有孢汉生酵母及其在黄桃果酒中的应用
阅读说明：本技术 有孢汉生酵母及其在黄桃果酒中的应用 (Hansenula sordida and application thereof in yellow peach fruit wine ) 是由 刘伟 张菊华 李高阳 张群 朱向荣 苏东林 尚雪波 卞建明 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种有孢汉生酵母及其在黄桃果酒中的应用。该有孢汉生酵母为有孢汉生酵母(Hanseniaspora pseudoquilliermondii)HT9,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M 2021444。该有孢汉生酵母可应用于黄桃果酒加工中,包括以下步骤：原料榨汁、护色及酶解、成分调整、酵母活化接种、发酵、终止发酵和下胶过滤。本发明的有孢汉生酵母在应用时具有增加黄桃果酒香气复杂性、提高果香浓郁度、提高黄桃果酒的品质等优点。(The invention discloses a Hanseng yeast with spores and application thereof in yellow peach fruit wine. The Hanseniaspora pseudomonad is Hanseniaspora pseudolliermondii HT9, and the preservation number of the Hanseniaspora pseudolliermondii in China center for type culture Collection is CCTCC No: m2021444. The Hansenula over spore can be applied to processing of yellow peach fruit wine, and comprises the following steps: juicing raw materials, protecting color and performing enzymolysis, adjusting components, activating and inoculating yeast, fermenting, stopping fermentation, adding gum and filtering. When being applied, the Hanseng yeast with spores has the advantages of increasing the complexity of the aroma of the yellow peach fruit wine, improving the richness of the aroma of the yellow peach fruit wine, improving the quality of the yellow peach fruit wine and the like.)
技术领域
本发明涉及食品加工
技术领域
，具体涉及一种有孢汉生酵母及其在黄桃果酒中的应用。背景技术
黄桃是湖南省特色水果，在株洲、怀化和郴州等地大量种植。黄桃富含多种营养物质和微量元素，香气浓郁、美味可口，深受消费者青睐。黄桃产量和市场价格较高，在助力农民脱贫致富方面发挥着重要作用，是我省重点扶持产业。黄桃一般在每年的7～8月成熟集中上市，在常温下不耐贮藏，鲜食期不到2个月，黄桃鲜销商品果率不高，深加工比例不到10％，重量、外观等不达标的黄桃非商品果，被果农大量低价处理或直接丢弃，造成了极大的浪费和环境污染，黄桃加工成为提高其产业价值的必要一环。目前黄桃加工产品主要包括罐头和黄桃干。黄桃果酒是黄桃较理想的食用途径和深加工模式，它可以最大限度的保留黄桃中原有的营养成分，还可以满足果酒市场多样化的需求。黄桃果酒的开发不仅能显著提高黄桃经济价值，保障果农收益，而且能满足消费者日趋增长的健康化需求。
