一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌kbfs1720及其应用
阅读说明：本技术 一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌kbfs1720及其应用 (Skin source bacterium KBFS1720 with skin ultraviolet burn repairing function and application thereof ) 是由 李英 冉海霞 张涛 张兴银 郑文潇 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720及其应用,该菌株的分类学命名为：Pantoea eucrina,所述皮肤源细菌KBFS1720从长期在阳光下暴露的健康成年人的皮肤上分离得到,获得的具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720的遗传性能不容易丢失,获得的菌株具有显著的稳定性,同时,将皮肤源细菌KBFS1720应用在抵抗紫外辐照及修复光损伤的产品中,能有效减缓紫外辐照对皮肤的损伤,能够显著的修复和改善接受太阳紫外辐照后的皮肤损伤。(The invention provides a skin source bacterium KBFS1720 with skin ultraviolet burn repairing function and application thereof, wherein the taxonomic name of the strain is as follows: the skin source bacterium KBFS1720 is separated from the skin of a healthy adult exposed in sunlight for a long time, the genetic performance of the obtained skin source bacterium KBFS1720 with the skin ultraviolet burn repairing function is not easy to lose, the obtained strain has obvious stability, and meanwhile, the skin source bacterium KBFS1720 is applied to a product for resisting ultraviolet radiation and repairing light damage, so that the damage of the ultraviolet radiation to the skin can be effectively relieved, and the skin damage after the skin is subjected to the solar ultraviolet radiation can be remarkably repaired and improved.)
技术领域
本发明涉及人体微生态学领域。具体而言，涉及一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720及其应用。
背景技术
UV是波长为200nm～400nm的电磁波，根据其波长又分为长波紫外线 UVA、中波紫外线UVB以及短波紫外线UVC，其中，UVC被臭氧层吸收，能达到地面的主要是95％的UVA以及5％的UVB，过量的紫外辐射对人体的健康造成危险，尤其是暴露在外的皮肤。皮肤长期暴露在紫外辐照中会引起皮肤黑色素沉积，皮肤组织中产生氧化应激，引起DNA、 RNA、蛋白质损伤，导致皮肤结构损伤，引起皮肤免疫抑制等。而皮肤作为机体的第一道屏障，保护机体免受物理和化学的损伤，而皮肤细菌定植于人体表面，在共同的历史进化过程中与人体皮肤形成了称之为皮肤微生态的独特生态结构。定植于皮肤的细菌，在皮肤免疫的形成和稳态中起着重要的作用，包括抑制病原菌入侵的定殖抗性、调节自发性炎症和免疫反应、促进宿主建立针对共生微生物的免疫耐受。此外，有研究表明皮肤共生菌群可以诱导一种兼有抗感染性和组织修复功能的适应性免疫，还能干预紫外辐照诱导的皮肤光损伤。但是现有定植于人体皮肤的普通菌群的抵抗紫外辐照的效果差，将菌群应用在产品中时，不能有效减缓紫外辐照对皮肤的损伤。另外，目前针对紫外辐照诱导的皮肤损伤修复产品大多为植物提取物，将微生物应用于皮肤紫外辐照损伤修复的产品中还比较少，因此，在微生物应用于皮肤紫外辐照损伤修复中仍有具有极大的研究意义。
