阅读说明：本技术 ***特异性抗原的检测试剂与试剂盒 (Detection reagent and kit for prostate specific antigen ) 是由 邹振 贺丽蓓 杨荣华 齐鹏 杨华 罗梓凌 于 2019-05-10 设计创作，主要内容包括：通过对人血清白蛋白(HSA)与荧光染料分子相互作用的研究,我们发现HSA能够使DNA嵌入性染料ethyl-4-[3,6-bis(1-methyl-4-vinylpyridium iodine)-9H-carbazol-9-yl)]butanoate(EBCB)的荧光显著增强。基于此,本发明公开了一种前列腺特异性抗原(PSA)的检测试剂与试剂盒,包括以下步骤：利用PSA核酸适配体序列和三链DNA的组成原理构建三链分子信标(TMS),并通过Au-S键修饰在金纳米颗粒表面,加入双功能荧光染料EBCB嵌入分子信标得到检测探针。当PSA存在时,荧光快速产生。加入dansylamide(DNSA)后,荧光进一步放大。该发明试剂和试剂盒以内源HSA作为荧光信号放大器,工作范围可调,检出限较低,具有较好的检测效果。此外,该体系对血清中其他生物标志物有较好的选择性,不需要外来工具酶或纳米催化体系,具有成本效益,具有原始创新性和应用前景。(Through studies on the interaction of Human Serum Albumin (HSA) and a fluorescent dye molecule, HSA is found to be capable of remarkably enhancing the fluorescence of DNA intercalating dye ethyl-4- [3,6-bis (1-methyl-4-vinylpyridium iodide) -9H-carbazol-9-yl) ] butanoate (EBCB). Based on the above, the invention discloses a detection reagent and a kit for Prostate Specific Antigen (PSA), which comprises the following steps: constructing a three-chain molecular beacon (TMS) by utilizing the composition principle of a PSA nucleic acid aptamer sequence and three-chain DNA, modifying the surface of the gold nanoparticle by an Au-S bond, and adding a bifunctional fluorescent dye EBCB (ethylene-bis-beta-cyclodextrin) to embed the molecular beacon to obtain the detection probe. Fluorescence is rapidly generated when PSA is present. After addition of Dansylamide (DNSA), the fluorescence was further amplified. The reagent and the kit of the invention use endogenous HSA as a fluorescence signal amplifier, have adjustable working range, lower detection limit and better detection effect. In addition, the system has better selectivity on other biomarkers in serum, does not need an external tool enzyme or a nano catalytic system, has cost benefit, and has original innovation and application prospect.)

***特异性抗原的检测试剂与试剂盒

技术领域

本发明属于***特异性抗原的分析领域，尤其涉及一种人血清白蛋白作为信号放大器，用于检测***特异性抗原的分析方法。

背景技术

***癌是男性***的常见恶性肿瘤，是欧美发达国家男性最常发恶性肿瘤，其死亡率通常在男性癌症中排名第二。近年来在我国成为发病率、病死率升高最快的肿瘤，严重威胁老年男性的健康。***癌通常情况下起病较为隐匿，生长较为缓慢，因在早期无明显症状，而一旦有临床症状出现，常为较晚的进展期。通过临床对***癌的诊断研究发现，PSA 是***癌的特异性标志物，因此开发一种高灵敏和高特异性的 PSA 检测方法将在临床诊断中具有重要意义。

PSA 作为早期诊断***癌和监测治疗后疾病复发的明确的血清生物标志物，但是在临床上使用的市售ELISA试验的临床检出限相对较低（0.1 ng /mL）。因此，为改进 PSA的检测方法，提高检测灵敏度，开发了一系列基于光学、电化学、比色法、生物条码的检测方法。例如周宏等（一种***特异性抗原检测试剂与试剂盒，中国专利，公开号CN107367616A）：采用 PSA 第一抗体、 PSA 第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠、和剪切酶所作用的信号扩增反应液，从而放大PSA的检测信号。肖建如等（一种检测***特异性抗原 PSA 的试剂盒及其应用，中国专利，公开号 CN106932570A）：采用抗原抗体结合原理，通过金颗粒与抗体结合将检测结果等比放大，应用全自动生化分析仪对 PSA 进行定量检测。例如，Xia等以金囊泡包裹的 Pd−Ir 纳米粒子作为过氧化物酶模拟物，作为信号扩增技术进行 PSA 比色测定。Chad A. Mirkin等以金纳米颗粒作为纳米酶制备生物条形码检测探针，用于***特异性抗原 PSA信号放大的检测。然而，这些方法均存在不足之处，如需要工具酶或纳米催化体系的信号放大过程、检测步骤复杂、成本高、耗时较长。因此，开发出一种更快速、高效、灵敏的 PSA 的检测方法很有必要。