酵母性能的优劣不仅对果酒酒的口感和风味影响很大，对果酒特色和风格的形成至关重要。目前，我国的果酒生产大多都采用国外进口的葡萄酒酿造的活性干酵母粉，由于水果品种、栽培环境及工艺条件等差异，引入菌种并不能完全表现出其良好品质，产品缺乏典型性，同时外来微生物菌种的大量引入，会影响本土资源的丰富性和多样性。不同产区以及不同水果中野生酿酒酵母分布具有一定规律性。因此，急需探索开发可改善果酒口感和风味的新酵母。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种有孢汉生酵母，还相应提供该有孢汉生酵母在黄桃果酒加工中的应用，具有增加黄桃果酒香气复杂性、提高果香浓郁度、提高黄桃果酒品质等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种有孢汉生酵母，所述有孢汉生酵母(Hanseniaspora pseudoquilliermondii)为有孢汉生酵母HT9，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M 2021444。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的有孢汉生酵母在黄桃果酒加工中的应用。
上述的应用，优选的，包括以下步骤：
S1、原料榨汁、护色及酶解：将黄桃清洗、降农残、去核打浆，得到黄桃浆汁，以黄桃浆汁的质量为基准，按质量分数计，添加0.7％～1％D-异抗坏血酸钠、0.5％～1％维生素C和2％～2.5％柠檬酸进行护色，继续添加0.1％～0.12％纤维素酶和0.1％～0.15％果胶酶进行酶解，离心，得到黄桃汁；
S2、成分调整：在步骤S1得到的黄桃汁中加入蔗糖和发酵助剂，所述蔗糖的添加质量占黄桃汁质量的8％～12％，所述发酵助剂的添加量为0.2g/L黄桃汁～0.3g/L黄桃汁，得到含蔗糖和发酵助剂的黄桃汁；
S3、酵母活化接种：将所述有孢汉生酵母先后采用YPD固体培养基、YPD液体培养基进行培养活化，将酿酒酵母先后采用水、果汁活化，将活化后的有孢汉生酵母接种于步骤S2得到的含蔗糖和发酵助剂的黄桃汁中，发酵2天～3天后，再接种活化后的酿酒酵母；
S4、发酵：对接种后的黄桃汁进行超声波辅助发酵，然后进行主发酵；
S5、终止发酵：当黄桃发酵液酒精度达到10度～11度时，加入二氧化硫，在-2℃～-3℃低温下处理，再进行超声处理，经分离倒罐，得到黄桃原酒；
S6、下胶过滤：采用皂土对所述黄桃原酒进行下胶，过滤，灌装，得到黄桃果酒。
上述的应用，优选的，步骤S1中，所述降农残采用臭氧复合高压脉冲电场进行农残降解，即将清洗后的黄桃在臭氧清洗处理的同时进行高压脉冲电场处理，所述臭氧的浓度为5mg/L～15mg/L，所述臭氧清洗处理的时间为15min～30min，所述高压脉冲电场处理的条件为：电场强度2kV/cm～3kV/cm，脉冲时间50μs～150μs，脉冲个数50～100。
上述的应用，优选的，步骤S3中，所述酵母活化接种的具体过程为：将有孢汉生酵母先在YPD固体培养基中培养2天～3天，然后在YPD液体培养基中于26℃～28℃培养18h～24h，得到发酵菌液，将发酵菌液于6℃～8℃离心处理3min～5min，所述离心处理的转速为5000rpm/min～6000rpm/min，收集菌体，然后采用无菌水清洗和重悬菌体，所述清洗的次数为2次～3次，调节菌液浓度为106-7cfu/mL，得到活化后的有孢汉生酵母，于4℃～6℃冷藏保存。
上述的应用，优选的，步骤S3中，所述活化后的有孢汉生酵母按1％～2％的比例接种，所述活化后的酿酒酵母按2‰～5‰的比例接种，所述酿酒酵母为酿酒酵母D47。
上述的应用，优选的，步骤S4中，步骤S4中，所述超声波辅助发酵的具体过程为：将步骤S3接种后的黄桃汁采用低频超声间歇处理，超声功率为100W～150W，超声频率为10kHz～15kHz，每超声处理0.5s停止6s，连续处理5h～8h后停止循环，进入主发酵，在18℃～20℃发酵4天～7天，发酵期间倒罐2次～3次。
上述的应用，优选的，步骤S5中，所述二氧化硫的添加量为30mg/L～50mg/L，所述低温处理的时间为5天～7天，所述超声处理的功率为300W～500W，所述超声处理的频率为40kHz～50kHz，所述超声处理的时间为30min～40min。
上述的应用，优选的，步骤S1中，所述护色的温度为35℃～40℃，所述护色的时间为1h～1.5h，所述酶解的温度为40℃～45℃，所述酶解的时间为2h～3h，所述离心采用蝶式离心方法。
