阅读说明：本技术 一种绿脓杆菌代谢物及其衍生物、合成方法与应用 (Pseudomonas aeruginosa metabolite and derivative, synthesis method and application thereof ) 是由 雷晓光 张健 杨荣文 赵天湖 于 2018-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种绿脓杆菌代谢物及其衍生物,其结构通式如I所示。本发明提供的绿脓杆菌代谢物及其衍生物具有特定的立体构型,是一种新型的由革兰氏阴性菌绿脓杆菌分泌的金属载体,能够在金属缺失的环境下帮助绿脓杆菌获取金属离子。基于绿脓杆菌代谢物及其衍生物能够帮助绿脓杆菌获取金属离子的特性,绿脓杆菌代谢物及其衍生物与已知抗生素相连可以产生一种新的高铁霉素类抗生素。本发明还涉及一种绿脓杆菌代谢物及其衍生物的合成方法,该方法提供了具有特定立体构型的绿脓杆菌代谢物及其衍生物的全合成路线,这种模块化的合成路线可应用于类似结构化合物及相关衍生物的化学合成,为新型抗生素类药物开辟了广阔发展空间。<Image he="269" wi="700" file="DDA0001704818270000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a Pseudomonas aeruginosa metabolite and a derivative thereof, and the structural general formula is shown as I. The pseudomonas aeruginosa metabolite and the derivative thereof provided by the invention have specific spatial configuration, are novel metal carriers secreted by gram-negative bacteria pseudomonas aeruginosa, and can help the pseudomonas aeruginosa to obtain metal ions in an environment with metal deficiency. Based on the characteristic that the metabolite and the derivative of the pseudomonas aeruginosa can help the pseudomonas aeruginosa to obtain metal ions, the metabolite and the derivative of the pseudomonas aeruginosa can be connected with known antibiotics to generate a novel high-ferritin antibiotic. The invention also relates to a synthesis method of the pseudomonas aeruginosa metabolite and the derivative thereof, and the method provides a complete synthesis route of the pseudomonas aeruginosa metabolite and the derivative thereof with specific spatial configuration, and the modularized synthesis route can be applied to the chemical synthesis of compounds with similar structures and related derivatives, thereby opening up a wide development space for novel antibiotic drugs.)

一种绿脓杆菌代谢物及其衍生物、合成方法与应用

技术领域

本发明涉及创新药物研发领域，具体涉及一种具有特定立体构型的绿脓杆菌代谢物及其衍生物，还涉及所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物的化学合成方法及其在制备药物中的应用。

背景技术

当今社会，随着抗生素越来越普遍的使用，抗生素耐药性的问题已经成为影响全球性健康的主要因素之一，临床上可供选择的抗生素也在日益减少。与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌具有外膜的保护更加容易产生耐药性，治疗更加困难。外膜是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构，能够阻止许多高活性的抗革兰氏阳性菌药物进入细胞内发挥抗菌活性。现在以”特洛伊木马”的研究策略来解决革兰氏外膜造成的耐药性的问题是一种比较切实可行的方法。“特洛伊木马”的研究策略是指将细菌分泌的金属载体与抗生素相连合成高铁霉素类的抗生素，高铁霉素抗生素由于具有金属载体可以通过细菌的主动运输穿透革兰氏阴性菌的外膜。因此发现和利用细菌自身分泌的金属载体成为克服革兰氏阴性菌耐药的研究热点。

Ghssein等人于2016年在Science上报道了一种新的由金黄色葡萄球菌分泌的多功能金属络合剂 stapHylopine，该化合物在细菌摄取金属离子时能够与胞外的多种金属离子络合，并且被细菌的溶质结合蛋白识别，从而使胞外的金属离子进入细菌。次年，由绿脓杆菌分泌的多功能金属络合剂 pseudopaline被报道，通过对革兰氏阴性菌-铜绿假单胞杆菌进行转录组学研究，研究者们发现了 pseudopaline的生物合成途径，并且提出了pseudopaline的结构。遗憾的是在他们提出的结构中，谷氨酸的立体构型没有确认，而且另外两个立体中心也仅是通过生物学同位素喂养实验确定的，没有任何化学的核磁或者单晶表征证实pseudopaline的立体结构，尤其是谷氨酸片段的立体中心。因此，开发一条pseudopaline的不对称合成路线并且确定其三个手性中心的立体化学，对pseudopaline生物学的研究以及后继的创新性抗生素药物开发具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种绿脓杆菌代谢物及其衍生物，所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物具有特定立体构型。本发明提供的绿脓杆菌代谢物与已知抗生素相连可以得到高铁霉素类抗生素，具有广阔的应用前景。

具体而言，本发明提供的绿脓杆菌代谢物及其衍生物含有如通式I所示的结构：

本发明所述各化学式中，(S)或(R)代表相应位置手性碳的立体构型为S或R。

所述通式I中，R₁、R₂、R₃彼此独立的代表-H或-(CH₂)m-NH₂；其中，m代表1～10的整数；X代表C 或者N，优选为C。

所述-(CH₂)m-NH₂-基团可以是直连结构，也可以是带有支链的结构。该结构与含有活性酯基的抗生素反应，形成酰胺键(CH₂)m-NHCO，将所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物与抗生素进行偶联。

作为本发明的一种优选方案，所述通式I中，所述R₁、R₂、R₃中任意两个基团各自独立地代表- (CH₂)m-NH₂，其余一个基团代表H。

作为本发明的一种优选方案，所述通式I中，所述R₁、R₂、R₃中任意一个基团代表-(CH₂)m-NH₂，其余两个基团均代表H；更优选地，所述X为C，且R₁代表-(CH₂)m-NH₂，其余两个基团均代表H。