人血清白蛋白( HSA )是血浆中最丰富的一种载体蛋白，正常浓度约为40 mg/ ml(~0.6 mM)，约占血浆总蛋白量的60 %。由于HSA的浓度较大，在血液中能与大部分外源性和内源性物质非特异性结合，在进行检测分析中会产生偏差，甚至是假阳性结果，因此 HSA常被认为是一种干扰物。例如，HSA 已被证明对临床分子诊断中的免疫分析(如酶联免疫吸附试验)产生干扰。然而，通过对人血清白蛋白（HSA）与荧光染料分子相互作用的研究，我们发现 HSA 能够使DNA 嵌入性染料 EBCB 的荧光显著增强，因此 HSA 可作为一种可用于血液中低丰度生物标志物荧光检测的有效放大器。基于此，本发明公开了一种***特异性抗原（PSA）的检测试剂与试剂盒，以血液中固有的HSA作为信号放大器，实现对 PSA 超灵敏检测。这种策略一方面避免了 HSA 因其在血液中含量高成为肿瘤分析的干扰剂，另一方面可以让生物系统的内在成分充分发挥生化分析的作用，无需外来的工具酶或纳米催化体系来实现信号放大，因此该方法具有成本效益，具有原始创新性和应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有放大技术的不足，提供一种不需要外来工具酶或纳米催化体系，分析工具简单的***特异性抗原的分析方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种***特异性抗原的分析方法，包括以下步骤：

利用 PSA 核酸适配体序列和三链 DNA 的组成原理构建三链分子信标，并通过Au-S键修饰在金纳米颗粒表面，加入双功能荧光染料 EBCB 嵌入分子信标得到检测探针。当 PSA存在时，荧光快速产生，加入DNSA后，荧光进一步放大，进而实现对***特异性抗原的高灵敏检测。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述在含有AuNPs 的PBS缓冲溶液中加入巯基修饰的 TMS，形成 TMS 修饰的 AuNPs，向上述溶液中加入 EBCB，摇晃混匀，使EBCB 与 DNA 充分作用，离心取下清液，形成用于 PSA 的 TMS 纳米探针，然后加入DNSA，最后加入被检测样品；以475 nm为激发光源，收集500 nm-750 nm的荧光，根据荧光强度对PSA实现定性与定量检测。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述TMS的茎部最优互补对数为8对碱基。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述TMS与AuNPs溶液加入的摩尔比例为108:1；TMS溶液的浓度为1-250 nM，所述EBCB染料的浓度为5-500 μM。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述 HSA 为血液中固有的成分，作为本方法的信号放大器。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述EBCB染料为本实验室合成。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述TMS序列从生工生物工程（上海）有限公司购买。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述EBCB染料与TMS-AuNPs溶液加入的摩尔比例为10:1；TMS-AuNPs溶液的浓度为1-250 nM，所述EBCB染料的浓度为5-500 μM。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述 DNSA 的最佳浓度为10 μM。

上述的***特异性抗原的分析方法，优选的，所述染料 EBCB 是一种双功能染料，既可以和 DNA 结合，又能和HSA特异性结合放大荧光信号。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明的***特异性抗原的分析方法中，首次以血液中固有的 HSA 作为信号放大器。

2、本发明的***特异性抗原的分析方法中，染料 EBCB 是一种双功能染料，既可以和 DNA 结合，又能和HSA特异性结合放大荧光信号。

3、本发明的***特异性抗原的分析方法中，在 HSA - EBCB 配合物中加入DNSA 后可以进一步增强荧光。

4、本发明的***特异性抗原的分析方法，其检测可在96孔PS板上进行的，没有重复的分离、洗涤过程，使这种检测具有成本效益。这种方法的工作范围较广，检出限较低，且有较好的检测效果，对血清中其他生物标志物有较好的选择性，具有成本效益，满足了应用要求。

