阅读说明：本技术 一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法 (Preparation method of silk fibroin scaffold material capable of realizing long-acting drug sustained release ) 是由 敖英芳 孙牧旸 胡晓青 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法,利用液氮速冻制得的丝素蛋白冷冻海绵作为缓释药物的载体,利用丝素蛋白低温自组装的特性实现药物包裹与缓释,并根据从丝素蛋白溶液制备到最终药物加载的技术路线,即差式热实验寻找玻璃化转变温度-药物添加-低温冷冻保存-解冻及使用,实现药物的长期可控缓释。同其他载药形式相比,本技术的实施方案无毒性添加成分,不需要化学交联剂和有机溶剂,载药率极高,并且本技术方案的制备工艺简单可控,适合大规模工业推广。(The invention relates to a preparation method of a silk fibroin scaffold material capable of realizing long-acting drug slow release, which utilizes a silk fibroin frozen sponge prepared by liquid nitrogen quick freezing as a carrier for slow release of a drug, utilizes the characteristic of low-temperature self-assembly of silk fibroin to realize drug wrapping and slow release, and realizes long-term controllable slow release of the drug according to the technical route from preparation of a silk fibroin solution to final drug loading, namely, differential thermal experiment searching for glass transition temperature, drug addition, low-temperature cryopreservation, thawing and use. Compared with other medicine carrying forms, the embodiment of the technology has no toxic additive components, does not need chemical cross-linking agents and organic solvents, has extremely high medicine carrying rate, and the preparation process of the technical scheme is simple and controllable, and is suitable for large-scale industrial popularization.)

一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法

技术领域

本发明属于组织损伤修复技术领域，特别是指一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法。

背景技术

以各类小分子药物和细胞因子为核心的药物疗法是目前临床药物研发中的重点领域之一。除了需要通过对药物的活性和药效进行调控外，如何筛选和构建合适的药物控释载体也在药物研发中有着重要的分量。针对不同的病灶与病症，药物载体需要在突释与缓释之间寻找平衡。除了进行疾病治疗时需要使用药物，在组织工程领域，药物缓释与突释同样具有重大意义。

在进行组织工程支架构建时，一方面需要利用药物对细胞进行快速募集和抑制局部炎症的产生，一方面也需要使药物长期释放，达到对细胞分化增殖进行刺激的效果。同传统药物载体的需求相同，在进行组织工程的药物缓释体系构建时，针对不同的组织缺损，药物-支架载体同样需要调节其降解与药物释放的能力。

在组织损伤修复的领域，缓释药物主要通过物理包裹和化学交联实现。物理包裹以微球的形式为主，通过将聚乳酸、聚己内酯、聚苯乙烯等高分子材料的前体溶液和药物共混，通过乳液聚合等方式实现微球制备的同时，实现药物的混入。药物释放以扩散和材料降解两种形式实现。化学交联通过将药物与材料表面的官能团进行共价交联，利用材料降解与分解实现药物缓释。虽然这两种方法已经有了广泛的研究，但是各自依旧存在明显的缺陷。载药微球制备复杂，需要繁复的工作洗脱有机杂质，载药效率不足40％，此外微球的降解也不如人意。化学交联的载药局限性大，交联效率有限，对药物进行交联修饰时存在改变药效的问题。另外目前实现药物缓释主要依靠合成高分子材料，这类材料虽然制备工艺简单且有利于大规模生产，但是材料的降解时间长，降解产物对机体有副作用。如何通过载药材料的研发实现药物的长期缓释，依旧是目前药物研发的重点方向之一。

同合成高分子材料相比，天然高分子材料的降解产物毒副作用小，易于被体内细胞降解吸收，因此是更合适的载药材料选择。但是天然高分子材料普遍降解较快，材料制备工艺有限，较难实现药物缓释。丝素蛋白作为一类降解时间较长的天然蛋白材料，可以被机体的胶原蛋白酶所酶解，降解产物与胶原蛋白相同。蛋白提炼简单，免疫原性极低，因此是理想的药物缓释成分材料。围绕丝素蛋白构建新型药物缓释体系具有很高的临床应用价值。

基于丝素蛋白的药物缓释体系有很多，其中研究较多的的载药形式有水凝胶包裹和丝素蛋白微球两种。Suhang Wang在《Colloidal Stability of Silk FibroinNanoparticles Coated with Cationic Polymer for Effective Drug Delivery》一文中利用丙酮与丝素蛋白溶液共混制备丝素蛋白微球，并通过表面吸附的形式携带药物实现缓释。Lovett在《Silk hydrogels for sustained ocular delivery of anti-vascularendothelial growth factor(anti-VEGF)therapeutics》一文中将bevacizumab添加到丝素蛋白溶液中，并通过超声诱导蛋白形成水凝胶，实现药物的长期缓释。李琳在公开号为CN109876147A的中国发明专利《一种丝素蛋白微球药物缓释载体的制备方法及其应用》中，利用透析原理获得丝素蛋白微球后，利用吸附的形式实现药物加载，并进行药物缓释。

