一种大肠癌免疫传感器的制备及其检测方法
阅读说明：本技术 一种大肠癌免疫传感器的制备及其检测方法 (Preparation and detection method of colorectal cancer immunosensor ) 是由 刘洋 黎玉凤 李旺 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了本发明提供了一种大肠癌免疫传感器的制备及其检测方法,采用如下步骤制备：采用绝缘硅片作为底层；制备半导体层和导电层；刻蚀呈三角分布的槽孔,三角分布的槽孔分别作为免疫传感器的源电极、漏电极和栅电极；形成了半导体硅与导电层之间的欧姆接触；用采用电感耦合等离子体刻蚀技术制作出多个微流控通道、液体出口通道和入口通道,清除残留物；进行非特异性活性处理,保存于3-4℃温度下备用,得到免疫传感器。传感器在检测应用上,灵敏度高、准确度高,能实时反应且免于标记。(The invention discloses a preparation method and a detection method of a colorectal cancer immunosensor, which are prepared by the following steps: adopting an insulating silicon wafer as a bottom layer; preparing a semiconductor layer and a conductive layer; etching triangular distributed slotted holes which are respectively used as a source electrode, a drain electrode and a gate electrode of the immunosensor; forming an ohmic contact between the semiconductor silicon and the conductive layer; manufacturing a plurality of microfluidic channels, liquid outlet channels and liquid inlet channels by using an inductively coupled plasma etching technology, and removing residues; performing nonspecific activity treatment, and storing at 3-4 deg.C to obtain immunosensor. The sensor has high sensitivity and high accuracy in detection application, can react in real time and is free from marking.)
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，更具体是涉及一种大肠癌免疫传感器的制备用及其检测方法。
背景技术
大肠癌引起的死亡者在增加，与其他癌相比，大肠癌在早期发现、并进行合适治疗的情况下的5年生存率非常高，因而大肠癌的群体筛查(mass screening)是最有效果的方法之一。
为了大肠癌的确诊，一般进行能够直接视觉确认大肠内的内视镜检查，再视需要进行患处的活体检查。然而，这些方法是侵袭性的，且需要高度的专业技术，因此不适合群体筛查这样的初筛。
非侵袭性检测大肠癌的方法，有以粪便中所含的成分作为指标的方法。粪便中包含从癌组织剥离的细胞，因而，可以认为粪便的组成能够反映消化道病变。因此，以正常组织中几乎不表达、但癌组织中高表达的基因作为生物标记，以粪便中该基因的 mRNA 量、癌胚抗原（CEA），CA19-9等作为指标，以它们在粪便中的含量作为指标，来检测大肠癌。然而，存在的问题是 ：使用这些生物标记时的灵敏度基本上与便潜血法程度等同或者较之更低。特别是，上述任何生物标记对早期癌、进行性腺瘤的检测灵敏度均比便潜血法还要差。因此，强烈希望开发以免于标记且灵敏度高的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大肠癌免疫传感器的制备方法，解决了现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种大肠癌免疫传感器的制备方法，其特征在于，采用如下步骤制备：
（1）采用绝缘硅片作为底层；
（2）通过等离子体增强化学气相沉积法将厚度为15nm的二氧化硅（SiO2）薄片沉积在绝缘硅片的表面成半导体层，而后用化学气相沉积工艺将二氧化钛作为导电层，并对其钝化；
（3）用 Nikon 步进光刻仪在绝缘层表面上刻蚀呈三角分布的槽孔，三角分布的槽孔分别作为免疫传感器的源电极、漏电极和栅电极 ，其中源极与漏极的槽孔之间通过设置间隔层将源极与漏极之间的导电层断开以绝缘；
（5）孔槽中形成源电极、漏电极和栅电极通过金属沉积法制备，而后采用采用酸性溶液进行处理；
（6）将1-5步骤制成的半成品在410-450℃环境中进行快速热退火处理，形成了半导体硅与导电层之间的欧姆接触；
（7）采用电感耦合等离子体刻蚀技术制作出多个微流控通道、液体出口通道和入口通道，清除残留物；
（8）对将1-7制成的传感器放入含有4%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）无水乙醇溶液中，时间为20分钟，用含有0.4%的磷酸缓冲溶液（PBST）淋洗修饰电极，滴涂20 μL 6% 牛血清蛋白，封闭电极上的非特异性活性位点，保存于3-4℃温度下备用，得到免疫传感器。
优选地，所述绝缘硅片为边缘薄中间厚的方形或圆形，所述绝缘片厚度范围是40-60 nm。