附图说明

图1为本实施例筛选 DNA 结合染料用于 PSA 检测。

图2为本实施例 HSA 用于 EBCB 信号放大的分析。

图3为本实施例 EBCB 进入HSA的位点考察。

图4为本实施例 HSA用于 PSA 检测的信号放大分析。

图5为本实施例 TMS 纳米探针用于PBS缓冲液中PSA的荧光检测。

图6为本实施例 TMS 纳米探针用于临床血液标本中 PSA 的检测。

图7为本实施例 TMS 纳米探针检测PSA的摘要附图（原理图）。

图8（表1）为本实施例 TMS 纳米探针所用的寡核苷酸序列。

图9（表2）为本实施例 TMS 纳米探针和商用ELISA试剂盒筛选人血浆PSA。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

实施例：

一种本发明的***特异性抗原的分析方法，包括以下步骤：

（1）筛选 EBCB 染料

在含有 20 mg/mL HSA 的 PBS 缓冲液，分别加入 5 μM几种常规的DNA 结合染料，摇匀，测试并分别记录其荧光光谱，筛选出双功能荧光团。如图1所示，ethidium bromide(EB)、acridine orange(AO)、GelGreen(GG)、GelRed(GR)、Goldview(GV)和propidiumIodide(PI) 对 HSA的荧光响应可以忽略不计。SYBRGreenI(SGI)，4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)，Hoechst33342 (HC)和EBCB ，显示出明显的荧光增强。其中，当 HSA浓度为20 mg/mL时，EBCB对HSA溶液的增强作用最大，可高达 14 倍，因此将 EBCB 作为所用染料。

（2）制备 TMS纳米探针

采用柠檬酸钠还原 HAuCl₄ 的方法制备了金纳米粒子(AuNPs)。然后，用半胱胺对柠檬酸稳定的 AuNPs 进行了改性。将半胱氨酸溶液 (0.1 μM) 缓慢加入到 AuNPs 溶液中。改性后，轻轻摇动 2 h，在 4 ℃下储存10 h。再用 TMS 对合成的 AuNPs 进行修饰。将TMS 的中间链S1探针与含 AuNPs 的溶液孵育 12 h，在混合液中加入 2 M 氯化钠溶液，每 6 小时滴一滴，最终浓度达到 0.3 M。离心 30 min (13000 g)，再悬浮于0.01M磷酸盐缓冲液中3次。在 PBS 缓冲液中加入 Apt，形成 TMS 修饰的 AuNPs 。最后，向混合物中加入10 µL500 µM EBCB，形成用于检测 PSA 的TMS纳米探针。离心后再悬浮，于4°C下储存待用。

（3）HSA 用于 EBCB 信号放大

在含有5 μM EBCB 的 PBS 缓冲液中，分别加入浓度为0 ~ 40 mg/mL的 HSA 溶液，在475 nm激发下测定了相应的荧光，并记录了500~750 nm的发射光谱。结果表明，随着HSA 浓度的增加，荧光信号不断加强。并且，在多种生物分子存在下，只有 HSA 能大幅度增强EBCB 的荧光。

（4）EBCB进入HSA的位点考察

在含有10 μM EBCB 的 PBS 缓冲液中，分别加入浓度为0 ~ 10 mg/mL的 HSA 溶液，分别加入浓度为0 ~ 200 μM的 DNSA和布洛芬（ibuprofen）后，在475 nm激发下测定了相应的荧光，并记录了500~750 nm的发射光谱。结果表明，EBCB通过与HSA的位点I结合实现荧光信号放大，且DNSA的加入可以进一步增强EBCB的荧光。

（5）HSA 用于 PSA 检测时的信号放大分析

在含有1 nm TMS 纳米探针的 96 孔微滴板上，分别加入浓度为0 ~ 10 mg/mL的 PSA后，在室温下振荡10 min后，加入42 mg/mL HSA和10 μM DNSA，将微滴板在室温下摇动5min后，读取每个孔在475 nm 激发下的荧光强度。