作为本发明的一种优选方案，所述通式I中，所述R₁、R₂、R₃均代表H；更优选地，所述X为C，且 R₁、R₂、R₃均代表H。

所述-(CH₂)m-NH₂-基团中，m进一步优选代表1～5的整数。

作为本发明的具体优选方案，所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物选自如下结构的化合物：

其中，I-1表示的化合物即为本发明所述的绿脓杆菌代谢物pseudopaline，其中三个手性碳的立体构型分别为S、S、S，在本发明中均采用pseudopaline表示该特定构型的特定化合物。

本发明的第二目的是提供所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物的合成方法。

具体而言，所述通式I中，当R₁、R₂、R₃均代表H时，所述合成方法为：

所述通式I中，当R₁代表-(CH₂)m-NH₂，其中m代表1～10的整数，且R₂、R₃均代表H时，所述合成方法为：

所述通式I中，当R₂代表-(CH₂)m-NH₂，其中m代表1～10的整数，且R₁、R₃均代表H时，所述合成方法为：

所述通式I中，R₃代表-(CH₂)m-NH₂，其中m代表1～10的整数，且R₁、R₂均代表H时，所述合成方法为：

作为本发明的具体实施方案：

本发明所述化合物I-1，即pseudopaline可采用包括以下具体步骤的方法进行合成：

(1)将化合物12溶解在二氯甲烷中，氩气保护，冰水浴下加入依次加入咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷，然后室温反应12小时，冰水浴冷却加水淬灭反应，有机相水洗，旋蒸，过柱得到化合物 13；

(2)将所述化合物13溶于二氯甲烷，加入2，6-二甲基吡啶，冰水浴冷却加入三氟甲磺酸三甲基硅酯，室温反应1.5小时，冰水浴冷却，加入甲醇，室温搅拌3小时，然后旋蒸得到粗品，加乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠调至pH大于9，加入邻硝基苯磺酰氯，室温搅拌过夜，有机相水洗，干燥，浓缩，过柱得到化合物10；

(3)将所述化合物10在冰水浴下加入到溶解有三(二亚苄基丙酮)二钯和(1R,2R)-(-)-N,N'-双 (2-二苯基膦基-1-萘酰基)-1,2-环己二胺配体的四氢呋喃溶液中，加入化合物11，冰水浴下搅拌5小时，加入氢氟酸吡啶溶液，室温反应过夜。乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，有机相碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩，过柱得到化合物15a；

(4)将所述化合物8a溶于四氢呋喃，在冰水浴下加入到含有偶氮二羧酸乙酯和吡啶二苯基膦的四氢呋喃溶液中，加入化合物15a的四氢呋喃溶液。室温反应2小时，浓缩，粗品乙酸乙酯溶解，2摩尔的盐酸洗涤，有机相干燥，浓缩，过柱得化合物7a；

(5)将所述化合物7a溶于二氧六环和水，加入高碘酸钠和四氧化锇在室温下进行氧化切断反应；反应2小时，加入硫代硫酸钠淬灭，乙酸乙酯稀释，水洗，5％的磷酸二氢钠洗涤，浓缩，干燥，所得产物溶解在丙酮中，冰水浴下与琼斯试剂进行醛基氧化反应，反应2小时，加入异丙醇淬灭，乙酸乙酯稀释，硫代硫酸钠洗涤，纯化后，得化合物16a；

(6)将所述化合物16a溶于二氯甲烷，加入苯甲醚和三氟甲磺酸，水解脱去保护基，粗品溶解在二甲基甲酰胺中加入苯硫酚在碱性条件下脱掉邻硝基苯磺酰基保护基团，得化合物2a，即 pseudopaline；

(7)将所述化合物17a溶解在丙酮和水的混合物溶剂中，加入碳酸氢钠调至pH10左右，慢慢加入氯甲酸苄酯，室温反应可以得到咪唑氯甲酸苄酯保护的化合物。然后将得到的产物溶于二甲基甲酰胺，加入碳酸钾和苄溴室温搅拌得到化合物14a；

(8)所述化合物14a溶于二氯甲烷和三氟乙酸，脱保护得到粗品，粗品溶于乙酸乙酯和水，加入碳酸氢钠和邻硝基苯磺酰氯反应得到化合物8a。

按照上述方法，以含有相应基团的具体化合物为原料，可合成本发明所述化合物I-2，I-3和I-4。

本发明所述衍生物I-2可按照化合物I-1的方法合成，区别仅是将合成砌块8a换成相应的合成砌块8b。合成砌块8b可由以下方法合成：

所述化合物8b的具体步骤如下：

(1)所述化合物17b在碱性条件下氯甲酸苄酯保护咪唑，羧酸苄基保护得到化合物18b；

(2)所述化合物18b与化合物19b进行Sonogashira偶联反应反应得到化合物20b；

(3)所述化合物20b氢化还原得到化合物21b；

(4)所述化合物21b重新氯甲酸苄酯保护得到化合物22b；

(5)所述化合物22b酸性脱保护，邻硝基苯磺酰氯重新保护得到化合物8b；用合成砌块8b按照合成I-1(即化合物2a)的步骤(4)-(6)合成得到化合物2b。

本发明所述衍生物I-3可按照化合物I-1的方法合成，区别仅是将合成砌块8a换成相应的合成砌块8c。合成砌块8c可由以下方法合成：

所述化合物8c的具体步骤如下：

(1)所述化合物17c在碱性条件下氨基用邻硝基苯磺酰氯保护，然后羧基苄基保护得到化合物 18c；

(2)所述化合物18c与化合物19c在铜催化下进行click反应得到化合物8c；用合成砌块8c按照合成I-1(即化合物2a)的步骤(4)-(6)合成得到化合物2c。