上述的应用，优选的，步骤S6中，所述皂土的添加量为50g/L～60g/L，所述过滤采用错流膜过滤，所述错流膜为圆盘错流膜，过滤流速为10m/s～15m/s。
本发明从湖南省麻阳黄桃产区黄桃果实表面筛选、鉴定得到的有孢汉生酵母HT9，该菌株分离自湖南省麻阳黄桃自然发酵醪。利用本发明的有孢汉生酵母HT9与商业活性干酵母混合发酵。采用超声辅助发酵，有助于酵母的快速增殖，发酵启动速度快，底物葡萄糖的利用率高，同时减少高级醇的生成。发酵至预设酒度，采用少量SO2+低温+超声处理终止黄桃酒的发酵，再经下胶和错流膜过滤后进行灌装得到黄桃果酒。
有孢汉生酵母属(Hanseniaspora，H.)是果酒自然发酵初期出现的主导野生酵母菌属之一，主要有维尼有孢汉生酵母(H.vineae)、葡萄有孢汉生酵母(H.uvarum)、仙人掌有孢汉生酵母(H.opuntiae)、季也蒙有孢汉生酵母(H.guilliermondii)，奥斯曼有孢汉逊酵母(H.osmophila)。与酿酒酵母相比，H.发酵产乙醇能力较低，其在增加酒的挥发性化合物方面起到重要作用。因此，本发明提供具有优良的有孢汉生酵母应用于黄桃果酒发酵，对黄桃果酒酒色泽、香气、感官和风格的改善具有重要意义。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种有孢汉生酵母，可应用于黄桃果酒酿造，具有增加黄桃果酒香气复杂性、提高果香浓郁度、提高黄桃果酒品质等优点。
(2)本发明有孢汉生酵母在黄桃果酒中的应用，利用有孢汉生酵母HT9与酿酒酵母混合发酵，能显著提高乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等酯类香气物质的含量，从而有效增加黄桃果酒中的香气。混合发酵后酒中的酯类物质含量达到了38.37mg/L，较仅使用酿酒酵母D47发酵的高11.54mg/L；其中乙酸乙酯、丁酸乙酯明显增加，乙酸乙酯由18.6mg/L增加至21.6mg/L，乙酸乙酯具有令人愉快的花果香气、菠萝香气，阈值仅为3.6μg/L，对果酒呈现果香的贡献大。
(3)本发明采用臭氧复合高压脉冲电场降解农残，可有效降低臭氧的使用浓度，同时解决目前臭氧降农残不彻底及因降解不完全而生成的毒性更大半降解产物的问题，实现农残的快速有效降解，保证食品安全。臭氧是一种强氧化剂，但在实际水处理中应用较少，主要的原因是经济代价高，如何减少臭氧用量，提高臭氧的利用率是一个难点。臭氧复合高压脉冲电场可产生协同效果，脉冲放电提高了臭氧在水中的溶解度，而高压脉冲放电协同臭氧氧化则充分利用高压脉冲放电产生的液电空化效应，在电极之间的气泡周期性的膨胀收缩产生大量细小气泡，并增大接触面积促使臭氧大量进入液相或在气液界面反应，提高了臭氧氧化的利用效率，因而对农残有很好的降解效果。
(4)本发明在接种酵母后采用低频超声波辅助发酵，通过低频超声可以加速酵母对底物葡萄糖的利用，其生殖代谢加速，酵母快速增值迭代，增加了CO2的生成，减少乙醇合成，同时其他如酯类、酸类等风味物质影响较小；另一方面黄桃中果胶含量较高，发酵后2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇等杂醇含量普遍偏高，采用低频超声超声空化产生的自由基与酒石酸、乙醇、亚铁、铜离子、甘露醇等发生反应，降低了高级醇的生成，有助于果酒品质的提升和风味的改善。
(5)本发明在主发酵完成后采用少量二氧化硫+冷冻+超声处理来终止发酵，保证后期黄桃果酒品质的稳定性。由于黄桃果酒酒精含量低，残糖含量高，产品中微生物依然处于活跃期，后期稳定性难以保证，因此采用发酵后冷冻处理可以更好地抑制残余酵母菌等微生物的继续活动，有助于酒中的果肉悬浮物质加速沉降，增加其稳定性；低温处理对酒体风味成分和整体香气品质影响较小，有助于保持新鲜圆润的口感，改善黄桃果酒的感官品质；同时40kHz～50kHz的超声处理所产生的空穴效应及高能微气泡，可使酒体处于短暂性的高温高压状态，加快酵母菌等微生物细胞的破碎，更好地保证产品微生物稳定性。
一种有孢汉生酵母，所述有孢汉生酵母为有孢汉生酵母(Hanseniasporapseudoquilliermondii)HT9，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M2021444，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2021年4月25日。
