阅读说明：本技术 一个双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539 (Agaricus bisporus ethylene protein receptor Ab143539 ) 是由 邱立友 郜熙阳 高玉千 李亚楠 张君 李涛 张朝辉 田芳 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本申请属于植物基因组技术领域,具体涉及一个双孢蘑菇基因组中的乙烯蛋白受体Ab143539。其结构中共有5个跨膜区,在第3跨膜区含有一个半胱氨酸残基,具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。基于结构对比结果,发明人推测Ab143539为双孢蘑菇中的乙烯受体蛋白(AbEBD2),可以结合乙烯。进一步实际验证后发现,该蛋白具有乙烯结合作用,但其结合能力明显弱于拟南芥乙烯受体ETR1。但基于这一研究结果,通过基因工程技术手段,仍然可为双孢蘑菇新品种培育、或者双孢蘑菇保鲜等技术改进奠定一定技术基础。(The application belongs to the technical field of plant genomes, and particularly relates to an ethylene protein receptor Ab143539 in an agaricus bisporus genome. The structure of the gene has 5 transmembrane regions, the 3 rd transmembrane region contains a cysteine residue, and the specific base sequence is shown as SEQ ID NO. 1. Based on the results of the structural comparison, the inventors speculate that Ab143539 is an ethylene receptor protein in agaricus bisporus (AbEBD 2), and can bind ethylene. Further practical verification shows that the protein has an ethylene binding effect, but the binding capacity of the protein is obviously weaker than that of an Arabidopsis ethylene receptor ETR 1. However, based on the research result, a certain technical basis can still be established for the cultivation of new agaricus bisporus varieties or the improvement of the agaricus bisporus preservation and other technologies through a genetic engineering technical means.)

一个双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539

技术领域

本申请属于植物基因组技术领域，具体涉及一个双孢蘑菇基因组中的乙烯蛋白受体Ab143539。

背景技术

双孢蘑菇是世界上栽培范围最广，产量和消费量最大的食用菌，也是我国出口量最大的食用菌。生理研究表明，双孢蘑菇和高等植物相似，都能够合成产生乙烯，而合成的乙烯又可进一步抑制其菌丝生长和子实体形成，并加快采后子实体成熟衰老。但是由于相关研究仍然较为有限，因此，双孢蘑菇中是否也存在与高等植物类似的乙烯信号转导途径尚不清楚。

已有研究表明，高等植物中，乙烯受体是其乙烯信号转导途径中的重要组成成分，起源于细菌的双组分信号转导系统。细菌的双组分信号转导系统由组氨酸激酶域（histidine kinase，HK）和反应调控域（response regulator protein，RR）组成。双组分信号转导系统可进化为由HK和RR融合而成的杂合组氨酸激酶，真核生物中的双组分信号转导系统绝大多数属于杂合组氨酸激酶。植物乙烯受体是跨膜蛋白，定位在内质网膜上，域结构包括乙烯结合结构域（ethylene binding domain）、GAF结构域、组氨酸激酶结构域（Hiskinase domain）、受体效应调节器（receive domain）。如拟南芥乙烯受体ETR1的乙烯结合结构域有3个疏水跨膜区，GAF结构域可能介导受体蛋白的相互作用，组氨酸激酶域以同源二聚体形式存在。当乙烯与受体结合后，组氨酸激酶活化，组氨酸残基自身磷酸化，可将磷酸基团传递给受体效应调节器的天冬氨酸残基或下游组分CTR1，从而活化了信号传导途径。

就双孢蘑菇基因组研究而言，虽然有部分功能蛋白得到克隆和研究，但对于双胞蘑菇中乙烯代谢途径、乙烯代谢相关基因的研究仍然较为缺乏，而从双孢蘑菇品质控制角度而言，对于乙烯代谢相关蛋白的深入研究显然具有十分重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一个双孢蘑菇乙烯蛋白受体，从而为双孢蘑菇的生长发育调节奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个双孢蘑菇乙烯蛋白受体，其蛋白序列号为143539（简称为Ab143539），共有5个跨膜区，在第3跨膜区含有一个半胱氨酸残基（Cys291），与乙烯结合有关，因此进一步命名为双孢蘑菇乙烯受体蛋白AbEBD2，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539的制备方法，通过PCR扩增方法制备获得，具体步骤如下：