本发明所述衍生物I-4可按照化合物I-1的方法合成，区别仅是将合成砌块8a换成相应的合成砌块8d。合成砌块8d可由以下方法合成：

所述化合物8d的合成方法包括以下具体步骤：

(1)所述化合物17d在碱性条件下氯甲酸苄酯保护得到化合物18d；

(2)所述化合物18d与化合物19b进行Sonogashira偶联反应反应得到化合物20d；

(3)所述化合物20d氢化还原得到化合物21d；

(4)所述化合物21d重新氯甲酸苄酯保护得到化合物22d；

(5)所述化合物22d在酸性条件下脱保护，邻硝基苯磺酰氯重新保护得到化合物8d；用合成砌块8d按照合成I-1(即化合物2a)的步骤(4)-(6)合成得到化合物2d。

本发明所述方法提供了具有特定立体构型的pseudopaline及其衍生物的合成路线，这种模块化的合成路线可应用于类似结构化合物及相关衍生物的化学合成，为新型抗生素类药物开辟了广阔的发展空间。

本发明的第三目的是保护所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物在制备高铁霉素类抗生素中的应用。具体而言，可将所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物与含有酯基的抗生素反应形成酰胺键，从而将所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物与抗生素进行偶联。所述绿脓杆菌代谢物及其衍生物可以与已知的抗生素相连产生新的高铁霉素类抗生素，可显著提高与之相连的抗生素对革兰氏阴性菌透过外膜的能力，从而增强这些抗生素对革兰氏阴性菌的抗菌活性。具体而言，本发明提供绿脓杆菌代谢物及其衍生物中的伯胺可以作为连接位点与β-内酰胺抗生素相连。所述β-内酰胺抗生素包括碳青霉烯类抗生素、青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素等；优选为以酰胺键连接β-内酰胺抗生素。

附图说明

图1、图2分别为化合物13的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图3、图4别为化合物10的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图5、图6分别为化合物15a的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图7、图8分别为化合物7a的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图9、图10分别为化合物16a的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图11、图12分别为化合物2a的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图13、图14分别为化合物8的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图15、图16分别为化合物15d的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图17、图18分别为化合物7d的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图19、图20分别为化合物16d的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图21、图22分别为化合物2d的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱谱图；

图23为Pseudopaline对铜绿假单胞杆菌生长的影响示意图；其中，图23A说明在缺金属离子的M9 培养基中Pseudopaline能够促进铜绿假单胞菌的生长而(R,S,S)-pseudopaline不能促进铜绿假单胞菌的生长；图23B说明在缺金属离子的M9培养基中Pseudopaline对铜绿假单胞菌的促生长作用有浓度依赖性；图23C说明在添加10微摩尔硫酸锌和50微摩尔EDTA的VBMM培养基中，Pseudopaline能够帮助铜绿假单胞杆菌转运锌离子；图23D说明在VBMM培养基中，锌离子和Pseudopaline能够抑制Pseudopaline合成子的表达。

图24为Pseudopaline在缺金属离子的环境下对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生长的影响示意图；

图25为Pseudopaline在不缺金属离的环境下对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生长的影响示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例：绿脓杆菌代谢物及其衍生物的合成

按照以下步骤合成pseudopaline：

化合物13的合成：

将化合物12(7.8g，25.2mmol，1eq)溶解于DCM(100mL)中，0℃下加入咪唑(2.58g，37.8mmol，1.5eq)和叔丁基二甲基氯硅烷(4.76g，31.6mmol，1.25eq)。将混合物在室温下搅拌 1小时，然后在0℃下加水(50ml)淬灭，用二氯甲烷(100ml×3)萃取水相。将有机相干燥并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20：1)进一步纯化，得到所需产物13(91g，23.4 mmol，93％)无色油。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.43–7.28(m,5H),5.76(d,J＝7.5Hz, 1H),5.16(dd,J＝40.0,12.4Hz,2H),4.42(dd,J＝11.6,7.0Hz,1H),3.76–3.57(m,2H),2.11–1.98(m, 1H),1.94(dd,J＝12.9,7.4Hz,1H),1.42(s,9H),0.88(s,9H),0.02(d,J＝1.5Hz,6H).¹³C NMR(101 MHz,CDCl₃)δ172.39,155.56,135.66,128.52,128.26,128.20,79.45,66.82,60.18,52.57,33.67,28.33, 25.85,25.69,18.12,-5.63,-5.67；IR(neat)νmax 2916,1723,1496,1460,1378,1159,836,730cm-1； HRMS(ESI):[M+H]+计算值C₂₂H₃₈NO₅Si 424.2514，实测值424.2528。[α]¹⁹D-25.4(c＝1,氯仿)；Rf ＝0.80(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)。以上氢谱和碳谱结果详见图1、图2所示。

化合物10的合成：

在0℃下，在含有2,6-二甲基吡啶(15mL，130mmol，10eq)和化合物13(5.23mL，13mmol，1.0eq)的二氯甲烷(200mL)溶液中加入三甲基甲硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)(18.8mL，104mmol，8.0eq)。室温搅拌1.5h后，将反应液冷却至0℃，加入甲醇(20mL)，室温下继续搅拌3h。将反应混合物真空浓缩，得到无色油，不经进一步纯化就立即用于下一步反应。将邻硝基苯磺酰氯(3.17g，1.5mmol)加入到粗胺的乙酸乙酯溶液中，将含有碳酸氢钠溶液(5.46g，65mmol，5.0eq)的100mL水溶液加入到混合物中。8h后，用乙酸乙酯(100ml)稀释混合物，有机相水洗，旋蒸,浓缩得到粗产物，通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝30:1)纯化，得到化合物10(4.95g，75％)无色油。¹H NMR(400MHz,Chloroform–d)δ7.98(d,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.62–7.57(m,2H),7.32–7.30(m,3H),7.22–7.13(m,2H),6.48(d,J＝8.8Hz, 1H),4.91(q,J＝12.0Hz,2H),4.47–4.42(m,1H),3.79–3.67(m,2H),2.14–1.99(m,2H),0.89(s,9H), 0.06(s,6H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.88,147.50,134.89,134.39,133.28,132.61,130.26, 128.52,128.44,128.16,125.43,67.11,59.05,54.66,35.19,25.88,18.31,–5.56.IR(neat)νmax 3329,2957, 2857,1745,1542,1368,1172,1122,837cm–1；HRMS(ESI):[M+H]+计算值C₂₃H₃₂N₂O₇SSi: 509.1772,实测值:509.1768；[α]²⁴ _D–110(c 1,氯仿)。以上氢谱和碳谱结果详见图3、图4所示。

