阅读说明：本技术 人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用 (Application of human plasma mitochondrion fusion protein 2 as molecular marker for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease ) 是由 南月敏 杜静华 王荣琦 张玉果 赵素贤 苑喜微 李冬冬 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用,属于肝病诊断技术领域,所述人血浆线粒体融合蛋白2可作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物,非酒精性脂肪性肝病患者的人血浆线粒体融合蛋白2水平显著降低,当人血浆中人血浆线粒体融合蛋白2的含量小于12.49ng/ml时,表明人发生了非酒精性脂肪性肝病。(The invention provides an application of human plasma mitochondrial fusion protein 2 as a molecular marker for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, belonging to the technical field of liver disease diagnosis, wherein the human plasma mitochondrial fusion protein 2 can be used as a molecular marker for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, the level of the human plasma mitochondrial fusion protein 2 of a non-alcoholic fatty liver disease patient is obviously reduced, and when the content of the human plasma mitochondrial fusion protein 2 in human plasma is less than 12.49ng/ml, the human plasma mitochondrial fusion protein 2 indicates that the non-alcoholic fatty liver disease occurs.)

人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的 分子标志物中的应用

技术领域

本发明属于肝病诊断技术领域，尤其涉及人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，膳食结构及生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率呈逐年上升趋势，已成为我国第一大慢性肝脏疾病以及健康查体肝酶异常的首要原因；其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、NAFLD相关肝硬化及肝细胞癌。NAFLD不仅导致肝病残疾和死亡，还与代谢综合征、2型糖尿病及结直肠肿瘤等的高发密切相关，严重危害人民生命健康。可靠的分子标志物的发现与应用是及早发现NAFLD、及时采取有效措施并防止疾病进展的关键。

目前，尚乏精准诊断NAFLD发生发展的分子标志物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

优选的，所述人血浆线粒体融合蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的人血浆线粒体融合蛋白2的 MFN2基因在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

优选的，所述MFN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用，所述人血浆线粒体融合蛋白2可作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物，非酒精性脂肪性肝病患者的人血浆线粒体融合蛋白2显著降低，当人血浆中的人血浆线粒体融合蛋白2的含量小于12.49 ng/ml时，表明人发生了非酒精性脂肪性肝病。

附图说明

图1为健康对照与NAFLD小鼠肝脏病理图；

图2为健康对照与NAFLD小鼠肝脏病理MFN2免疫组织化学染色；

图3为健康对照与NAFLD小鼠MFN2蛋白表达水平；

图4为健康对照与NAFLD小鼠MFN2 mRNA表达水平；

图5为健康对照与NAFLD患者MFN2蛋白表达水平；

图6为NAFLD患者不同肝酶水平MFN2表达水平对比分析；

图7为人MFN2蛋白ROC曲线。

具体实施方式

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。在本发明中，所述人血浆线粒体融合蛋白2简称 Mitofusin 2，MFN2。

在本发明中，所述人血浆线粒体融合蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID No.1 所示，具体如下所示：

M S L L F S R C N S I V T V K K N K R H M A E V N A S P L K H F V T AK K K I N G I F E Q L G A Y I Q E S A T F L E D T Y R N A E L D P V T T E E QV L D V K G Y L S K V R G I S E V L A R R H M K V AF F G R T S N G K S T V IN A M L W D K V L P S G I G H T T N C F L R V E G T D G H E A F L L T E G S EE K R S A K T V N Q L A H A L H Q D K Q L H A G S L V S V M W P N S K C P L LK D D L V L M D S P G I D V T T E L D S W I D K F C L D A D V F V L V A N S ES T L M Q T E K H F F H K V S E R L S R P N I F I L N N R W D A S A S E P E YM E E V R R Q H M E R C T S F L V D E L G V V D R S Q A G D R I F F V S AK EV L N A R I Q K A Q G M P E G G G A L A E G F Q V R M F E F Q N F E R R F E EC I S Q S A V K T K F E Q H T V R A K Q I A E A V R L I M D S L H M A A R E QQ V Y C E E M R E E R Q D R L K F I D K Q L E L L A Q D Y K L R I K Q I T E EV E R Q V S T A M A E E I R R L S V L V D D Y Q M D F H P S P V V L K V Y K NE L H R H I E E G L G R N M S D R C S T A I T N S L Q T M Q Q D M I D G L K PL L P V S V R S Q I D M L V P R Q C F S L N Y D L N C D K L C A D F Q E D I EF H F S L G W T M L V N R F L G P K N S R R A L M G Y N D Q V Q R P I P L T PA N P S M P P L P Q G S L T Q E E F M V S M V T G L A S L T S R T S M G I L VV G G V V W K A V G W R L IA L S F G L Y G L L Y V Y E R L T W T T K A K E RAF K R Q F V E H A S E K L Q L V I S Y T G S N C S H Q V Q Q E L S G T F A HL C Q Q V D V T R E N L E Q E I A A M N K K I E V L D S L Q S K A K L L R N KA G W L D S E L N M F T H Q Y L Q P S R。