（1）提取双孢蘑菇总RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物序列如下：

Type-R：5’- GGATCCAGTTTAGCACTTTGGGGGGC -3’，

Type-F：5’- GTAGTGCACATATATAAGGAAGAAC -3’；

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增。

所述双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539在植物中应用，该蛋白与乙烯结合，用来调控植物的成熟过程。

一种培育植物新品种方法，利用基因工程技术，将双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539基因转录到植物基因组中，通过与乙烯结合，从而调控植物生长或成熟时机。

已有研究表明，许多真菌也能合成乙烯，因此在真菌基因组中存在有多种杂合组氨酸激酶，而在针对双孢蘑菇基因组研究中，发现双孢蘑菇基因组中存在4个杂合组氨酸激酶，其中Ab143539蛋白具有与植物乙烯受体类似的所有域结构，即包括：5个跨膜区，以及组氨酸激酶结构域和受体效应调节器，但没有GAF域，而在第3跨膜区含有一个半胱氨酸残基（Cys291）；而现有拟南芥的乙烯受体ETR1的第二跨膜区同样也含有一个半胱氨酸残基（Cys65）（该残基是ETR1结合乙烯所必须的氨基酸）。基于这些结构对比结果，发明人推测Ab143539为双孢蘑菇中的乙烯受体蛋白（AbEBD2），可以结合乙烯。进一步实际验证后发现，该蛋白具有乙烯结合作用，但其结合能力明显弱于拟南芥乙烯受体ETR1。但基于这一研究结果，通过基因工程技术手段，仍然可为双孢蘑菇新品种培育、或者双孢蘑菇保鲜等技术改进奠定一定技术基础。

附图说明

图1为双孢蘑菇假拟乙烯受体和拟南芥乙烯受体乙烯结合域和荧光蛋白基因PCR扩增产物，其中，A，双孢蘑菇假拟乙烯受体Ab143539乙烯结合域AbEBD2和荧光蛋白基因EGFP；B，拟南芥乙烯受体乙烯结合域AtEBD1和荧光蛋白基因EGFP；M, Trans5K DNALadder; 1, AbEBD2; 2, EGFP; 3, AbEBD1-EGFP；4, AtEBD1; 5, EGFP; 6, AtEBD1-EGFP；

图2为双孢蘑菇假拟乙烯受体和拟南芥乙烯受体乙烯结合域与荧光蛋白融合表达载体双酶切电泳图；其中：A，pYE-TYPE-EGFP；B，pYE-ETR1-EGFP；M1, 1Kb Plus DNA Ladder; 1，pYE-TYPE-EGFP未酶切; 2, pYE-TYPE-EGFP酶切；M2, DL15000 plus DNA Ladder; 3，pYE-ETR1-EGFP未酶切; 4, pYE-ETR1-EGFP酶切；

图3为表达乙烯结合域与荧光蛋白融合蛋白的酵母菌转化子的荧光显微镜观察（放大倍数10×63）：pYES2/NT/A，含空载质粒细胞；pYE-TYPE-EGFP，表达AbEBD2-EGFP细胞；pYE-ETR1-EGFP，表达AtEBD1-EGFP细胞；

图4 为表达双孢蘑菇和拟南芥乙烯受体乙烯结合域的酵母菌细胞结合的乙烯量；pYES2/NT/A，空载质粒；AbEBD2- EGFP，双孢蘑菇乙烯受体Ab143539乙烯结合域AbEBD2和荧光蛋白基因EGFP的融合蛋白；AtEBD1-EGFP，拟南芥乙烯受体ETR1乙烯结合域AtEBD1和荧光蛋白基因EGFP的融合蛋白；不同大写字母表示差异达到显著水平（P＜0.01）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