化合物15a的合成：

在0℃下，三(二亚苄基丙酮)二钯(63mg,0.061mmol,0.05eq)和配体(1R,2R)-(-)-N,N'-双(2-二苯基膦基-1-萘酰基)-1,2-环己二胺配体(144mg,0.16mmol,0.15eq)在氩气下溶于四氢呋喃(2 mL)，加入化合物10(620mg,1.22mmol,1eq)的四氢呋喃溶液(3mL)和化合物11，0℃搅拌 5小时，加入氢氟酸吡啶溶液(0.67mL,4.88mmol,4eq)，室温搅拌过夜，乙酸乙酯稀释(20 ml)，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭(20mL)，水相乙酸乙酯萃取(20mL x 2)，有机相合并，干燥，浓缩，过柱(石油醚：乙酸乙酯＝6：1到4：1)得化合物15a(553mg，产率94％)，油状物。¹H NMR(400MHz,Chloroform–d)δ8.04(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),7.59–7.55(m,1H),7.48(t,J＝ 7.4Hz,2H),7.34–7.28(m,3H),7.24–7.18(m,2H),5.96(dq,J＝8.0,4.0Hz,1H),5.52(dq,J＝8.0,4.0 Hz,1H),5.05(q,J＝12Hz,1H),4.82(dd,J＝9.2,5.2Hz,1H),4.64–4.58(m,1H),3.85–3.75(m,2H), 2.67–2.58(m,1H),2.54–2.44(m,1H),2.36(brs,1H),2.33–2.27(m,1H),2.25–2.23(m,1H),2.20–2.15 (m,1H),2.13–2.06(m,1H),1.99–1.95(m,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ171.27,148.12,136.45, 134.82,134.41,133.30,131.24,128.96,128.49,128.39,123.77,67.48,66.37,58.30,57.57,34.02,31.57,29.75；IR(neat)νmax 3557,2949,1737,1543,1372,1160,1061cm–1；HRMS(ESI):[M+NH4]+计算值C₂₂H₂₈N₃O₇S:478.1642,实测值:478.1636；[α]²⁴ _D 1.5(c 1,氯仿)。以上氢谱和碳谱结果详见图5、图6所示。

化合物7a的合成：

在0℃下，将吡啶二苯基膦(264mg，1.01mmol，1.5eq)溶解于THF(10mL)中，加入偶氮二羧酸二乙酯(158uL，1.01mmol，1.5eq)。将混合物搅拌10分钟，然后加入化合物8(265mg, 0.47mmol,0.7eq)，搅拌10分钟，加入15a(310mg，0.67mmol，1eq)的四氢呋喃溶液(2mL)。 2h后，旋蒸，浓缩得粗产物，乙酸乙酯稀释，2N盐酸(5×10ml)，饱和食盐水洗涤。有机相旋蒸，浓缩，残留物通过硅胶柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝7：1)进一步纯化，以得到所需产品 (410mg，0.407mmol，85％)，无色油；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.06–7.99(m,1H),7.97(d,J ＝0.9Hz,1H),7.87(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),7.62–7.54(m,1H),7.53–7.26(m,18H),7.22–7.12(m, 2H),5.96(dd,J＝5.5,2.1Hz,1H),5.55(dd,J＝5.5,2.1Hz,1H),5.38(s,2H),5.16–4.86(m,5H),4.68 (d,J＝6.8Hz,1H),4.36(t,J＝6.5Hz,1H),3.79–3.58(m,1H),3.53–3.39(m,1H),3.34(dd,J＝15.6, 5.1Hz,1H),3.12(dd,J＝15.6,9.6Hz,1H),2.58(dd,J＝13.0,5.8Hz,2H),2.31–2.16(m,3H),2.00– 1.90(m,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.67,169.86,148.45,148.40,147.95,138.87,136.79, 136.67,134.96,134.84,134.43,134.12,133.45,133.32,132.22,131.45,131.37,131.19,130.95,129.39,129.10,128.84,128.81,128.62,128.55,128.52,128.50,128.39,123.90,123.71,114.99,77.38,77.06, 76.74,69.76,67.71,67.51,66.25,60.28,57.79,45.30,33.60,31.56,29.56,29.24.IR(neat)νmax 2955, 1739,1542,1213,1162,970,730,580cm–1；HRMS(ESI):[M+H]+计算值C₄₉H₄₇N₆O₁₄S₂:1007.2586, 实测值:1007.2585；[α]¹⁹ _D+3.70(c＝1,氯仿)。以上氢谱和碳谱结果详见图7、图8所示。