在本发明中，与健康人相比，非酒精性脂肪性肝病患者的人血浆线粒体融合蛋白2显著降低。当人的血浆中的人血浆线粒体融合蛋白2的含量小于 12.49ng/ml时，表明人发生了非酒精性脂肪性肝病。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的人血浆线粒体融合蛋白2的 MFN2基因在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

在本发明中，所述MFN2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

atgatgcagtgggagtccgagcctctgcgtcgtccgcttgggacgcgccggcggaggagtggcgcgcggaggagtggcgcgctgagacgccgctcgaagcgccgagtcgcggggcagcagaggcgtaagg agtaggcggg gcgagccggctgggctcagggtccaccagctcacccgggtcgaggggcaatctgaggcgactggtgacgcgctt atccacttccctcctcccgcctccccctggggtggcgctcgctggtgacgtagtgagtgtgatggccgccgcgagg ccgggaaggtgaagcgcaatgtccctgctcttctctcgatgcaactctatcgtcacagtcaagaaaaataagagaca catggctgaggtgaatgcatccccacttaagcactttgtcactgccaagaagaagatcaatggcatttttgagcagctgggggcctacatccaggagagcgccaccttccttgaagacacgtacaggaatgcagaactggaccccgttaccacagaagaacaggttctggacgtcaaaggttacctatccaaagtgagaggcatcagtgaggtgctggctcggaggcacatgaaagtggctttttttggccggacgagcaatgggaagagcaccgtgatcaatgccatgctctgggacaaagttct gccctctgggattggccacaccaccaattgcttcctgcgggtagagggcacagatggccatgaggcctttctcctta ccgagggctcagaggaaaagaggagtgccaagactgtgaaccagctggcccatgccctccaccaggacaagca gctccatgccggcagcctagtgagtgtgatgtggcccaactctaagtgcccacttctgaaggatgacctcgttttgat ggacagccctggtattgatgtcaccacagagctggacagctggattgacaagttttgtctggatgctgatgtgtttgtg ctggtggccaactcagagtccaccctgatgcagacggaaaagcacttcttccacaaggtgagtgagcgtctctccc ggccaaacatcttcatcctgaacaaccgctgggatgcatctgcctcagagcccgagtacatggaggaggtgcggc ggcagcacatggagcgttgtaccagcttcctggtggatgagctgggcgtggtggatcgatcccaggccggggacc gcatcttctttgtgtctgctaaggaggtgctcaacgccaggattcagaaagcccagggcatgcctgaaggaggggg cgctctcgcagaaggctttcaagtgaggatgtttgagtttcagaattttgagaggagatttgaggagtgcatctcccag tctgcagtgaagaccaagtttgagcagcacacggtccgggccaagcagattgcagaggcggttcgactcatcatgg actccctgcacatggcggctcgggagcagcaggtttactgcgaggaaatgcgtgaagagcggcaagaccgactg aaatttattgacaaacagctggagctcttggctcaagactataagctgcgaattaagcagattacggaggaagtgga gaggcaggtgtcgactgcaatggccgaggaga。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

NAFLD小鼠模型建立及MFN2表达分析

建立NAFLD小鼠模型：采用高脂高糖高胆固醇(high fat-high carbohydrate-high cholesterol，HFHC)饮食建立野生型C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病模型，并设同期正常对照饲料饮食小鼠为对照。

动物分组及处理：

表1动物分组

于16周后处死所有小鼠，对肝脏形态拍照留存对比，肝组织分别以4％中性甲醛、2.5％戊二醛固定及液氮快速冷冻后置于-80℃冰箱保存，备提取蛋白、RNA。

取不同组别小鼠肝脏相同部位，约1cm×1cm×0.5cm大小组织，经固定、脱色、透明石蜡包埋、连续切片等制成4μm厚的切片，已制备好的石蜡切片室温放置30min后放置烘箱(65℃)1h后进行常规HE染色，显微镜下观察肝脂肪变及炎症程度。同时利用免疫组织化学染色检测不同组别小鼠肝组织中MFN2表达情况。