双孢蘑菇As2796，来自福建省农科院食用菌研究所；

质粒pEGFP-C1购自Clontech（Mountain View, CA)；

酿酒酵母INVSC1和表达载体pYES2/NT/A购自上海北诺生物科技有限公司（Beinuo，上海，中国）；

培养基：

双孢蘑菇斜面保藏和平板培养培养基为PDA培养基；

酿酒酵母培养基为YPD培养基，配方是酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%；

酵母菌转化子筛选用培养基是SC-URA培养基，配方是酵母氮源基础6.7 g/L、尿嘧啶合成缺陷型培养基2 g/L、葡萄糖20 g/L。

实施例1

需要说明的是，前期针对双孢蘑菇基因组研究中，发现双孢蘑菇基因组中存在若干杂合组氨酸激酶，其中Ab143539蛋白具有与植物乙烯受体类似的所有域结构，即包括：5个跨膜区，以及组氨酸激酶结构域和受体效应调节器，但没有GAF域，而在第3跨膜区含有一个半胱氨酸残基（Cys291）；而现有拟南芥的乙烯受体ETR1的第二跨膜区同样也含有一个半胱氨酸残基（Cys65）（该残基是ETR1结合乙烯所必须的氨基酸）。基于这些结构对比结果，发明人推测Ab143539为双孢蘑菇中的乙烯受体蛋白（AbEBD2），可以结合乙烯。基于这一假设，利用荧光表达技术，发明人就该蛋白进行了克隆和实际功能验证。具体实验验证过程简要介绍如下。

（一）Ab143539基因（AbEBD2）克隆

采用PCR扩增方法，发明人克隆获得了Ab143539基因（AbEBD2）序列，具体过程简要介绍如下。

（1）设计PCR扩增用引物及进行基因组提取

采用RNAiso Plus Total RNA提取试剂盒（Takara，大连，中国），参考其说明书，分别从双孢蘑菇平板菌丝和拟南芥叶片中提取总RNA（拟南芥作为对照）；

利用Thermo Scientific™ Maxima™ First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (#K1641)（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA），进一步合成制备cDNA备用；

设计PCR扩增用引物序列如下：

Type-R：5’- GGATCCAGTTTAGCACTTTGGGGGGC -3’，

Type-F：5’- GTAGTGCACATATATAAGGAAGAAC -3’；

ETR1-R：5’- ATGGAAGTCTGCAATTGTATTG-3’，

ETR1-F：5’- CTCAGCAGCTTTATTTTTCAA-3’；

（2）PCR扩增

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，分别利用引物对组合Type-R和Type-F、引物对组合ETR1-F和ETR1-R，PCR扩增获得Ab143539基因（AbEBD2）和拟南芥乙烯受体ETR1；

PCR过程中，50μL反应体系设计如下：

模板 cDNA，2.0 μl；

2×pfu PCR Master Mix，25 μl；

上游引物（F引物），20 mmol/L、1.0 μl；

下游引物 (R引物)，20 mmol/L、1.0 μl；

ddH₂O，补足总体系至50 μl；

PCR反应条：94℃、5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、5min，30个循环；72℃、10min。对PCR扩增产物进行电泳检测，并测序分析。

需要说明的是，其PCR产物大小分别为507 bp和380 bp。测序分析后，序列比对结果表明，Ab143539（AbEBD2）和AtETR1跨膜区序列一致，因此其功能可能具有类似性。

双孢蘑菇Ab143539（AbEBD2）序列全长507bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

AGTTTAGCACTTTGGGGGGCACTCTGGCTTATAGTCAATTGGGTCGTCGGCGTCGCTCTGCTGGACAAAAATGAAGGTGATACCGAAGGTCCTGACATTGCTTTTTATTATGTGATTGGACCTCTGTTGGCTATCCCAGTGCTATGGATGGTAATCTACGACTGGCCCCGAAATCGACCTGTGTTTTACCAATTATTTTTGCTTTGCGCGATTTGGTCCTGGGGATTCTACATTATTTTGTATCTGAAAATATGCCAATTCTATGGCCCACCGTCAAAATCACCCCCTTTCTGCAGGGGGCGCGATTTTTTGGGGACATTTTTCTATACAACGGCATTGCAAACCATGGGTCTATTCGGGCTGAATCTGAACAGGTTGATGGCGGCCATTGGAGCGCTGTGCTTTTTCGTCATGACCTCGGCTCTCATGATACCGGAGCAACAAAGCTGGGTTAGGAACATGATAAACTTTTTTGTCTTCCACTTCTTCCTTATATATGTGCACTAC。