综上，在微生态学领域，仍然就有亟待解决的技术问题。
发明内容
基于此，为了解决普通菌群的抵抗紫外辐照的效果差，不能有效减缓紫外辐照对皮肤的损伤以及遗传物质丢失，不稳定的问题。本发明提供了一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720，该菌株的分类学命名为：Pantoea eucrina，该菌株于2020年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC：61382，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明还提供了所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌 KBFS1720在抵抗紫外辐照及修复光损伤的应用。
本发明还提供了所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌 KBFS1720在制备抵抗紫外辐照及修复光损伤的产品中的应用。
优选地，所述产品能作用于皮肤上。
另外，本发明还提供一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌 KBFS1720的培养方法，包括以下步骤：
分离菌株，得到第一菌悬液；
将第一菌悬液放置于第一培养基中进行培养；
经过多次纯化培养后，进行16S全长测序鉴定所属菌种，筛选出在皮肤中富集的菌株；
将筛选的菌株于第二培养基中进行活化，恒温过夜培养，得到活化菌株；
将活化菌株接种于第三培养基中，恒温气浴，振荡过夜培养，离心，收集菌体沉淀；
利用灭菌PBS缓冲液洗涤菌体沉淀，洗涤完成后，将菌体沉淀悬浮于灭菌PBS缓冲液中，得到菌悬液。
优选地，所述菌株从长期在阳光下暴露的健康成年人的皮肤上分离得到。
优选地，所述第一培养基包括蛋白胨营养琼脂培养基、酵母浸出粉琼脂培养基、脑心浸出液琼脂培养基、蔗糖培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基中的一种或多种。
优选地，所述第二培养基为营养琼脂培养基。
优选地，所述第三培养基为营养肉汤。
优选地，所述菌悬液的菌体浓度为1×106CFU/mL～1×108CFU/mL。
上述方案中的具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720的遗传性能不容易丢失，获得的菌株具有显著的稳定性，同时，将皮肤源细菌KBFS1720应用在抵抗紫外辐照及修复光损伤的产品中，能有效减缓紫外辐照对皮肤的损伤，能够显著的修复和改善接受太阳紫外辐照后的皮肤损伤。
附图说明
图1是本发明皮肤源细菌KBFS1720的菌落形态示意图图；
图2是本发明皮肤源细菌KBFS1720的革兰氏染色10×60镜检示意图；
图3是本发明皮肤源细菌KBFS1720的生长曲线示意图；
图4是本发明皮肤源细菌KBFS1720的染色体组圈示意图图；
图5是本发明皮肤源细菌KBFS1720的质粒圈示意图，其中ABCD表示4个质粒的圈示意图；
图6为本发明实施例5中构建亚急性光损伤模型小鼠的流程示意图；
图7为本发明实施例5中处理模型小鼠的示意图；
图8为本发明实施例5中不同损伤程度的小鼠皮肤H&E染色切片示意图；
图9为本发明实施例5中不同试验组的皮肤形态组织评分统计结果示意图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌 KBFS1720，该菌株的分类学命名为：Pantoea eucrina，该菌株于2020年 12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC： 61382，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720的外观形态表现为表面粘稠、光滑易被挑取，边缘整齐完整，有透光度且有光泽的圆形，菌落外围隆起，中间凹陷；正反面以及菌落边缘与中央颜色均为乳黄色，如图1所示。
在其中一实施例中，本发明还提供所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720在抵抗紫外辐照及修复光损伤中的应用。
在其中一实施例中，本发明还提供所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720在制备抵抗紫外辐照及修复光损伤的产品中的应用。