化合物16a的合成：

室温下，将化合物7a(190mg，0.189mmol，1eq)溶解在二氧六环(4mL)和水(2mL)中，加入2,6-二甲基吡啶(87uL，0.756mmol，4eq)，四氧化锇(3.8mL，0.038mmol，0.2eq) 和高碘酸钠(404mg,1.89mmol,10eq)。室温搅拌2小时，加入硫代硫酸钠溶液(6mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(8mL×3)，合并有机相用硫代硫酸钠溶液洗涤(10mL×2)、5％的磷酸二氢钠溶液(10mL×2)，饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，滤液浓缩，得粗产品。粗产品溶于丙酮，冷却至 0℃，加入琼斯试剂(210uL，0.416mmol，2.2eq)，室温搅拌2h，加入异丙醇(1ml)淬灭，反应液乙酸乙酯稀释(20ml)，硫代硫酸钠溶液(10mL×2)，饱和食盐水洗涤(10ml)，硫酸钠干燥，滤液真空浓缩。用凝胶柱层析纯化残留物，得到白色固体的纯产物16a(107mg，0.100mmol，53％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.35(br,2H),8.42(s,1H),7.97(d,J＝7.2Hz,1H),7.86(d,J＝ 7.2Hz,1H),7.65–7.01(m,23H),5.47–5.28(m,2H),5.13–4.63(m,6H),4.47(s,1H),3.89–3.65(m, 1H),3.43(dd,J＝36.5,8.4Hz,2H),3.14(dd,J＝16.0,9.6Hz,1H),2.67–2.25(m,4H),2.13(s,1H), 1.93(d,J＝6.1Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ176.96,172.99,170.87,169.12,147.88,147.77, 147.26,136.69,135.43,134.52,134.43,133.83,133.40,132.70,131.89,131.82,131.75,131.62,131.14, 129.23,128.95,128.92,128.80,128.59,128.54,123.94,123.82,116.18,77.42,77.30,77.10,76.78,70.92, 68.12,67.86,60.05,58.24,56.80,45.22,31.30,28.05,16.26；IR(neat)ν_max3148,2961,1739,1544,1372, 1165,753,591cm^–1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₄₉H₄₇N₆O₁₈S₂:1071.2384,实测值: 1071.2585；[α]¹⁹ _D+76.26(c 1,氯仿)；以上氢谱和碳谱结果详见图9、图10所示。

化合物2a的合成：

化合物16a(92mg,0.086mmol,1eq)溶解在二氯甲烷(15mL)中，加入苯甲醚(76ul，0.945mmol，11eq)降温至0℃，加入三氟甲磺酸(76ul，0.859mmol，10eq)。反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后升至室温，搅拌2h，降温至0℃，加入碳酸氢钠(109mg，1.29mmol，15eq)的水溶液(10mL)，再搅拌0.5小时，用二氯甲烷(10mL×3)洗涤。水相浓缩，得粗产物。将粗混合物和碳酸钾(95mg，0.687mmol)溶解在干燥的二甲基甲酰胺(9mL)中，加入苯硫酚(176ul，1.718mmol，20eq)，室温下搅拌10小时，然后加入水(10mL)，二氯甲烷(10 mL×3)洗涤。然后在真空中浓缩水相，将所得固体用凝胶柱纯化，得到2a(23.6mg，0.042 mmol，68％)白色固体。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.72(d,J＝0.9Hz,1H),6.92(s,1H),3.61(t,J＝ 6.3Hz,1H),3.32–3.19(m,2H),3.10(dt,J＝11.2,5.4Hz,1H),3.03(d,J＝6.4Hz,2H),2.90(ddd,J＝ 12.4,8.9,5.8Hz,1H),2.20(t,J＝7.9Hz,2H),2.03–1.78(m,4H)；¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ181.79, 176.93,176.13,175.46,135.60,131.29,117.41,62.89,62.79,62.15,45.65,33.83,28.59,28.36,28.12；IR； 3359 1570 1395 1103 995 831cm-1；IR(neat)ν_max 2923,1737,1543,1372,1259,1017cm^–1；HRMS(ESI): [M-H]^-计算值C₁₅H₂₁N₄O₈:385.1365,实测值:385.1372；[α]¹⁹ _D+5.873(c＝1,水)；m.p.>330℃。以上氢谱和碳谱结果详见图11、图12所示。

化合物8的合成：

化合物14(21.2g,44.2mmol,1eq)溶于二氯甲烷(120mL))，降温至0℃加入三氟乙酸 (30mL)，升至室温搅拌1小时，旋蒸得粗产物，该粗产物溶于乙酸乙酯(100mL)，加入邻硝基苯磺酰氯(9.9g,44.6mmol,1.01eq)和饱和碳酸氢钠溶液(200mL)。反应混合物室温搅拌过夜，有机相用饱和碳酸氢钠(100mL x 2)，饱和食盐水洗涤(100mL x 1)，硫酸钠干燥，浓缩得粗产品，粗产品用二氯甲烷和正己烷重结晶得纯产品(20.1g，产率87％)¹H NMR(400MHz, Chloroform–d)δ8.00–7.96(m,2H),7.75–7.66(m,1H),7.60–7.52(m,2H),7.46–7.38(m,5H),7.25 –7.19(m,2H),7.12–7.09(m,3H),7.05(s,1H),5.38(s,2H),4.87(dd,J＝44,12Hz,2H),4.64(m,1H), 3.12–3.09(m,2H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.13,148.17,147.41,138.06,137.01,134.89, 133.89,133.11,132.62,130.25,129.29,128.92,128.86,128.43,128.30,125.33,114.86,69.92,67.24, 56.18,31.04；IR(neat)νmax1683,1515,1387,1362,1319,1148,928cm–1；HRMS(ESI):[M+H]+计算值C27H25N4O8S:565.1388,实测值:565.1381；[α]²⁴ _D–88.6(c 0.5,氯仿)；m.p.＝130℃。以上氢谱和碳谱结果详见图13、图14所示。

本实施例还合成了(R，S，S)-pseudopaline,具体步骤和反应条件与上述的pseudopaline合成步骤和条件相同，区别仅在于将合成化合物15a的(1R,2R)-(-)-N,N'-双(2-二苯基膦基-1-萘酰基)-1,2- 环己二胺配体替换为(1S,2S)-(-)-N,N'-双(2-二苯基膦基-1-萘酰基)-1,2-环己二胺配体。以下为各步骤的反应历程及相关产物表征信息：