尽管上述技术均可以实现丝素蛋白材料为主体的药物缓释，但是两篇利用蛋白微球吸附原理实现药物缓释的文章，缓释效果不佳，在12小时便已释放接近50％左右的药物，载药率也比较差。Lovett的工作虽然实现了药物长期缓释，载药率高，但是制备工艺复杂，强度差，不利于临床工作的推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法，以解决现有技术中，以丝素蛋白为主体的药物缓释效果不佳，制备工艺复杂等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法，包括以下步骤：

1)丝素蛋白提炼

将蚕茧加入到煮沸之后的0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌溶解20-40min，将固体物质取出，水洗并在室温下烘干，得到丝素蛋白；

按丝素蛋白与溴化锂的质量比为1：4称取溴化锂，并配备9.3mol/L的溴化锂水溶液；

将溴化锂水溶液加入到放置有丝素蛋白的容器内，令溴化锂水溶液完全覆盖所述丝素蛋白，在50-70℃下搅拌3-5h；

将获得的黄褐色粘稠溶液进行透析，将收集液离心处理，保留上清液；

将上清液利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到海绵状丝素蛋白；

2)相变温度区间确定

根据设定的浓度，将海绵状丝素蛋白溶解成相应的水溶液或盐溶液，并进行消毒后备用；

通过差式热实验对海绵状丝素蛋白溶液的玻璃化转变温度进行测量，得到相变温度区间，温度区间通常从0度到-20度不等；

3)丝素蛋白支架材料的制备

根据需求将步骤2)中的丝素蛋白海绵按相应的浓度进行溶解，并将设定的药物与丝素蛋白溶液进行共混，根据差式热实验所得到的相变温度区间，放入相应的温度中进行低温冷冻变性，得到可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料。

步骤1)中9.3mol/L溴化锂溶液的配制为，先计算好溴化锂溶液的体积，称取60％的水冰浴，边搅拌边将溴化锂缓慢加入水中，待溴化锂完全溶解后将水补充至计算值。

步骤1)中透析的方法为，每12h换一次水，三天后收集透析液在4℃离心转速为9000rpm离心两次，收集上清液。

步骤2)中的消毒采用紫外线消毒或者钴60放射消毒。

所述设定的药物为需要具有长效缓释效果的一种或一种以上药物的组合。

本发明的有益效果是：

本技术将实现药物的长期可控缓释，释放速率完全依赖支架的降解速率，同其他载药形式相比，本技术的实施方案无毒性添加成分，不需要化学交联剂和有机溶剂，载药率极高。本技术方案的制备工艺简单可控，适合大规模工业推广。

附图说明

图1为本实施例的差式热实验结果曲线图；

图2为5％丝素蛋白在不同处理环境下二级结构的变化曲线图；

图3为三种方案制备的5％丝素蛋白支架的水解缓释曲线图；

图4为三种方案制备的5％丝素蛋白支架的酶解缓释曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

本申请提供一种可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料的制备方法，包括以下步骤：

1)丝素蛋白提炼

将10g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.02mol/L的无水碳酸钠溶液(2L)煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解30min，将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂＝1：4的质量比例称取相应的溴化锂。配备9.3mol/L的溴化锂水溶液(先计算好液体体积，之后称取60％左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值)，并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白。之后在60℃下搅拌4h。随后将黄褐色粘稠溶液进行透析，每12h换一次水，3天之后收集并进行离心。离心转速为9000rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液。将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的丝素蛋白冷冻海绵可在室温干燥环境下长期保存。

2)相变温度区间确定

根据设定的浓度，将丝素蛋白海绵溶解成相应的水溶液或盐溶液(如PBS缓冲液)，并进行通过紫外线消毒或者钴60放射消毒后备用；具体设定的浓度根据对不同组织修复所需要的降解速率和载药释放速率不同而改变。

通过差式热实验对丝素蛋白溶液的玻璃化转变温度进行测量，得到相变温度区间，温度区间通常从0度到-20度不等；在本实施例中，我们将丝素蛋白溶液以5％的浓度进行配置，并进行差式热实验分析。实验结果表明，对于这一浓度的丝素蛋白溶液，-7.0到-12.5度是低温相变区间，适合进行冷冻海绵制备。

3)丝素蛋白支架材料的制备

将设定的药物与步骤2)中备用的丝素蛋白溶液进行共混，并根据差式热实验所得到的相变温度区间，放入相应的温度中进行低温冷冻变性，得到可长效药物缓释的丝素蛋白支架材料。