结果：成功建立NAFLD小鼠模型，NAFLD小鼠肝脏外形与正常对照小鼠相比显著增大、叶间裂变小(图1，A、B)。对NAFLD模型小鼠及健康对照小鼠肝组织行HE染色结果显示，与正常小鼠相比，NAFLD模型小鼠肝脏可见大泡性脂肪变、炎症细胞浸润(图1，C、D)；免疫组织化学染色，通过imagej软件分析染色区域的累积光密度值(IOD)显示：NAFLD 小鼠肝组织中MFN2 IOD值较对照组显著降低，P＜0.001(图2，A、B)。

实施例2

实施例1的小鼠肝脏MFN2表达分析

Westernblot检测MFN2蛋白表达(MFN2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)：摄取肝组织蛋白后，Nanodrop测定蛋白浓度，用ddH₂O将各样品稀释呈统一浓度，向稀释后的蛋白液加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，混匀后置于100℃沸水煮5分钟，-20℃冷冻，待用。

Westernblot检测MFN2表达水平，以在各种组织细胞中表达相对恒定的GAPDH蛋白作为参照，具体步骤：检测蛋白上样后，60V、30min后电压转换成120V，待溴酚蓝跑至分离胶底部时停止电泳。转膜后含5％脱脂奶粉溶液室温封闭1h。按照MFN2(124772，abcam)抗体说明书稀释一抗后 4℃摇床过夜。TBST洗膜三次，每次10min。孵育二抗，室温1h。TBST洗膜后，使用Odyssey发光显影。

实时定量PCR检测MFN2基因表达：按照常规方法提取肝脏总RNA，并按Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以此为模板，设计特异性引物(见表2)进行PCR扩增，依次加入反应物，反应体系如下：Taq酶11μl：Forward primer 0.5μl；Reverse primer 0.5μl；ddH2O 6μl；cDNA 2μl。总体积20μl。实时定量PCR仪PCR热循环参数：96℃4min，然后三步反应： 94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行40个循环，于每个循环的第三步72℃30s 收集荧光信号。

表2 MFN2基因PCR引物信息

结果：Western blot检测了小鼠肝脏中MFN2及GAPDH水平，结果显示：与健康对照组相比，NAFLD组小鼠肝组织MFN2蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义，P＜0.01(图3)。通过qPCR技术检测了小鼠肝脏中MFN2 mRNA水平，结果显示：NAFLD组小鼠肝脏中MFN2mRNA水平亦较对照组显著降低，差异有统计学意义，P＜0.01(图4)。

实施例3

健康对照及NAFLD患者血浆中MFN2水平，ELISA检测

对河北医科大学第三医院经腹部B超及血清生化学检查证实的NAFLD 患者328例、健康对照113例血浆标本，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆MFN2水平，并进行统计学分析， Logistic回归分析NAFLD发生的独立危险因素，通过受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC)评估血浆MFN2水平对NAFLD 发生的诊断效能。

按照说明书，1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需酶标条。2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。5.洗板机洗板5次。6.每孔加入底物100μL，37℃避光孵育15min。7.每孔加入终止液50μL，15min内，在 450nm波长处测定各孔的OD值。

结果：统计学分析显示，基于目前的病人样本量，NAFLD患者血浆MFN2 水平显著低于健康对照组，11.22±2.14ng/ml vs 14.69±2.07ng/ml，P＜ 0.0001(图5)；

NAFLD患者中肝脏酶学异常组MFN2水平显著低于肝脏酶学正常组患者MFN2水平，10.70±2.12ng/ml vs 11.87±1.98ng/ml，P＜0.0001(图6)，表明随着肝损伤的加重、肝酶的异常，MFN2表达水平明显降低。

对研究结果行logistic回归分析显示：MFN2为NAFLD发生的独立危险因素(表3)；进一步通过ROC曲线分析，当病人血浆中MFN2蛋白水平小于12.49ng/ml时，提示病人发生了NAFLD，曲线下面积为0.869(95％CI： 0.834-0.899)，灵敏度71.3％，特异度83.2％(图7)。

表3 NAFLD预测因素

由以上实施例可以得出，人血浆线粒体融合蛋白2可作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河北医科大学第三医院

<120> 人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Leu Leu Phe Ser Arg Cys Asn Ser Ile Val Thr Val Lys Lys