本发明的有孢汉生酵母，其菌落形态特征为：将菌种划线接种于YPD(葡萄糖2％、酵母粉1％、蛋白胨2％、琼脂2％)培养基上，28℃培养2d，菌落呈圆形，中心点微凸起，乳白色，边缘处颜色微浅，颜色似同心圆状，表面较光滑，菌落直径3mm～4mm，细胞形态为纺锤状，出芽生殖，产子囊孢子。在麦芽汁琼脂培养基和YPD琼脂培养基28℃培养3天，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
本发明的有孢汉生酵母，进行18S区rDNA测序，测序结果如SEQ NO：1所示。
附图说明
图1为本发明实施例1的有孢汉生酵母的菌落形态特征图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的有孢汉生酵母，该有孢汉生酵母(Hanseniasporapseudoquilliermondii)为有孢汉生酵母HT9，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M 2021444，保藏单位地址位于中国武汉大学保藏中心，保藏日期为2021年4月25日。
有孢汉生酵母HT9分离、纯化及鉴定：
取土壤及黄桃果品表面各10g于90mL YPD液体培养基中，振荡培养24h，取上清液梯度稀释，涂布于YPD培养基上，倒置培养2～3d。黄桃榨汁后装入无菌三角瓶中发酵后，梯度稀释涂布于YPD培养基上，培养2～3d。培养温度均为28℃。挑选具有典型酵母特征的菌落进行平板划线，纯化后接种至YPD斜面培养12～24h，置于4℃冰箱保存。将分离得到的酵母菌经过一级筛选(TTC显色法)、二级筛选(杜氏管法)、三级筛选(糖发酵试验)、四级筛选(黄桃果酒发酵法)后，最终得到一株增香酵母HT9，经鉴定为有孢汉生酵母。
上述菌株经过形态学观察和18SrDNA进行扩增测序，对所有鉴定结果综合分析。具体鉴定结果如下：
形态学观察结果：在YPD培养基28℃培养2d，菌落呈圆形，中心点微凸起，乳白色，边缘处颜色微浅，颜色似同心圆状，表面较光滑。菌落直径3mm～4mm，显微镜观察菌体呈纺锤状，出芽生殖，产子囊孢子。图1为本发明的有孢汉生酵母HT9的菌落形态特征图。先后在麦芽汁琼脂培养基和YPD琼脂培养基28℃分别培养3天，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
18SrDNA扩增测序分析鉴定方法和结果：由上海生工生物工程有限公司进行鉴定和测序；测序结果与NCBI数据库中的已有序列进行比对，确认为有孢汉生酵母(Hanseniaspora pseudoquilliermondii)。测定得到的18SrDNA序列如SEQ NO：1所示。
实施例2：
一种本发明的有孢汉生酵母在黄桃果酒加工中的应用，采用实施例1的有孢汉生酵母，包括以下步骤：
S1、原料榨汁、护色及酶解：将黄桃清洗后，采用高浓度臭氧复合高压脉冲电场进行农残降解，即将清洗后的黄桃在臭氧池进行臭氧清洗处理的同时进行高压脉冲电场处理，臭氧池中臭氧的浓度为10mg/L，清洗处理时间为30min，高压脉冲电场处理的条件为：电场强度2kV/cm、脉冲时间100μs、脉冲个数80，处理后，去核打浆，得到黄桃浆汁，以黄桃浆汁的质量为基准，按质量分数计，添加0.8％D-异抗坏血酸钠(即占黄桃浆汁质量的0.8％)、0.5％维生素C和2.3％柠檬酸，在35℃下护色1h，继续添加0.12％纤维素酶和0.1％果胶酶，在45℃下酶解2h，采用蝶式离心后，得到黄桃汁。
S2、成分调整：在步骤S1得到的黄桃汁中加入蔗糖和发酵助剂，蔗糖的质量占黄桃汁质量的8％，发酵助剂的添加量为0.2g/L黄桃汁，得到含蔗糖和发酵助剂的黄桃汁。
S3、酵母活化接种：将有孢汉生酵母HT9在YPD固体培养基培养2-3天，然后在YPD液体培养基中于28℃培养24h后，得到发酵菌液，将发酵菌液在6℃～8℃、5000rpm/min条件下离心5min，收集菌体，用无菌水清洗2次，用无菌水重悬菌体备用作为待接种的活化种子，调节菌液浓度为106-7cfu/mL，冷藏温度4℃～6℃；有孢汉生酵母HT9活化后按1％～2％的比例接种，发酵2天～3天后接种活化后的酿酒酵母D47(法国拉曼公司生产)，接种比例为2‰～5‰，活化后的酿酒酵母是先采用水活化再用果汁活化的，得到接种后的黄桃汁。