优选地，所述导电层的厚度在6-15纳米之间，且所述导电层通过连接纳米线与半导体检测装置的探针。
优选地，所述间隔层可以是采用刻蚀法在源极与漏极之间开凹槽。
优选地，所述微流控通道设置在半导体层和导电层之间，液体出口通道和入口通道连通穿透导电层分别与微流控通道的两端连通，多个微流控通道呈并列式分布，微流控通道直径范围是3-6μm。
本发明的另一个目的在于提供一种大肠癌免疫传感器的检测方法，包括如下步骤：
（1）准备配套仪器，将仪器探测针与传感器接入；
（2） 根据测定到的还原峰峰电流值对应标准曲线得到样品中检测物的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、采用这种方法从而形成测试物与传感器处于交叉网格结构，从而实现纳米线的交叉互联。在此三角形的桥接网格结构中，当两个分叉之间有生物分子通过时，则会相互遮挡光波及扰动电场， 使得传感器探测到的光强及电流发生变化，由此实现对液态样品的检测(如生物分子和细胞等)，该结构可以用于化学量传感器，如生物分子计数、以及测试生物分子的吸光度和受激荧光。
2、微流控通道排列均匀，使其具有大的比表面积，可以有效收集和增强信号。
3、3-氨丙基三乙氧基硅烷和其它物质反应以共价结合的方式修饰进行抵抗特异性，而非传统的静电吸附作用，提高了抵抗非特异性吸附的能力，促使传感器与检测物之间正相关关系可同时实现定性和定量检测，且灵敏度高。
4、本发明的传感器在检测应用上，灵敏度高、准确度高，能实时反应且免于标记。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明的大肠癌免疫传感器，采用如下步骤制备：
（1）采用绝缘硅片作为底层，绝缘硅片优选为边缘薄中间厚的方形或圆形，厚度范围是40-60 nm，边缘优选40nm，中间最厚为60nm。
（2）通过等离子体增强化学气相沉积法将厚度为15nm的二氧化硅（SiO2）薄片沉积在绝缘硅片的表面成半导体层，而后用化学气相沉积工艺将二氧化钛作为导电层，并对其钝化，导电层的厚度在6-15纳米之间，优选12纳米，且导电层用于连接纳米线与半导体检测装置的探针。
（3）用 Nikon 步进光刻仪在绝缘层表面上刻蚀呈三角分布的槽孔，优选成密堆积阵列，以便放置纳米颗粒；三角分布的槽孔分别作为免疫传感器的源电极、漏电极和栅电极，其中源极与漏极的槽孔之间通过设置间隔层将源极与漏极之间的导电层断开以绝缘，该间隔层可以是采用刻蚀法在源极与漏极之间开凹槽来实现，也可以是其它方式实现。
（5）孔槽中形成源电极、漏电极和栅电极通过金属沉积法制备，而后采用采用酸性溶液进行处理。
（6）将1-5步骤制成的半成品在410-450℃环境中进行快速热退火处理，形成了半导体硅与导电层之间的欧姆接触。
（7）采用电感耦合等离子体刻蚀技术制作出多个微流控通道、液体出口通道和入口通道，清除残留物；其中，微流控通道设置在半导体层和导电层之间，液体出口通道和入口通道连通穿透导电层分别与微流控通道的两端连通，多个微流控通道呈并列式分布，微流控通道直径范围是3-6μm，优选是3μm 或6μm。
（8）对将1-7制成的传感器放入含有4%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）无水乙醇溶液中，时间为20分钟，用含有0.4%的磷酸缓冲溶液（PBST）淋洗修饰电极，滴涂20 μL 6%牛血清蛋白，封闭电极上的非特异性活性位点，保存于3-4℃温度下备用，得到免疫传感器。
采用这种方法从而形成测试物与传感器处于交叉网格结构，从而实现纳米线的交叉互联。在此三角形的桥接网格结构中，当两个分叉之间有生物分子通过时，则会相互遮挡光波及扰动电场， 使得传感器探测到的光强及电流发生变化，由此实现对液态样品的检测(如生物分子和细胞等)，该结构可以用于化学量传感器，如生物分子计数、以及测试生物分子的吸光度和受激荧光。另外，微流控通道排列均匀，使其具有大的比表面积，可以有效收集和增强信号。此外，3-氨丙基三乙氧基硅烷和其它物质反应以共价结合的方式修饰进行抵抗特异性，而非传统的静电吸附作用，提高了抵抗非特异性吸附的能力，促使传感器与检测物之间正相关关系可同时实现定性和定量检测，且灵敏度高。
本发明的大肠癌免疫传感器的检测方法，包括如下步骤：
（1）准备配套仪器，将仪器探测针与传感器接入。
准备的仪器至少包括有：Nikon NSR 1755i B步进光刻仪、安捷伦B1500A半导体参数测量仪、多路高精度蠕动泵、KQ5200型超声波清洗器、2XZ-1型旋片式真空泵、数显控温电热板、恒温振荡器、电热恒温鼓风干燥箱、实验室水纯化系统，他们的连接关系采用现有技术方案及通用的技术方案进行连接即可，而与传感器连接时，注意绝缘及防水和防污染处理，也可以对制备出的传感器进行封接处理后再使用。
（2） 根据测定到的还原峰峰电流值对应标准曲线得到样品中检测物的浓度。
例如对 RNA溶液的检测：
将封接好的传感器与多路高精度蠕动泵和半导体参数测量仪连接在一起，蠕动泵以18μL/min 的速度将RNA抗原溶液从试管中不断地泵入传感器的微流道内。每个检测结果由三组探针独立测试，检测过程在室温环境中（25±2℃）进行。
在检测实验中，将不同浓度的 RNA抗原溶液经微流孔通道流入 Si-NR 的感测窗口时，在整个检测过程中，施加在栅极上的电压为-5V，可以使得电场均匀分布。在对RNA的浓度进行检测时，将浓度分别为 10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml 和 100ng/ml 的RNA溶液在微流体通道中流通 100 秒，并获得 NR 的实时电流时间曲线。实验结果清晰地表明了 Ids饱和电流随着 RNA抗原溶液浓度的增加而增加，说明本发明的传感器在检测应用上，灵敏度高、准确度高，能实时反应且免于标记。
在对RNA、BRAF、APC等基因溶液的检测也是采用如上所述方法进行。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。