拟南芥AtETR1序列，具体为：

ATGGAAGTCTGCAATTGTATTGAACCGCAATGGCCAGCGGATGAATTGTTAATGAAATACCAATACATCTCCGATTTCTTCATTGCGATTGCGTATTTTTCGATTCCTCTTGAGTTGATTTACTTTGTGAAGAAATCAGCCGTGTTTCCGTATAGATGGGTACTTGTTCAGTTTGGTGCTTTTATCGTTCTTTGTGGAGCAACTCATCTTATTAACTTATGGACTTTCACTACGCATTCGAGAACCGTGGCGCTTGTGATGACTACCGCGAAGGTGTTAACCGCTGTTGTCTCGTGTGCTACTGCGTTGATGCTTGTTCATATTATTCCTGATCTTTTGAGTGTTAAGACTCGGGAGCTTTTCTTGAAAAATAAAGCTGC。

（3）融合PCR

需要说明的是，为便于后续研究，发明人进一步利用荧光蛋白对待研究目的基因进行了荧光标记，因此，利用融合PCR技术进一步进行了PCR扩增，具体过程为：

首先，设计设计融合PCR扩增用引物序列如下：

EGFP-R：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’，

EGFP-F：5’-GAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’；

Type-OV-EGFP：5’- GCCTGTACACATGGTGAGCAAGGGCG -3’，

ETR1-OV-EGFP：5’-AGCTGCTGAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；

然后，以质粒pEGFP-C1为模板，PCR扩增获得EGFP基因片段；

最后，分别进行融合PCR扩增，具体为：

以步骤（2）中PCR获得的Ab143539（AbEBD2）和上述获得的EGFP基因为模板，利用引物对EGFP-F和Type-OV-EGFP进行融合PCR；

以步骤（2）中PCR获得的AtETR1和上述获得的EGFP基因为模板，利用引物对EGFP-F和ETR1-OV-EGFP进行融合PCR；

PCR扩增体系和反应条件参考步骤（2）即可。

对融合PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示。进一步测序分析表明，相关PCR扩增序列结果与预期结果一致，可以进行后续实验。

（二）构建重组表达载体

利用酵母菌表达载体pYES2/NT/A，发明人将步骤（一）中所获得融合PCR产物与其进行了重组，分别构建获得了重组表达载体pYE-TYPE-EGFP和pYE-ETR1-EGFP，具体过程简要介绍如下。

（1）酶切

将步骤（一）中所获得的融合PCR产物与载体pYES2/NT/A分别进行BamHI、EcoRI双酶切，50μL酶切体系参考设计如下：

融合PCR（或载体pYES2/NT/A），15 μl；

BamHI，1 μl；

EcoRI，1 μl；

Cutsmart，5 μl；

ddH₂O，28 μl；

37℃、酶切45 min。酶切结束后，电泳检测并分别回收。

（2）连接与转化

将步骤（1）中所回收酶切产物进行连接以获得重组表达载体pYE-S-EGFP和pYE-ETR1-EGFP，10μL连接体系设计如下：

pYES2/NT/A酶切产物，2μl；

融合PCR酶切产物，5μl；

T4 ligase，1μl；

5×T4 ligase buffer，2μl；

16℃过夜酶连。

连接完成后，采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法，将连接产物转化酵母菌INVSC1。具体操作参考如下：

（1）挑取INVSC1单菌落于5 ml的液体YPD培养基中，30℃、220rpm，过夜培养至菌液OD₆₀₀=0.6左右备用；

（2）取分装好的carrier DNA，在沸水浴中煮5 min, 放在冰上备用；

（3）取两个1.5 ml的离心管，标明实验组与对照组，向离心管中分装1 ml菌液，4℃、4000 rpm离心5 min；按照以下顺序加入配置好的溶液：

（4）轻轻混匀，将离心管放入42℃、水浴3 h；取出水浴锅中的离心管，4℃、4000rpm离心5 min，弃去上清；

（5）加入120 μl无菌水，用枪吸打混匀；取出实验组中12 μl的菌体转移至一支新的离心管中，加入96 μl的无菌水，混匀，使该管中的菌液体积与原实验组剩余的菌液体积一样；

（6）按照稀释浓度从低到高的顺序涂在SC-URA固体平板上，30℃倒置培养；培养至2-3天后挑取转化子，使用试剂盒提取酵母质粒，以所提取质粒进行双酶切，验证转化子。