S4、发酵：采用超声波辅助发酵，将接种后的黄桃汁泵入容器中进行低频超声间歇处理，可以保持黄桃汁流速为每秒0.03个发酵体积～0.04个发酵体积，超声功率100W、频率10kHz，每超声处理0.5s停止6s，连续处理6h后停止循环，进入主发酵，在18℃发酵4d，发酵期间倒罐2次。
S5、终止发酵：当黄桃发酵液中酒精度达到10度时，加入30mg/L二氧化硫，在-2℃低温处理5天，再进行超声处理，超声处理的功率为300W、频率为40kHz，处理时间为30min，分离倒罐，得到黄桃原酒。
S6、下胶过滤：经稳定性实验确定下胶量，采用皂土对黄桃原酒进行下胶，皂土的添加量为55g/L，然后错流膜过滤，错流膜具体采用圆盘错流膜，流速为12m/s，果酒过滤后损失率仅为0.4％，灌装，得到黄桃果酒。
对比例1：
一种酿酒酵母加工黄桃酒的方法，与实施例2基本相同，区别在于：步骤S3中只采用酿酒酵母D47发酵而不采用混合发酵。
上述实施例2制得的黄桃果酒和对比例1制得的黄桃酒的挥发性香气物质对比结果如表1所示。
表1实施例2与对比例1的主要挥发性香气物质对比表
从表1可看出，实施例2的HT9+D47混合发酵的黄桃果酒比对比例1的D47发酵的黄桃酒的挥发性香气物质含量明显提高。其中，酯类和醇类增加的较多，乙酸乙酯由18.6mg/L增加至21.6mg/L，乙酸乙酯具有令人愉快的花果香气、菠萝香气，阈值仅为3.6μg/L，是果酒呈现果香的重要贡献；其他含量明显增加的酯类还有辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯等，绝大多数酯类能产生令人愉悦的水果香气。辛酸乙酯具有水果、白兰地酒香味、蘑菇、椰子、奶油、脂肪味等果香气，其香气强度在酯类中仅次于己酸乙酯，癸酸乙酯具有果香和白兰地酒香，因此实施例2中有孢汉生酵母HT9和酿酒酵母D47混合发酵的黄桃果酒香气更复杂和浓郁。
本发明利用筛选出的有孢汉生酵母HT9与酿酒酵母混合发酵酿造黄桃酒，首先采用超声辅助发酵，加速酵母增殖与底物葡萄糖的利用，同时减少高级醇的生成，发酵至预设酒度后采用低温+超声处理，及时终止黄桃酒的发酵，再经下胶澄清和错流膜过滤除菌，最后进行灌装得到黄桃酒。此菌株的应用显著提高酯类等香气物质的含量，增加酒体香气的复杂性，提升黄桃酒的品质，色泽金黄，果香浓郁，酒体醇厚，香味协调，具有黄桃果酒的典型性特征，高级醇含量低，饮后不上头，无头痛感。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南省农产品加工研究所
<120> 有孢汉生酵母及其在黄桃果酒中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 有孢汉逊酵母HT9（Hanseniaspora pseudoquilliermondii HT9）
<400> 1
aggaaaagaa accaactggg attaccttag taacggcgag tgaagcggta aaagctcaaa 60
tttgaaatct ggtactttca gtgcccgagt tgtaatttgt agaatttgtc tttgattagg 120
tccttgtcta tgttccttgg aacaggacgt catagagggt gagaatcccg tttggcgagg 180
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gtgatggaaa gatgaaaaga actttgaaaa gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa 360
agggaagggc atttgatcag acatggtgtt ttttgcatgc actcgcctct cgtgggcttg 420
ggcctctcaa aaatttcact gggccaacat caattctggc agcaggataa atccttaaga 480
atgtagctac ttcggtagtg ttatagctta tgggaatact gctagctggg attgaggact 540
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