1 5 10 15

Asn Lys Arg His Met Ala Glu Val Asn Ala Ser Pro Leu Lys His Phe

20 25 30

Val Thr Ala Lys Lys Lys Ile Asn Gly Ile Phe Glu Gln Leu Gly Ala

35 40 45

Tyr Ile Gln Glu Ser Ala Thr Phe Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Asn Ala

50 55 60

Glu Leu Asp Pro Val Thr Thr Glu Glu Gln Val Leu Asp Val Lys Gly

65 70 75 80

Tyr Leu Ser Lys Val Arg Gly Ile Ser Glu Val Leu Ala Arg Arg His

85 90 95

Met Lys Val Ala Phe Phe Gly Arg Thr Ser Asn Gly Lys Ser Thr Val

100 105 110

Ile Asn Ala Met Leu Trp Asp Lys Val Leu Pro Ser Gly Ile Gly His

115 120 125

Thr Thr Asn Cys Phe Leu Arg Val Glu Gly Thr Asp Gly His Glu Ala

130 135 140

Phe Leu Leu Thr Glu Gly Ser Glu Glu Lys Arg Ser Ala Lys Thr Val

145 150 155 160

Asn Gln Leu Ala His Ala Leu His Gln Asp Lys Gln Leu His Ala Gly

165 170 175

Ser Leu Val Ser Val Met Trp Pro Asn Ser Lys Cys Pro Leu Leu Lys

180 185 190

Asp Asp Leu Val Leu Met Asp Ser Pro Gly Ile Asp Val Thr Thr Glu

195 200 205

Leu Asp Ser Trp Ile Asp Lys Phe Cys Leu Asp Ala Asp Val Phe Val

210 215 220

Leu Val Ala Asn Ser Glu Ser Thr Leu Met Gln Thr Glu Lys His Phe

225 230 235 240

Phe His Lys Val Ser Glu Arg Leu Ser Arg Pro Asn Ile Phe Ile Leu

245 250 255

Asn Asn Arg Trp Asp Ala Ser Ala Ser Glu Pro Glu Tyr Met Glu Glu

260 265 270

Val Arg Arg Gln His Met Glu Arg Cys Thr Ser Phe Leu Val Asp Glu

275 280 285

Leu Gly Val Val Asp Arg Ser Gln Ala Gly Asp Arg Ile Phe Phe Val

290 295 300

Ser Ala Lys Glu Val Leu Asn Ala Arg Ile Gln Lys Ala Gln Gly Met

305 310 315 320

Pro Glu Gly Gly Gly Ala Leu Ala Glu Gly Phe Gln Val Arg Met Phe

325 330 335

Glu Phe Gln Asn Phe Glu Arg Arg Phe Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ser

340 345 350

Ala Val Lys Thr Lys Phe Glu Gln His Thr Val Arg Ala Lys Gln Ile

355 360 365

Ala Glu Ala Val Arg Leu Ile Met Asp Ser Leu His Met Ala Ala Arg

370 375 380

Glu Gln Gln Val Tyr Cys Glu Glu Met Arg Glu Glu Arg Gln Asp Arg

385 390 395 400

Leu Lys Phe Ile Asp Lys Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Asp Tyr Lys

405 410 415

Leu Arg Ile Lys Gln Ile Thr Glu Glu Val Glu Arg Gln Val Ser Thr

420 425 430

Ala Met Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ser Val Leu Val Asp Asp Tyr

435 440 445

Gln Met Asp Phe His Pro Ser Pro Val Val Leu Lys Val Tyr Lys Asn

450 455 460

Glu Leu His Arg His Ile Glu Glu Gly Leu Gly Arg Asn Met Ser Asp

465 470 475 480

Arg Cys Ser Thr Ala Ile Thr Asn Ser Leu Gln Thr Met Gln Gln Asp

485 490 495

Met Ile Asp Gly Leu Lys Pro Leu Leu Pro Val Ser Val Arg Ser Gln

500 505 510

Ile Asp Met Leu Val Pro Arg Gln Cys Phe Ser Leu Asn Tyr Asp Leu

515 520 525

Asn Cys Asp Lys Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Ile Glu Phe His