化合物15d的合成：

在0℃下，三(二亚苄基丙酮)二钯(63mg，0.061mmol,0.05eq)和(1S,2S)-(-)-N,N'-双(2-二苯基膦基-1-萘酰基)-1,2-环己二胺配体(144mg，0.16mmol,0.15eq)在氩气下溶于四氢呋喃(2mL)，加入化合物10(620mg,1.22mmol,1eq)的四氢呋喃溶液(3mL)和化合物11，0℃搅拌5小时，加入氢氟酸吡啶溶液(0.67mL,4.88mmol,4eq)，室温搅拌过夜，乙酸乙酯稀释(20ml)，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭(20mL)，水相乙酸乙酯萃取(20mL x 2)，有机相合并，干燥，浓缩，过柱(石油醚：乙酸乙酯＝6：1到4：1)得化合物15d(553mg，产率87％)，油状物。¹H NMR (400MHz,Chloroform–d)δ8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.58–7.53(m,1H),7.48(d,J＝8.2Hz,2H),7.33(m, 3H),7.25–7.23(m,2H),5.99(dd,J＝5.6,2.4Hz,1H),5.56(dd,J＝5.6,2.4Hz,1H),5.13–4.97(m,3H), 4.50(t,J＝6.8Hz,1H),3.80–3.72(m,2H),2.54–2.48(m,2H),2.32–2.27(m,2H),2.00–1.97(m,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ171.34,148.35,137.54,134.73,133.68,133.39,131.37,130.69,128.60, 128.57,128.50,128.45,123.94,67.68,65.46,59.24,55.60,34.43,31.13,29.54；IR(neat)νmax 3559, 2961,2924,1738,1542,1373,1256,1158cm–1；HRMS(ESI):[M+NH4]+计算值C₂₂H₂₈N₃O₇S:478.1642,实测值:478.1648；[α]²² _D–31.7(c 1,氯仿)；以上氢谱和碳谱结果详见图15、图16所示。

化合物7d的合成：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.06–7.99(m,1H),7.97(d,J＝0.9Hz,1H),7.87(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H), 7.62–7.54(m,1H),7.53–7.26(m,18H),7.22–7.12(m,2H),5.96(dd,J＝5.5,2.1Hz,1H),5.55(dd,J ＝5.5,2.1Hz,1H),5.38(s,2H),5.16–5.03(m,3H),4.97–4.90(m,3H),4.10(d,J＝8.0Hz,1H),3.79– 3.58(m,1H),3.44–3.37(m,1H),3.34(dd,J＝15.6,5.1Hz,1H),3.12(dd,J＝15.6,9.6Hz,1H),2.52– 2.38(m,2H),2.31–2.16(m,3H),2.00–1.90(m,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.74,169.82, 148.43,148.32,147.84,138.89,138.06,136.66,134.82,134.78,134.03,133.77,133.39,133.36,132.07, 131.62,131.26,131.01,130.71,129.02,128.76,128.75,128.54,128.51,128.43,128.41,128.36,128.32, 128.23,123.98,123.65,114.85,69.69,67.71,67.33,65.28,60.22,55.85,45.10,33.69,31.19,29.36,28.63； IR(neat)ν_max 2958,1742,1543,1405,1372,1244,1163cm^–1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值 C₄₉H₄₇N₆O₁₄S₂:1007.2586,实测值:1007.2587；[α]¹⁹ _D–23.7(c＝1,氯仿)；Rf＝0.29(石油醚/乙酸乙酯＝ 1/1)；以上氢谱和碳谱结果详见图17、图18所示。

化合物16d的合成：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.42(s,2H contain COOH),7.97(d,J＝7.2Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz, 1H),7.65–7.01(m,23H),5.38(s,2H),5.18–5.08(m,2H),4.94(s,2H),4.89(t,J＝6Hz),4.47(m,1H), 4.27(m,1H),3.65–3.51(m,2H),3.44(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),3.11(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),2.67– 2.62(m,1H),2.51–2.40(m,2H),2.35–2.28(m,2H),2.13(m,1H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ 176.74,172.62,170.01,169.60,148.70,147.80,147.49,137.04,136.51,134.79,134.69,134.02,133.57, 133.50,132.65,132.24,131.72,131.16,130.92,129.35,128.95,128.89,128.79,128.68,128.64,128.61,128.58,128.56,128.52,128.48,128.44,128.38,128.31,127.66,127.00,123.84,123.77,115.83,70.62, 69.72,68.05,67.59,60.53,59.42,57.76,32.27,30.42,28.28,25.64；IR(neat)ν_max 2923,1737,1543, 1372,1259,1017cm^–1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₄₉H₄₇N₆O₁₈S₂:1071.2383,实测值:1071.2396； [α]²¹ _D–2.5(c 0.8,氯仿)；.m.p.＝89-91℃；以上氢谱和碳谱结果详见图19、图20所示。

化合物2d的合成：

¹H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ7.70(s,1H),6.96(s,1H),3.68(t,J＝7.2Hz,1H),3.43(t,J＝ 7.2Hz,1H),3.32(t,J＝7.2Hz,1H),3.07(m,2H),2.99(m,2H),2.25(t,J＝7.2Hz,2H),2.00(m,,2H), 1.89(q,J＝7.2Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ181.77,175.73,174.87,174.77,135.89,131.66, 117.08,62.32,61.54,59.88,44.30,33.69,27.69,26.96,26.28；IR(neat)ν_max 3395,1628,1574,1399, 1318,1118,835,758cm^–1；HRMS(ESI):[M+H]+计算值C₁₇H₁₉N₂O₇S:565.1388,实测值:565.1381； [α]²¹ _D+9.5(c 0.9,水)；m.p.＝>330℃；以上氢谱和碳谱结果详见图21、图22所示。