上述方案中的具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720的遗传性能不容易丢失，获得的菌株具有显著的稳定性，同时，将具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720应用在抵抗紫外辐照的产品中，能有效减缓紫外辐照对皮肤的损伤，具有显著的修复和改善接受太阳紫外辐照后的皮肤损伤的效果。
在其中一个实施例中，所述产品能作用于皮肤上。
在其中一个实施例中，本发明还提供一种具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720的培养方法，包括以下步骤：
分离菌株，得到第一菌悬液；
将第一菌悬液放置于第一培养基中进行培养；
经过多次纯化培养后，进行16S全长测序鉴定所属菌种，筛选出在皮肤中富集的菌株；
将筛选的菌株于第二培养基中进行活化，恒温过夜培养，得到活化菌株；
将活化菌株接种于第三培养基中，恒温气浴，振荡过夜培养，离心，收集菌体沉淀；
利用灭菌PBS缓冲液洗涤菌体沉淀，洗涤完成后，将菌体沉淀悬浮于灭菌PBS缓冲液中，得到第二菌悬液。
在其中一个实施例中，所述菌株从长期在阳光下暴露的健康成年人的皮肤上分离得到。
在其中一个实施例中，所述分离菌株的具体步骤为：采用SCF-1缓冲液润湿棉签头，将棉签头压在人体额头皮肤表面，反复擦拭30次以上；将完成采集的棉签头置于2mLEP管密封；往2mLEP管中加入无菌磷酸盐缓冲液，充分振荡后，得到第一菌悬液。
在其中一个实施例中，所述SCF-1缓冲液包括50mM Tris buffer、1 mM EDTA、0.5％Tween-20，且所述Tris buffer的pH为7.6，所述EDTA 的pH为8.0。
在其中一个实施例中，所述第一培养基包括蛋白胨营养琼脂培养基、酵母浸出粉琼脂培养基、脑心浸出液琼脂培养基、蔗糖培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述第二培养基为营养琼脂培养基。
在其中一个实施例中，所述恒温过夜培养的温度为25℃-30℃。
在其中一个实施例中，所述第三培养基为营养肉汤。
在其中一个实施例中，所述恒温气浴的温度为25℃-30℃。
在其中一个实施例中，所述离心的条件为：转速为5000r/min，时间为5min
在其中一个实施例中，所述第二菌悬液的菌体浓度为1×106 CFU/mL～1×108CFU/mL。
在其中一个实施例中，所述进行16S全长测序鉴定所属菌种的具体步骤为：对多次纯化培养后的菌株进行革兰氏染色，后通过镜检确定其纯度，采用质量百分比浓度为15％的甘油将菌株保存在-80℃，通过引物 17F/1429R对16S rDNA序列进行扩增测序，与数据库中的序列进行同源比对，得到与Pantoea eucrina strain LMG 2781的序列同源性达99.7％，并将其编号为KBFS1720。通过革兰氏染色镜检观察到，菌体呈短杆状，革兰氏染色呈红色，如图2所示。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
分离菌株：选择海拔3750米的四川省甘孜州稻城县地区且长期进行户外活动，皮肤经常暴露在阳光下的健康成年人，用SCF-1缓冲液润湿棉签头，再将棉签头压在额头皮肤处，反复擦拭30次以上；将棉签头置入2 mLEP管密封，再用无菌磷酸盐缓冲溶液充分振荡，得到第一菌悬液；取 200mL第一菌悬液涂布于蛋白胨营养琼脂培养基、酵母浸出粉琼脂培养基、脑心浸出液琼脂培养基、蔗糖培养基以及胰蛋白胨大豆琼脂培养基中；从各培养基中选取单菌落420株，进行多次纯化培养；筛选6株皮肤中富集的细菌保存在甘油中；
获得第二菌悬液：将保存在甘油中菌株以及第一菌悬液划线接种于营养琼脂培养基中进行活化，于28℃恒温过夜培养；选取单菌落接种于50mL营养肉汤中，于28℃恒温气浴，振荡过夜培养后，在转速为 5000r/min的转速下离心5min，收集菌体沉淀；使用等量灭菌PBS缓冲液洗涤菌体沉淀三次，然后将菌体沉淀重悬于灭菌PBS缓冲液中，得到第二菌悬液；通过平板活菌计数检测，得知第二菌悬液浓度处于1× 106CFU/mL～1×108CFU/mL；第一菌悬液不经稀释，直接使用培养所得第一菌悬液进行菌株定植，且每次菌株定植要重新活化并振荡过夜培养。
实施例2：
