收差，生物利用度低等性质而限制了相关制剂的开发与临床应用。文献（康雪芳等，甘草地上部分脂溶性总黄酮抗氧化活性研究，环球中医药，2016，9(05)：567-570）通过建立了HPLC-DAD高效液相指纹图谱很好地反映甘草地上部分脂溶性黄酮类成分，具有良好的抗氧化能力。因此对甘草地上部分的开发研究是很有必要的。
目前，对甘草地上部分开发工艺的文献报道甚少，文献（韩亚男等，野生和栽培甘草不同器官中总黄酮和总多糖的动态积累规律研究，北京中医药大学学报，2014，5：344-348）分别对不同时期甘草的根、茎、叶总黄酮和总多糖进行研究，结果表明在整个生长时期甘草茎中总黄酮含量为1.6-1.8%。文献（张鲁等，甘草地上部分黄酮类成分HPLC-MS分析，辽宁中医药大学学报，2018，20(05)：48-51）研究了甘草地上部分茎叶黄酮成分的分析，为甘草地上部分化学成分的解析提供更可靠的依据，但未对有效成分进行分离纯化。专利CN102836202A（波拉提·马卡比力，一种甘草地上部分综合开发利用的方法）公开了甘草地上有效成分的开发利用，但对多种生物活性分离得到黄酮产物提取率低，与本发明相比，本发明制备方法简单、提取率较高。
为充分利用甘草资源，避免甘草地上部分资源的过度浪费，本发明通过研究影响甘草地上部分总黄酮回流提取效果的各个因素，确定了其最佳的提取工艺条件，提取分离纯化甘草地上部分总黄酮，并制备得到黄酮脂质体，在得到最佳提取条件下得到黄酮提取率，同时以期达到增加甘草黄酮的溶解度，提高其生物利用度的目的。
发明内容
针对现有技术，本发明要解决甘草地上部分资源浪费，甘草总黄酮生物利用度低以及活性成分不能被机体很好吸收的技术难题。提供了一种甘草地上部分总黄酮的提取分离方法及黄酮脂质体的制备方法，在甘草总黄酮提取分离纯化的的基础上，制备出一种可改善水溶性、提高生物利用度的甘草总黄酮脂质体。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种甘草总黄酮脂质体及其制备方法，包括以下步骤：
一种甘草地上部分总黄酮组分的提取及脂质体的制备，包括以下步骤：
1.一种甘草地上部分总黄酮提取方法，步骤如下：
（1）甘草地上部分粗提液的制备：
将甘草地上部分剪裁至小段置于50-70℃烘箱干燥过夜，用粉碎机粉碎过60目筛，精密称取甘草地上部分粉末100 g，加入10-20倍量80%乙醇溶液，在65-85℃条件下回流1-3 h，减压抽滤分离滤液和滤渣，将滤渣重复提取1-3次，合并上清液，即得甘草地上部分粗提液。
（2）甘草地上部分提取液黄酮成分的分离
将步骤（1）得到的甘草地上部分粗提液减压浓缩至原体积的1/10-1/5，加入1-3倍量乙酸乙酯溶液萃取，取上层层析液，重复性操作1-3次，合并上层层析液，减压浓缩除去乙酸乙酯，烘干至恒重。
（3）甘草地上部分提取液黄酮成分的纯化
将大孔树脂用乙醇浸泡12-24 h进行预处理使其充分溶胀，取步骤（2）中粗提物用乙醇溶解过0.45 μm滤膜，滤液首先通过AB-8大孔树脂，吸附饱和后甘草黄酮类化合物留在树脂上，而其他化合物则留在尾液中，再用乙醇溶液洗脱，最后得到洗脱液，浓缩至干，即得甘草地上部分总黄酮。
2.薄膜分散法制备甘草地上部分总黄酮脂质体具体实施为：
（1）准确称取卵磷脂100-600 mg、胆固醇50-100 mg于同一梨形瓶中，加入5-30 ml无水乙醇或95%乙醇，超声至完全溶解，再加入1 mg/ml甘草地上部分总黄酮溶液1-10 ml，振摇均匀至溶液呈黄色透明状混合溶液。