合成衍生物2b，2c和2d的具体步骤和反应条件与合成化合物2a相同，区别仅是将合成砌块 8a分别替换成了8b，8c和8d；化合物8b和8d具有相同的合成步骤和条件，区别仅是8b和8d碘的位置分别在咪唑的2位和4位。8b和8c的合成具体步骤和条件如下：

化合物8b的合成

化合物22b(60mg,0.090mmol,1eq)溶于二氯甲烷(5mL))，降温至0℃加入三氟乙酸(1 mL)，升至室温搅拌1小时，旋蒸得粗产物，该粗产物溶于乙酸乙酯(5mL)，加入邻硝基苯磺酰氯(21mg,0.094mmol,1.01eq)和饱和碳酸氢钠溶液(2mL)。反应混合物室温搅拌过夜，有机相用饱和碳酸氢钠(10mL x 2)，饱和食盐水洗涤(10mL x 1)，硫酸钠干燥，浓缩得粗产品，粗产品硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10：1)得纯产品(22mg，产率78％)¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.01–7.93(m,1H),7.73–7.66(m,1H),7.60–7.48(m,3H),7.41(s,5H),7.38– 7.28(m,5H),7.20(dd,J＝5.1,2.0Hz,3H),7.04(dd,J＝6.8,2.7Hz,2H),6.99(s,1H),5.33(s,2H),5.18 (t,J＝6.0Hz,1H),5.09(s,2H),4.90(d,J＝12.1Hz,1H),4.74(d,J＝12.2Hz,1H),4.62(dt,J＝9.2,4.8 Hz,1H),3.19(q,J＝6.6Hz,2H),3.11–2.85(m,4H),2.05–1.89(m,2H).

化合物8c的合成

化合物18c(38.8mg，0.1mmol，1eq)溶于DMSO中，加入化合物19c(27.3mg，0.11mmol，1.1eq)，硫酸铜(5mg,0.02mmol,0.2eq)和抗坏血酸钠(10mg,0.05mmol,0.5eq)，室温反应过夜，乙酸乙酯稀释，10％食盐水洗涤，干燥浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20：1)得纯的化合物8c(51mg，产率80％)¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.04–7.98(m,1H),7.80–7.75(m,1H),7.67–7.55(m,2H),7.37–7.27(m,4H),7.22–7.15(m,2H),6.59(d,J＝8.5Hz,1H),5.01 –4.87(m,2H),4.58(ddd,J＝8.7,6.0,5.0Hz,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),3.38–3.23(m,2H),3.12(q, J＝6.6Hz,2H),1.88(p,J＝7.1Hz,2H),1.68–1.55(m,2H),1.43(s,9H)。

实验例1

本实验例进一步对上述实施例所得到的化合物绿脓杆菌代谢物及其衍生物的活性进行了检测。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

LB固体培养基(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂糖20g。

LB液体培养基(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g。

M9液体培养基(1L)：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g、KH₂PO₄ 3g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 1g、葡萄糖 4g、MgSO₄ 0.24g、CaCl₂ 0.011g。

M9缺金属培养基(1L)：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g、KH₂PO₄ 3g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 1g、葡萄糖4g。

VBMM培养基(1L)：MgSO₄ 0.04g、柠檬酸2g、KH₂PO₄ 10g、NaNH₄HPO₄·4H₂O 3.5g。

CDM缺金属培养基(1L)：葡萄糖4g、L-半胱氨酸0.48g、L-天冬氨酸2.4g、L-谷氨酸2.4 g、脯氨酸2.4g、精氨酸0.36g、甘氨酸2.4g、组氨酸0.48g、赖氨酸0.6g、丝氨酸2.4g、缬氨酸0.48g、苏氨酸2.4g、丙氨酸2.4g、异亮氨酸0.6g、亮氨酸0.6g、色氨酸0.06g、甲硫氨酸0.18g、酪氨酸0.18g、苯丙氨酸0.2g、Na₂HPO₄ 5.7g、NH₄SO₄ 6.84g、KH₂PO₄ 1.34g、烟酸0.01194g、烟酸硫胺素0.0006g、泛酸钙0.002g、生物素0.0001g。

CDM培养基(1L)：CDM缺金属培养基中加入MgSO₄·7H₂O 0.247g。

1、(S,S,S)-Pseudopaline与其立体化学异构体(R,S,S)-Pseudopaline对铜绿假单胞菌在缺金属环境中生长的影响

具体方法为：将铜绿假单胞菌接种至在LB固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。从平板上挑取单克隆，接种至LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。取1mL过夜菌液，离心后用PBS缓冲液洗涤菌体2次，然后用1mL PBS缓冲液重悬。取1μL重悬后的菌液接种到100μL M9缺金属培养基中，分别加入终浓度为100μM的(S,S,S)-pseudopaline或其立体化学异构体 (R,S,S)-pseudopaline，以不提供任何一种pseudopaline为对照组，加到96孔细胞培养板中，置于TECAN F200PRO酶标仪中37℃、200rpm振荡培养。每隔一小时读取菌液在600nm下的吸光值(OD₆₀₀)，以菌液浊度OD₆₀₀反映细菌生长状况，结果如表1所示。结果显示在缺金属培养基中 (S,S,S)-pseudopaline能够显著促进铜绿假单胞菌的生长，而其异构体(R,S,S)-pseudopaline对铜绿假单胞菌的生长基本没有促进作用，与对照组相差不大，表明(S,S,S)-pseudopaline是具有生物活性的构型。

表1：三组实验结果OD₆₀₀的百分值

2、Pseudopaline对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌在缺金属环境中生长的影响