该2个表达载体经双酶切均得到二条带，一条来自质粒pYES2/NT/A，另一条来自乙烯结合域与EGFP的融合片段。

部分电泳检测结果如图2所示。可以看出，相关结果与预期是一致的，因此可用于后续实验。

（三）蛋白表达

将步骤（二）中转化构建正确的酵母菌转化子接种至含2%葡萄糖的SC-URA培养基中，30℃、220 rpm培养至OD₆₀₀=0.4。

然后取培养液1 ml，4000 rpm、离心5min，弃去上清；将细胞悬浮于含有2%半乳糖和1%棉子糖的SC-URA培养基中，继续培养24 h。取样用激光共聚焦显微镜观察酵母菌荧光蛋白表达情况。

结果如图3所示。分析可以看出，空载质粒的转化子（参考前述转化操作，仅转化空载质粒pYES2/NT/A的酵母转化子作为空白对照）在紫外光下无荧光，而转化pYE-S-EGFP表达AbEBD1- EGFP的转化子和转化pYE-ETR1-EGFP表达AtEBD1-EGFP的转化子，在紫外光（365nm）下均可观察到荧光。这一结果表明表达乙烯结合域与荧光蛋白融合蛋白在酵母菌转化子中能够正确表达。

（四）乙烯结合情况检测

为检测判定不同乙烯受体蛋白对乙烯结合能力情况，发明人利用气相色谱仪对不同酵母转化子与乙烯结合能力进行了实验检测，具体实验检测过程简介如下。

首先，收集步骤（三）中在含有2%半乳糖和1%棉子糖的SC-URA培养基中培养、有较强荧光的酵母菌体（4℃、5000 rpm离心5 min），将菌体沉淀（菌体收集量约0.7g）转移至小玻璃瓶子中，用封口膜将其密封完好；

然后，对小瓶子进行抽真空操作，抽完真空后，向其注入一定量（注入量为10mL）的乙烯气体，密封后于22℃孵育4 h，孵育过程中轻轻晃动瓶子，使菌体与乙烯气体接触更加充分；

第三，结合完全后，打开盖子，通风5 min，然后将菌体转移至一个新的密封性完好的玻璃瓶中；

第四，将瓶子密封好，对其进行抽真空操作，然后将玻璃瓶置于65℃的金属浴中90min，以将菌体中结合的乙烯释放出来；

最后，抽取玻璃瓶中的气体用气相色谱仪（岛津GC-2010 plus，岛津SHIMADZU，日本）检测乙烯含量。

气相色谱测定过程中，色谱条件为：色谱柱为GDX-502 2 m×3 mm；氢离子火焰检测器(FID)检测，N₂为载气，流量为20mL/ min；燃气为H₂，流量为40 mL/ min，进样温度110℃，柱温60℃，检测器温度150℃。

测定结果如图4所示。结果表明：含有空载质粒的细胞仅能测定到结合的微量乙烯，而表达拟南芥ETR1乙烯结合域AtEBD1的细胞乙烯结合量显著高于表达双孢蘑菇乙烯受体的乙烯结合域的细胞AbEBD1，AbEBD1结合的乙烯量是AtEBD1的42.8%。也即，双孢蘑菇乙烯受体蛋白对于乙烯结合量显然不如高等植物拟南芥中乙烯受体蛋白。分析这种差异，一方面与乙烯受体蛋白结构本身有关，另一方面与转化受体（酵母）表达双孢蘑菇相关蛋白能力可能有直接关系。总体而言，基于本申请相关研究成果，仍可为双孢蘑菇新品种培育、以及双孢蘑菇保鲜等技术发展奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一个双孢蘑菇乙烯蛋白受体Ab143539

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> Agaricus bisporus

<400> 1

agtttagcac tttggggggc actctggctt atagtcaatt gggtcgtcgg cgtcgctctg 60

ctggacaaaa atgaaggtga taccgaaggt cctgacattg ctttttatta tgtgattgga 120

cctctgttgg ctatcccagt gctatggatg gtaatctacg actggccccg aaatcgacct 180

gtgttttacc aattattttt gctttgcgcg atttggtcct ggggattcta cattattttg 240

tatctgaaaa tatgccaatt ctatggccca ccgtcaaaat cacccccttt ctgcaggggg 300

cgcgattttt tggggacatt tttctataca acggcattgc aaaccatggg tctattcggg 360

ctgaatctga acaggttgat ggcggccatt ggagcgctgt gctttttcgt catgacctcg 420

gctctcatga taccggagca acaaagctgg gttaggaaca tgataaactt ttttgtcttc 480

cacttcttcc ttatatatgt gcactac 507