检测方法

在本技术方案中，设定的药物是指需要具有长效缓释效果的一种或一种以上药物的组合。在本申请的以下实施例中，均是以罗丹明为实验的示范药物，但并不是说本申请的技术方案仅适用于作为罗丹明的载体，而是受篇幅等的限制而没有对其它药物进行说明。将罗丹明作为实验的示范药物，与丝素蛋白冷冻海绵溶液进行共混，根据差式热实验得到的结果，放入相应的温度中进行低温冷冻变性，12-72小时不等后取出，并进行接下来的实验表征。

为验证支架材料的药物缓释能力，我们分别制备了丝素蛋白水凝胶和醇处理的丝素蛋白冻干海绵作为对照组，与本技术方案的丝素蛋白冷冻海绵为支架材料进行分析。丝素蛋白水凝胶利用5％的丝素蛋白与1.68mM过氧化氢和3U/mL的过氧化氢酶共混制备而成。醇处理的丝素蛋白冻干海绵的制备方法为：将5％丝素蛋白溶液冻干后用乙醇浸泡4小时，随后多次水洗除去乙醇，并再次冻干。

支架材料的载药率测定方法为，向三种材料制备的支架中混入相同浓度的罗丹明，通过各自的方法制备为相应支架后，用胃蛋白酶K将支架充分酶解，用酶标仪测定罗丹明的荧光强度。通过绘制标准曲线，得到罗丹明的荧光强度与浓度之间的线性关系，并进行接下来的计算。支架罗丹明含量与初始含量的比值就是支架的载药率。

支架的缓释曲线测定包括水解和酶解两部分。三种支架携带相同浓度的罗丹明，制备结束后分别用3mL的PBS溶液和0.8U/mL的胃蛋白酶K浸泡，前者用来进行水解实验，后者用来进行酶解实验。每天吸取0.1mL进行荧光强度测量，并向管中补充0.1mL新鲜的PBS或者胃蛋白酶K溶液。经过10天，将高浓度胃蛋白酶K粉末投入，使支架完全降解，并测量最终的荧光强度。支架的水解和酶解缓释曲线分别以累计释放比例的形式展示。

检测结果

差式热检测结果

差式热实验用来确定丝素蛋白溶液的低温相变区间。在本实施例中，我们将丝素蛋白溶液以5％的浓度进行配置，并进行差式热实验分析。实验结果表明，对于这一浓度的丝素蛋白溶液，-7.0到-12.5度是低温相变区间，适合进行冷冻海绵制备，如图1所示。

丝素蛋白海绵在冷冻过程中的结构变化

如图2所示，丝素蛋白在液氮中冷冻处理并冻干后，在1650cm^-1左右有一个主峰，表示其主要成分以无规的蛋白链段为主(Random coils)。在-18℃温度下处理并冻干后，蛋白的峰逐渐向1658cm^-1左右发生蓝移，表明有二级结构α螺旋(α-helix)产生，同时在1628cm^-1附近也有肩峰出现，表明二级结构β折叠(β-sheet)形成。而在我们通过冷冻形成的海绵的光谱图中，可以看到在1658cm^-1处有一明显的主峰。同传统上制备丝素蛋白海绵的方法，即冻干后用弱极性溶剂(甲醇、乙醇)浸泡处理的方法相比，冻干海绵在1628cm^-1处的β-sheet峰明显弱于酒精处理组，表明两种海绵具有截然不同的结构。

丝素蛋白冷冻海绵的载药率测定

通过比对支架的初始载药量和酶解后的支架载药量，我们发现丝素蛋白凝胶和丝素蛋白冷冻海绵的载药量均达到100％，而丝素蛋白醇处理海绵的载药量受乙醇和水洗脱的影响，仅有83±4.1％。

丝素蛋白海绵的药物缓释曲线

图3所示为丝素蛋白凝胶、丝素蛋白冷冻海绵和醇处理海绵的罗丹明缓释曲线对比。在PBS中进行水解时，丝素蛋白凝胶在第三天实现了完全释放，在第四天的时候丝素蛋白发生变性，凝胶由透明转变为白色，并且对已经释放的罗丹明进行了再吸附，导致溶液的累积药物释放率不断下降。丝素蛋白冷冻海绵和醇处理海绵均具有极佳的水稳定性，在第一天第二天释放不到10％后就不再释放罗丹明。

如图4所示，在胃蛋白酶K中进行酶解缓释时，由于酶的降解能力，水凝胶在第一天就已经完全降解并释放所有罗丹明。丝素蛋白冷冻海绵的药物释放同降解同步进行，在第九天时释放超过35％，累积释放率达到38±2.4％。丝素蛋白醇处理海绵的降解稳定性更强，在酶溶液中降解缓慢，第九天仅有15％的释放。同醇处理海绵相比，我们研发的丝素蛋白冷冻海绵具有相同的水稳定性，避免药物的突释，同时在体液酶环境下降解更快，避免药物缓释过慢的问题。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。