（2）在旋转蒸发仪上减压除去混合液中的反应溶剂，优选温度在35-75℃，使其在容器壁上形成一层均匀的薄膜。
（3）取pH为6-8的混合磷酸盐（PBS）缓冲溶液10-50 ml于梨形瓶中，在35-75℃水浴条件下旋蒸10-30 min使膜溶解，放置2-6 h充分水合，将混悬液过微孔滤膜，即得薄膜分散法制备甘草总黄酮脂质体乳液。
本发明通过上述制备方法得到甘草地上部分总黄酮及其黄酮脂质体，经过正交试验得到的最优提取工艺为：乙醇质量浓度80%、回流时间2 h、提取温度85℃、料液比1:20 g/ml，得到甘草地上部分总黄酮提取率为1.54%，达到甘草茎内总黄酮的85.6%，该工艺提取率高、工艺简单、无毒。同时制备得到的黄酮脂质体颜色为乳黄色，形貌呈圆形或类圆形，平均粒径为174.5 nm，分布均匀，脂质体的包封率为72.33%，制备的脂质体形态较好、分散体系稳定、分布均匀、包封率高。其制备方法简单、原料易得，制备得到的甘草总黄酮脂质体具有良好的生物利用度。
附图说明
图1为实施例2得到的甘草总黄酮脂质体载药微粒的扫描电镜图(SEM)。
图2为实施例2得到的甘草总黄酮脂质体载药微粒的透射电镜图(TEM)。
图3为实施例2得到的甘草总黄酮脂质体载药微粒粒径分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
实施例1
1.一种甘草地上部分总黄酮提取方法，步骤如下:
（1）甘草地上部分粗提液的制备
将甘草地上部分剪裁至小段置于60℃烘箱干燥过夜，用粉碎机粉碎过60目筛，精密称取100 g甘草地上部分粉末，加入20倍量80%乙醇溶液，在85℃条件下回流2 h，减压抽滤分离滤液和滤渣，将药渣重复提取一次，合并两次上清液，即得甘草地上部分粗提液。
（2）甘草地上部分提取液黄酮成分的分离
将步骤(1)得到的甘草地上部分粗提液减压浓缩至原体积的1/10，加入3倍量乙酸乙酯溶液萃取，取上层层析液，重复性操作一次，合并两次上层层析液，减压浓缩除去乙酸乙酯，烘干至恒重。
（3）甘草地上部分提取液黄酮成分的纯化
将大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h进行预处理，取步骤(2)中粗提物用80%乙醇溶解过0.45 μm滤膜，滤液首先通过AB-8大孔树脂，吸附饱和后甘草黄酮类化合物留在树脂上，而其他化合物则留在尾液中，用80%乙醇溶液洗脱，最后得到洗脱液浓缩至干，即得甘草地上部分黄酮总黄酮1.54克，提取率为1.54%，回收率可达到甘草茎内总黄酮的85.6%。
实施例2
一种甘草地上部分总黄酮脂质体的制备方法，步骤如下:
精密称取卵磷脂400 mg、胆固醇100 mg于梨形瓶中，加入20 ml无水乙醇作为有机溶剂，超声至溶解完全，加入1 mg/ml甘草地上部分黄酮溶液5 ml，振摇均匀至溶液呈黄色透明状混合溶液，35℃减压除去反应溶剂，至瓶内壁形成一层黄色透明薄膜，然后加入pH6.8的PBS溶液40 ml，在63℃下水浴反应30 min,放置3 h充分水合，样品过0.45 μm微孔滤膜，即得薄膜分散法制备甘草总黄酮脂质体，测定包封率为72.33%。
结果分析：通过扫描电镜和透射电镜观察实施例2甘草总黄酮脂质体载药微粒的外观形状，发现载药微粒成规则的圆球形或椭球形，表面光滑，大小均匀，如图1、图2所示。同时测量了纳米粒子的粒径分布曲线，其图3为甘草总黄酮脂质体载药纳米粒子粒径分布曲线图，从图中可以看出，平均粒径为174.5 nm，粒度分布均匀。