16S全长测序鉴定所属菌种：将多次纯化培养的菌株进行革兰氏染色，并通过镜检确定其纯度，然后用质量百分比为15％的甘油将菌种保存在-80℃的条件下。结果显示，本发明所述菌株，由NA培养基分离所得，用通用引物17F/1429R对16S rDNA序列进行扩增测序，与数据库中的序列进行同源比对，得到与Pantoea eucrina strain LMG 2781的序列同源性达99.7％，并将其编号为KBFS1720，即得到本发明所述具有皮肤紫外灼伤修复功能的皮肤源细菌KBFS1720；通过培养直接观察细菌外观形态，菌落表现为润湿，表面粘稠、光滑易被挑取，边缘整齐完整，有透光度且有光泽的圆形，菌落外围隆起，中间凹陷；正反面以及菌落边缘与中央颜色均为乳黄色，如图1所示。通过革兰氏染色镜检观察到，菌体呈短杆状，革兰氏染色呈红色，如图2所示。
实施例3：
菌株生长特性：
取实施例1中获得的第二菌悬液，以无菌操作挑取一环菌液划线培养至有单菌斑出现，无菌挑取一环菌斑，接入液体培养液中以150r/min,28℃培养18h后，分别取1000μL的种子液到事先配好的盛有30mL的NB液体培养基的离心管中，以相同条件培养，按时取出离心管并取200μL均匀培养液在酶标仪上测定OD600实验设三个平行，结果求平均值，结果如图3所示。
实施例4：
菌株全基因组序列测定：
提取实施例1中第二菌悬液中菌株基因组DNA，进行全基因组序列测定。结果显示：如图4所示。
全基因组序列长度为4,053,112bp，含3781个独立编码区(CDSs)包含1条环状染色体，4个质粒。其中染色体基因组为环状，鸟嘌呤(G) 和胸腺嘧啶(C)之和的平均含量为55.91％，长度为3 365 778bp，含有 3100个CDSs，平均长度为1086bp；质粒1(图5中的图A)序列长度为 388 872bp，含有361个CDSs；质粒2(图5中的图B)序列长度为160 430bp，包含110个CDSs；质粒3(图5中的图C)序列长度为91 185 bp，包含103个CDSs；质粒4(图5中的图D)序列长度为100 847bp，包含107个CDSs。编码区总长度为3 532 818bp，占全基因组序列的 87.2％。所有的3 781个CDSs中，有2957个基因能够归类至直系同源(Cluster ofOrthologous Group，COG)功能分类数据库中，其中有2 549 个基因分布在染色体上，质粒1-4上各分布着273、81、9、45个基因。其中参与碳水化合物代谢的有304个，氨基酸代谢的有390个，有关信号转到机制的有117，无机离子的转运和代谢的有235个，258个基因功能未知，有824个编码基因与COG数据库中的基因无任何匹配。
实施例5：
构建亚急性光损伤模型小鼠，具体流程如图6所示；用筛选的所述6 株皮肤中富集的细菌分别处理模型小鼠，如图7所示；不同损伤程度的小鼠皮肤H&E染色切片如图8所示。
试验结果与数据分析：试验结束后，颈椎脱臼处死小鼠取其背部皮肤，皮肤离体后及时浸入质量百分比为4％的甲醛溶液中，于4℃的环境下保存；然后经过石蜡包埋、切片、HE染色，镜检观察，得到如图8所示的小鼠皮肤组织病理学切片代表图。其中，正常组小鼠背部裸露皮肤呈粉红肉色，光滑饱满，未见明显组织病理学损伤(图8中的图A)；轻度皮肤损伤表现为少量炎性细胞浸润(图8中的图B)；中度皮肤损伤表现为较多炎性细胞浸润，充血(图8中的图C)；重度表现为炎性细胞浸润、充血、炎性痂皮形成(图8中的图D)。光学显微镜下观察结果显示，除正常组ICR小鼠背部皮肤外，其余各组ICR小鼠均见有不同程度的组织病理学改变，主要表现为皮肤表面形成炎性细胞性痂皮附着于表皮层上；同时表皮层增厚明显；真皮层纤维组织结构排列紊乱，毛细血管充血及数量不等的炎性细胞浸润；皮下是相对较多的脂肪细胞，其间可见有炎性细胞浸润。根据皮肤表皮损伤程度和炎性细胞浸润的严重程度设立病理组织学损伤评分标准，以1、2、3分来表示轻度、中度和重度损伤，并进行累计评分，结果如下表1所示。
表1：
需要说明的是：试验组A-F中分别表示使用Arthrobacter gandavensis、Bacilluspsychrosaccharolyticus、本发明的皮肤源细菌 KBFS1720、Paenibacillusamylolyticus、Paenibacillus terrae、Psychrobacter psychrophilus菌悬液的处理组。
试验组C与紫外辐照对照组相比，差异有统计学意义(p<0.01)，其他试验组与空白对照组相比无统计学意义(p>0.05)。空白对照组与试验组同正常组相比，差异具有统计学意义(p<0.01)，具体如图9所示。综上，本发明所述菌株在紫外诱导皮肤损伤的修复中发挥着显著积极作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。