具体方法与上述基本相同。取1μL重悬后的大肠杆菌菌液接种到100μL M9缺金属培养基中，1μL重悬后的鲍曼不动杆菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液接种到100μL CDM缺金属培养基中，分别加入终浓度为100μM的pseudopaline，以不提供任何pseudopaline为对照组，检测方法同上。结果显示在缺金属培养基中pseudopaline同样能够显著促进大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。

3、Pseudopaline对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌在富金属离子环境中生长的影响

与第1项研究相比，区别仅是将重悬后的菌液接种到不缺金属离子的VBMM或者LB培养基。结果显示在富含金属离子的培养基中，pseudopaline对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的生长没有影响。表明pseudopaline有可能能够在缺金属离子的环境下协助铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌转运环境中痕量的金属元素。

4、Pseudopaline对铜绿假单胞菌转运锌离子的作用

具体方法为：参考Mastropasuqua发明的技术。取1mL LB中过夜培养的铜绿假单胞菌菌液，离心后用PBS洗涤两次，然后用1mL PBS重悬。取100μL重悬后的菌液接种到10mL含有10 μM ZnSO₄和50μM EDTA的VBMM培养基稀释，实验组加入100μM的pseudopaline，对照组不加pseudopaline。两组在37℃、200rpm振荡培养18小时后，8000rpm离心5min收集菌液。菌体用10mL含有1μM EDTA的PBS缓冲液洗涤2次，10mL的PBS缓冲液洗涤一次。用酶标仪检测菌液OD₆₀₀后，离心弃上清，菌体95℃干燥过夜。干燥后的菌体用5mL的浓硝酸140℃加热消解 3小时，之后冷却至室温加入15mL水稀释。用电感耦合等离子质谱测定锌离子的含量，OD₆₀₀对细胞内的Zn²⁺浓度进行归一化处理。实验结果显示，相比于不加pseudopaline的对照组，加pseudopaline实验组中的铜绿假单胞菌胞内Zn²⁺浓度含量提升了43％，说明pseudopaline的确能够在锌离子缺失的环境下帮助铜绿假单胞菌转运锌离子。

5、Pseudopaline对铜绿假单胞菌中pseudopaline合成操纵子转录水平的影响

具体方法：首先利用引物pPA4837F(5’-GGAATTCGCGCCAGGGTGCGGCTGA-3’)和pPA4837R(5’-CGCAAGCTTGGGAAATCGCACCAGAAAAGAA-3’)扩增了pseudopaline操纵子的启动子区，用EcoRI和HindIII双酶切得到的片段，***到含有GFP报告基因的质粒pPROBE-AT’中，构建重组质粒pPA4837::gfp。^[8]将重组质粒化学转化入铜绿假单胞菌PAO1中，构建菌株PAO1/pPA4837::gfp。取1mL LB中过夜培养的PAO1/pPA4837::gfp菌液，离心后用PBS洗涤两次，然后用1mL PBS重悬。取1μL重悬后的菌液接种到100μL VBMM培养基中，实验组加入终浓度为100μM的pseudopaline，对照组为不加pseudopaline或加入5μM ZnSO₄，加到在96孔细胞培养板中，置于TECAN F200PRO酶标仪中37℃、200rpm振荡培养。每隔一小时读取GFP绿色荧光(485nm激发，535nm发射)和菌液在600nm下的吸光值(OD₆₀₀)，用OD₆₀₀对GFP荧光结果进行归一化，以GFP/OD₆₀₀反应pseudopaline操纵子的转录水平。实验结果显示pseudopaline或者锌离子都能够抑制铜绿假单胞菌中pseudopaline操纵子的转录水平，表明外加pseudopaline能够对其自身的合成起到反馈抑制作用。

本实验例中，Pseudopaline对铜绿假单胞杆菌生长的影响示意图如图23所示。具体而言，图23A说明在缺金属离子的M9培养基中Pseudopaline能够促进铜绿假单胞菌的生长而(R,S,S)- pseudopaline不能促进铜绿假单胞菌的生长；图23B说明在缺金属离子的M9培养基中Pseudopaline 对铜绿假单胞菌的促生长作用有浓度依赖性；图23C说明在添加10微摩尔硫酸锌和50微摩尔 EDTA的VBMM培养基中，Pseudopaline能够帮助铜绿假单胞杆菌转运锌离子；图23D说明在 VBMM培养基中，锌离子和Pseudopaline能够抑制Pseudopaline合成子的表达。

本实验例中，Pseudopaline在缺金属离子的环境下对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生长的影响示意图如图24所示；Pseudopaline在不缺金属离的环境下对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生长的影响示意图如图25所示。

实验例2

1、本实施例测试了Pseudopaline衍生物2b，2c和2d对铜绿铜绿假单胞菌在缺金属环境中生长的影响，测试的具体方法与Pseudopaline一致，只是将Pseudopaline替换为Pseudopaline衍生物2b，2c和2d。实验结果如表2所示。

表2：实验结果OD₆₀₀的百分值

2、本实施例测试了Pseudopaline衍生物2b，2c和2d对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌在缺金属环境中生长的影响，测试的具体方法与Pseudopaline一致，只是将Pseudopaline 替换为Pseudopaline衍生物2b，2c和2d。结果显示在缺金属培养基中Pseudopaline衍生物2b,2c 和2d同样能够显著促进大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，其中2b与 Pseudopaline活性基本一致。

3、本实施例测试了Pseudopaline衍生物2b，2c和2d对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌在富金属离子环境中生长的影响。方法与上述步骤一致。结果显示在富含金属离子的培养基中，pseudopaline衍生物2b，2c和2d对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的生长没有影响。表明pseudopaline衍生物2b，2c和2d可能能够在缺金属离子的环境下协助铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌转运环境中痕量的金属元素。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。