（6）TMS 纳米探针用于PBS缓冲液中PSA的荧光检测

在含有1 nM TMS纳米探针的PBS缓冲液中，在一定浓度范围内加入PSA后，将溶液在室温下孵育。在室温振荡10 min后，分别加入不同剂量的 HSA和10 μM DNSA，在475 nm激发下测定相应的荧光，并记录500~750 nm的发射光谱。

（7）TMS 纳米探针对 PSA 检测的选择性探究

在含有 1 nM TMS纳米探针的 PBS 缓冲液中，分别加入10 ng mL⁻¹不同的蛋白质溶液，其中，加入 PSA 的一组中PSA 的浓度为1 ng/mL。同时，增加一空白组，只加入 PBS 缓冲溶液，摇匀，测量并记录各组溶液在激发波长= 475 nm，发射波长= 570 nm时的荧光强度值，得到各种蛋白质溶液对 TMS 纳米探针荧光信号的影响。信倍比为加入各种蛋白质后溶液的荧光值除以空白组的荧光值，重复三次试验，取平均值。

（8）TMS 纳米探针用于临床血液标本血液标本中 PSA 的检测

为了进一步评估纳米探针在临床中的应用，对患者的血清样本进行了调查。所测人血样本来自健康女性供体(阴性)和***癌患者(阳性)。将血液离心 (8000 rpm, 10 min)去除红细胞后，加入 1 nM TMS纳米探针和 10 μM DNSA（由于血清样本含有 HSA，因此在本实验中不添加额外的 HSA）共同孵育。设置荧光分光光度计参数，激发波长= 475 nm，发射波长= 570 nm，进行时间扫描。结果表明，随着PSA 浓度的增加，荧光信号在几分钟内迅速增加并饱和，检出限低至 0.42 pg/mL，说明其具有潜在的临床应用前景。

图1为本实施例筛选 DNA 结合染料用于 PSA 检测。如图所示，溴化乙锭(EB)、吖啶橙(AO)、GelGreen(GG)、GelRed(GR)、Goldview(GV)和碘化丙啶(PI) 对 HSA的荧光响应可以忽略不计。SYBRGreenI(SGI)，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，Hoechst33342 (HC)和EBCB ，显示出明显的荧光增强。从图像和F/F0值可以清楚地看出，EBCB荧光增强最大，可高达14倍，因此将EBCB 作为所用染料。信倍比为加入各种染料后溶液的荧光值除以空白组的荧光值，重复三次试验，取平均值。

图2为本实施例 HSA 用于 EBCB 信号放大的分析。(A) EBCB 对 HSA 滴定时的荧光发射光谱；(B)为血清中蛋白质的蛋白质凝胶电泳；(C)为不同生物分子存在下 EBCB 荧光响应。如图2A所示，随着 HSA 浓度从0.6增加到40 mg/mL，荧光强度明显增加，当 HSA 为20 mg/mL 时，EBCB 荧光增强了 14 倍。从凝胶电泳图2B可以看出，第1和第3条带血清中含有血清中的蛋白质，而第2和第4条带是纯HSA。样品用考马斯亮蓝或EBCB染色。条带1显示了蛋白质的分布，其中 HSA 带是最强的，与其高浓度一致。在第3条带中，只有 HSA 能被EBCB染色，而其它蛋白则不能被染色，表明只有HSA与EBCB的结合能增强荧光。另外，从图像和F/F0值可以清楚地看出，HSA是唯一能增强EBCB荧光的生物分子。信倍比F/F0为加入 HSA 后溶液的荧光值除以空白组的荧光值，重复三次试验，取平均值。

图3为本实施例 EBCB进入HSA 的位点考察。HSA具有两个不同的结合位点（位点I和II），DNSA和 ibuprofen分别跟位点I、位点II结合。如图3A所示，DNSA能和EBCB共同嵌入HSA中，进一步增强荧光信号。而ibuprofen只能和HSA的位点II结合，所以加入ibuprofen后对荧光信号几乎没有影响（图3B）。这表明，EBCB通过与HSA的位点I结合实现荧光信号放大，且DNSA的加入可以进一步增强EBCB的荧光。

