一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用
阅读说明：本技术 一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用 (Dendrobium officinale salt inducible promoter proDoMYB75 and application ) 是由 何春梅 段俊 张明泽 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用。所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示,或为具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列,或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性且同样具有启动功能的DNA分子。本发明的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75能够特异地驱动外源基因在高盐诱导条件下在拟南芥的不同组织中表达,如叶和茎等,这对提高和改善植物的生长特性,尤其是改善植株的耐高盐性能具有重要的实践价值,对有效改良植物耐高盐性状具有重要的指导意义。(The invention discloses a dendrobium officinale salt inducible promoter proDoMYB75 and application thereof. The nucleotide sequence of the promoter is shown as SEQ ID NO.1, or the promoter has a nucleotide sequence which is complementary with the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO.1, or the promoter is a DNA molecule which has more than 75 percent of homology with the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO.1 and also has a starting function. The dendrobium officinale high-salt inducible promoter proDoMYB75 can specifically drive exogenous genes to express in different tissues of arabidopsis thaliana under the high-salt induction condition, such as leaves, stems and the like, has important practical value for improving the growth characteristics of plants, especially improving the high-salt resistance of the plants, and has important guiding significance for effectively improving the high-salt resistance of the plants.)
技术领域
：本发明涉及基因工程
技术领域
，具体涉及一种铁皮石斛盐诱导型的启动子proDoMYB75及其应用。背景技术
：在自然环境中，植物可能面对不利的环境条件，比如干旱、盐分胁迫、极端天气等不利的环境因子，造成植物生长发育的滞后、产量降低，甚至造成植物死亡。其中土壤盐碱化被认为是制约全球农作物产量和品质的关键因子，盐胁迫导致渗透胁迫、离子失衡，离子中毒和活性氧损害等复杂的植物生理和代谢的影响(Parida et al.2005)。
植物为了应对盐胁迫进化出各种响应机制以降低盐胁迫对自身的伤害。比如植物改变多种代谢途径，包括生产兼容性溶质以维持蛋白稳定、细胞结构和细胞渗透压。比如氨基酸中的脯氨酸，小分子糖如葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖都可以作为渗透调节物质(Krasensky et al.2012)。此外，一些抗氧化物质如黄酮类物质促进植物体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的清除。细胞对胁迫的应对策列包括调节膜系统、改变细胞壁结构和改变细胞周期及细胞分裂。
基因的表达调控参与植物的生长、发育以及各种环境的适应，启动子是启动和调节相关基因转录的顺式作用DNA片段，对基因的表达起到关键的作用。启动子含有两个重要区域，分别为RNA聚合酶II结合并启动基础水平转录的核心区域和包含多个顺式调控基序的远端区域，对基因的时空表达进行调控(Mithra et al.2017)。TATA-box是第一个被识别的真核核心启动子基序，位于转录起始位点(transcription start site，TSS)上游的约30bp处(Fickett and Hatzigeorgiou 1997)。增强子和沉默子则是启动子远端调控元件，可显著提高或抑制基因的转录水平。根据启动子对基因表达控制的性质，这些调控元件可分为组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异性异性启动子(tissue specificpromoter)，以及诱导型启动子(inducible promoter)。诱导启动子是指在某些环境因子的作用下，通过外部控制对相关基因提供精确的表达调控的启动子，它们有广泛的潜在应用。
发明内容
：本发明的第一个目的是提供一种铁皮石斛盐诱导型的启动子proDoMYB75，解决现有技术中的高盐环境引起植物生长发育异常、减产的问题。