530 535 540

Phe Ser Leu Gly Trp Thr Met Leu Val Asn Arg Phe Leu Gly Pro Lys

545 550 555 560

Asn Ser Arg Arg Ala Leu Met Gly Tyr Asn Asp Gln Val Gln Arg Pro

565 570 575

Ile Pro Leu Thr Pro Ala Asn Pro Ser Met Pro Pro Leu Pro Gln Gly

580 585 590

Ser Leu Thr Gln Glu Glu Phe Met Val Ser Met Val Thr Gly Leu Ala

595 600 605

Ser Leu Thr Ser Arg Thr Ser Met Gly Ile Leu Val Val Gly Gly Val

610 615 620

Val Trp Lys Ala Val Gly Trp Arg Leu Ile Ala Leu Ser Phe Gly Leu

625 630 635 640

Tyr Gly Leu Leu Tyr Val Tyr Glu Arg Leu Thr Trp Thr Thr Lys Ala

645 650 655

Lys Glu Arg Ala Phe Lys Arg Gln Phe Val Glu His Ala Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Gln Leu Val Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Cys Ser His Gln Val

675 680 685

Gln Gln Glu Leu Ser Gly Thr Phe Ala His Leu Cys Gln Gln Val Asp

690 695 700

Val Thr Arg Glu Asn Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Met Asn Lys Lys

705 710 715 720

Ile Glu Val Leu Asp Ser Leu Gln Ser Lys Ala Lys Leu Leu Arg Asn

725 730 735

Lys Ala Gly Trp Leu Asp Ser Glu Leu Asn Met Phe Thr His Gln Tyr

740 745 750

Leu Gln Pro Ser Arg

755

<210> 2

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgcagt gggagtccga gcctctgcgt cgtccgcttg ggacgcgccg gcggaggagt 60

ggcgcgcgga ggagtggcgc gctgagacgc cgctcgaagc gccgagtcgc ggggcagcag 120

aggcgtaagg agtaggcggg gcgagccggc tgggctcagg gtccaccagc tcacccgggt 180

cgaggggcaa tctgaggcga ctggtgacgc gcttatccac ttccctcctc ccgcctcccc 240

ctggggtggc gctcgctggt gacgtagtga gtgtgatggc cgccgcgagg ccgggaaggt 300

gaagcgcaat gtccctgctc ttctctcgat gcaactctat cgtcacagtc aagaaaaata 360

agagacacat ggctgaggtg aatgcatccc cacttaagca ctttgtcact gccaagaaga 420

agatcaatgg catttttgag cagctggggg cctacatcca ggagagcgcc accttccttg 480

aagacacgta caggaatgca gaactggacc ccgttaccac agaagaacag gttctggacg 540

tcaaaggtta cctatccaaa gtgagaggca tcagtgaggt gctggctcgg aggcacatga 600

aagtggcttt ttttggccgg acgagcaatg ggaagagcac cgtgatcaat gccatgctct 660

gggacaaagt tctgccctct gggattggcc acaccaccaa ttgcttcctg cgggtagagg 720

gcacagatgg ccatgaggcc tttctcctta ccgagggctc agaggaaaag aggagtgcca 780

agactgtgaa ccagctggcc catgccctcc accaggacaa gcagctccat gccggcagcc 840

tagtgagtgt gatgtggccc aactctaagt gcccacttct gaaggatgac ctcgttttga 900

tggacagccc tggtattgat gtcaccacag agctggacag ctggattgac aagttttgtc 960

tggatgctga tgtgtttgtg ctggtggcca actcagagtc caccctgatg cagacggaaa 1020

agcacttctt ccacaaggtg agtgagcgtc tctcccggcc aaacatcttc atcctgaaca 1080

accgctggga tgcatctgcc tcagagcccg agtacatgga ggaggtgcgg cggcagcaca 1140

tggagcgttg taccagcttc ctggtggatg agctgggcgt ggtggatcga tcccaggccg 1200

gggaccgcat cttctttgtg tctgctaagg aggtgctcaa cgccaggatt cagaaagccc 1260

agggcatgcc tgaaggaggg ggcgctctcg cagaaggctt tcaagtgagg atgtttgagt 1320

ttcagaattt tgagaggaga tttgaggagt gcatctccca gtctgcagtg aagaccaagt 1380

ttgagcagca cacggtccgg gccaagcaga ttgcagaggc ggttcgactc atcatggact 1440

ccctgcacat ggcggctcgg gagcagcagg tttactgcga ggaaatgcgt gaagagcggc 1500

aagaccgact gaaatttatt gacaaacagc tggagctctt ggctcaagac tataagctgc 1560

gaattaagca gattacggag gaagtggaga ggcaggtgtc gactgcaatg gccgaggaga 1620

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acttctcctc tgttccagtt gt 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgcttgaga ggggaagcat 20