图4为本实施例 HSA 用于 PSA 检测的信号放大分析。本图为在PBS缓冲液中加入PSA 后， TMS 纳米传感系统在含有不同的试剂的 96 孔 PS 板中的荧光图像。如图所示，在加入 HSA 后，低浓度的 PSA 也具有良好的荧光成像和光度测量分析特性。因此，HSA 起到了信号放大的作用。

图5为本实施例 TMS 纳米探针用于PBS缓冲液中PSA的荧光检测。如图5A所示，在仅有 PBS缓冲液（无HSA）中，TMS 纳米探针对 PSA 的响应非常小，需PSA ≥ 25ng/ml时才能被检测出。而在含有HSA（5B）的PBS缓冲液中加入不同浓度的PSA时，TMS 纳米探针对低浓度的PSA 也具有很好地响应，随着PSA 浓度的增加，荧光强度逐渐增大。图5C为在有无HSA存在时，在570 nm处绘制不同PSA浓度的F/F0。从图像和F/F0值可以看出，该纳米探针在0.0005~0.32 ng/mL范围内具有较宽的线性范围，检测极限低至0.42 pg/mL。图5D为 TMS纳米探针对 PSA 检测的选择性探究。从图中可以看出，甲胎蛋白（AFP），免疫球蛋白（IgG），黏蛋白（mucin 1），凝血酶（thrombin），胰岛素（insulin），胰蛋白酶（trypsin）和溶菌酶（lysozyme）等蛋白质加入后产生的荧光信号基本可以忽略，只有加入 PSA 才会引起 TMS纳米探针荧光信号的显著恢复，其它对照蛋白质不存在干扰。说明该 TMS 纳米探针对 PSA检测具有很好的选择性。信倍比F/F0为加入 HSA 后溶液的荧光值除以空白组的荧光值，重复三次试验，取平均值。

图6为本实施例 TMS 纳米探针在临床血液标本中 PSA 的检测。如图所示，随着血清中PSA浓度的增加，荧光信号迅速增强。当PSA浓度为2.0 ng/mL时，荧光强度不到一分钟就达到饱和。说明本实例可以应用于临床血液标本中 PSA 的快速检测分析，操作简单，灵敏度高，具有潜在的商业价值。

图7（摘要附图）：我们发现DNA 结合染料EBCB 能特异地结合到HSA的Ⅰ位，从而大大增强其荧光。特用这一特性，制备了一种DNA构象转换介导的生物传感器，用于检测人血清中PSA。利用 PSA 核酸适配体序列和三链 DNA 的组成原理构建三链分子信标，通过Au-S键修饰在金纳米颗粒表面，适配体 PSA 设计为捕获探针，并将大量的EBCB嵌入到 TMS 纳米探针的茎序列中。当 PSA 存在时，核酸适配体-PSA的竞争结合可诱导EBCB的释放，从而触发HSA调控的荧光扩增，实现对***特异性抗原的高灵敏检测。

图8（表1）为本实施例 TMS 纳米探针所用的寡核苷酸序列。Apt 1、Apt 2、Apt 3和Apt 4四条链中间的碱基序列相同，只有两端碱基数目不同。并且四条Apt的两端均可与S1互补形成三链分子开关。通过实验证明，TMS的茎部最优互补对数为8对碱基。

图9（表2）为用 TMS 纳米探针和商用 ELISA 试剂盒筛选人血浆 PSA。我们首先对一名具有PSA 标准值得女性献血者在不同浓度的血清中进行了定量检测，用基于夹心ELISA法的一种商用PSA(人)试剂盒作为对照。如表2所述，我们的 TMS 纳米探针得到的实验数据与PSA试剂盒的结果一致，且所有样品的变异系数(n=6)均小于10.72 %，证明该传感器在复杂的生物环境中具有良好的准确度和较高的选择性。另外，我们测量了一位***癌患者术前、术后的血清样本，结果表明，进行***根治术后其 PSA水平明显下降，9 天后已基本检测不到 PSA 的含量。这些结果证明该方法在临床癌症点诊断中具有潜在应用。表中所测数据取自六次测定的平均值，样品1为一名具有PSA标准值的女性献血者，样品2为一位***癌患者。