本发明的发明人对植物耐盐性方面进行研究，并发现了驱动外源基因在高盐诱导条件下表达的启动子。
本发明的目的在于提供一种盐诱导型启动子，可使外源目的基因在高盐诱导下提高表达水平，对于植物在盐份适宜时的生长发育没有不利影响，具有非常重要的应用潜力。
本发明的铁皮石斛高盐诱导型的启动子proDoMYB75，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或为具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性且同样具有启动功能的DNA分子。
本发明首次发现、定位一个新的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75。本发明的高盐诱导型启动子proDoMYB75可以启动相关目的基因的表达，可以培育耐盐植物品种，可以应用于植物遗传改良，对植物盐胁迫的调控机制研究也具有重要意义。
因此，本发明的第二个目的是提供启动子proDoMYB75在启动目的基因表达中的应用。
优选，启动子proDoMYB75在盐诱导下启动目的基因表达中的应用。
本发明的第三个目的是提供启动子proDoMYB75培育耐盐植物品种中的应用。
所述的植物可以为铁皮石斛或拟南芥等植物。
本发明的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75能够特异地驱动外源基因在高盐诱导条件下在拟南芥的不同组织中表达，如叶和茎等，这对提高和改善植物的生长特性，尤其是改善植株的耐高盐性能具有重要的实践价值，对有效改良植物耐高盐性状具有重要的指导意义。
附图说明
：图1是qPCR分析铁皮石斛DoMYB75在盐胁迫(250mM NaCl)的表达。
图2是proDoMYB75的PCR产物电泳图。M：DNA marker，1：proDoMYB75片段。
图3是proDoMYB75::GUS转基因株系在盐胁迫下的GUS染色。一周大的小苗，胁迫处理24小时后进行GUS染色。
具体实施方式
：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1材料
1.1植物材料
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)组培苗，生长在1/2MS+质量分数0.1％活性炭+质量分数2％蔗糖+质量分数0.6％琼脂粉(pH 5.4)的培养基上,组培室条件为24±2℃、12小时光照。
2.方法
2.1铁皮石斛基因组DNA的提取
取铁皮石斛小苗液氮中研磨成粉状，转至2mL离心管中，加入700μL预热(65℃)的2×CTAB提取液，充分混匀，混合液于65℃水浴15min，每隔5min摇一次。取出混合液室温冷却，再加入等体积酚氯仿，振荡混匀，12000r/min离心15min。取上清，加入700μL氯仿再抽提一次，上清转至一新1.5mL离心管，加入0.6倍体积异丙醇，振荡混匀，于-20℃冰箱放置10min，12000r/min离心10min。弃上清，加入70％乙醇500μL，洗涤DNA沉淀两次，12000r/min离心30sec，用枪头进来吸干离心管中的酒精。室温晾5min，加入100μL 1×TE(含RNase A，20μg/mL)溶解DNA，37℃反应30min，以除去RNA。
取2μL DNA溶解液作琼脂糖凝胶电泳检测，余下放置-20℃冰箱保存备用。
2.2启动子proDoMYB75的克隆
本发明利用巢式PCR技术克隆启动子proDoMYB75序列。利用铁皮石斛全基因组测序结果设计两对引物PCR(F1:CATTGCTACCTGTAGGTTCC,R1：GAATTCGTGCAGTTTCAAGG；F2:CGATGTGGAACCAACATCCG,R2：TGAGAGGTTAGCAGAGGACC)，以铁皮石斛基因组DNA为模板，进行巢室PCR扩增。所用的酶为东洋彷高保真DNA聚合酶试剂盒(KOD FX)，具体操作参见说明书。第一次扩增的PCR产物稀释50倍作为模板，以F2/R2为引物进行第二次PCR，所使用的酶反应体系与第一次PCR相同。
2.3铁皮石斛RNA的提取
取1mL RNA提取buffer(100mM Tris-HCl pH 8.0，50mM EDTA，pH 8.0，500mMNaCl，1％SDS)于1.5mL离心管中，加入20uL的β-巯基乙醇，混匀，置于65℃保温待用。取约0.3g铁皮石斛小苗根茎叶样品，液氮下充分研磨，将粉末转移至上一步准备的RNA buffer中，快速混匀，65℃裂解20min。12000rpm离心3min，取上清于新的离心管中。加入等体积的水饱和酚(pH 4.5)，充分混匀，4℃、12000rpm离心5min，将上清转移到新的离心管中。加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，4℃、12000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中。加入等体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置10min。4℃、12000rpm离心10min，弃上清，用75％酒精洗涤沉淀两次。待干加入42μL DEPC ddH2O。使用TaKaRa公司的RNase-FreeDNase I去除RNA样品中的基因组DNA，具体步骤参考说明书进行。待基因组DNA被消化完全后，加450μL的DEPC水到反应离心管中并混匀，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀，4℃、12000rpm离心10min。取上清，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，4℃、12000rpm离心10min。取上清，加2.5倍体积无水乙醇混匀，-40℃沉淀30min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，用75％酒精洗涤沉淀两次。稍离心，用枪头尽量除去管中的乙醇。室温晾5min，加入40μL DEPC ddH2O。利用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度和纯度。
2.4荧光定量PCR(qPCR)
荧光定量PCR采用美国BIO-RAD公司iTaq Universl SYBR Green supermix反应试剂，PCR反应板和膜均采用美国BIO-RAD公司的产品。每个样品设3-4个技术重复，反应体系及反应程序按照说明书的操作步骤进行。反应在ABI 7500Real-time PCR仪上进行，反应程序为95℃预变性2min；95℃变性15sec,60℃退火及延伸1min，反应40个循环。所得数据使用ABI 7500Real-time PCR system软件进行处理，利用2-ΔΔCT方法(Livak and Schmittgen2001)计算相对表达量。DoMYB75的qRT-PCR引物为DoMYB75RTF:GGCGAGTGTAATGGAGTTTG，DoMYB75RTR：TCAAATGCAATTGTTAACCTCT。内参引物为ACTI NRTF：TCCCAAGGCAAACAGAGAAA，ACTINRTR：GGCCACTAGCATATAGGGAAAG。
2.5启动子proDoMYB75的序列分析
采用在线生物信息学软件PlantCARE对所获得的DNA片段进行启动子结构和顺式元件预测。
2.6结果
将铁皮石斛组培苗转移到1/2MS+质量分数2％蔗糖+质量分数0.6％琼脂粉+250mMNaCl(pH 5.7)培养基培养24h，在25±2℃，12-h光照/12-h黑暗条件下培养(NaCl)。以转移到1/2MS+质量分数2％蔗糖+质量分数0.6％琼脂粉(pH 5.7)的培养基上的铁皮石斛组培苗作为对照(Control)。分别提取根茎叶进行qPCR分析DoMYB75的表达水平，图1显示该基因在受到高盐处理后，叶片和茎中的表达量显著升高，尤其是叶片，上升倍数约20倍，而根的表达量没有显著差异，结果说明DoMYB75(其核苷酸序列入SEQ ID NO.2所示)在叶片和茎中可被盐诱导。说明该基因的启动子是盐诱导型启动子。利用巢式PCR克隆DoMYB75的启动子，命名为proDoMYB75，PCR电泳图如图2所示，大小为2050bp(如SEQ ID NO.1所示)。启动子元件分析发现，proDoMYB75含有36个-30bp左右的核心启动子转录起始元件(TATA-box)，48个启动子和增强子区域的共同顺式作用元件，多个光响应元件，与逆境胁迫有关的激素响应元件如ABA响应顺式作用元件和MeJA响应顺式作用元件。表明该片段包含完整的启动子结构，包括TATA-box、启动子和增强子区域的共同顺式作用元件和其它启动子顺式元件(表1)。
表1 proDoMYB75的顺式作用元件分析。
proDoMYB75的核苷酸序列如下：
acggatccccgggaattccgatgtggaaccaacatccgcaacgtgcggggtgcaactttttttttaaagtaaggatgcaaaataaacaatcactcatagcatgaccatgaactttacaatgtgtataaaaatctggaatattttcaaattcaactttttatatataaccaaaagattcagaaccaacccaattttccttcgcatgctttttagtgatatcaaccacaactaaaaccatagccatagaaggttgggtcttagatgcggttgcttggtcaatctaaagaggcctcctaaaaatagtgcccaatgcatgtaaaactcgtggattaaagaaatgcaaataaagattcaaaaagagatccaatttggcactatcaattattcttccttaatttcaaaaaaaggagtccattatttcaaaagacgcatttgacagttattgatttagtaagaccttctagcaaaaaaccgtactataatcaagatcattagagagctgaatagcaacatggagagaatacagtaaaccacgaagaacaaactagagaatttcaagttaccaaaaaaatgatggacataatctagattatgcctacgcctagaaaacttcccaactaatgtaaattgaaaaggtgaagcaagtttatgaaccttctcatctgacgaaagcatcgtaggaacacatttgaatatcgtaggagataattgagaaaaaatttcacctacggaggaagaccctggcaagacttaattctttgaaagatcgagaaggagatttttgcccttcagcatccaaactaaaaaagcctttctgtttaccttgcatttgagtcgaaatactaccccagtcaatcgatgatgacgacaattccatatcaaacctacccaaaacggctcagtagctagcactgaagagaacaaaatgacaatagaacaatggaacctgaagaaagaaacggagaaacagcagattacacgagaaaaggtgctcgaagggaggagaacgctagtttcgccatagacggtgcgactagggcaaatgatgtatttctatgcaagttcatagaatgattgttttatattatttaaaataatataattaataatttcctggtaaaccctaaacgatgtattctacaaatgtgtgcttattattcatcaagccataagtgattcaatggggggggggggggggggggatttagcaggacagttgtagtagaacgataacaaaatttcactcaacataaaggaccattttacgatttggctgaaggtgctgggtggttggtggtgcgggtataattctcttgagttagggttttttacagttttcctattatttggtgggctgacggtttttttgaggatgccttgcagatacttatacaagtggaacaaaaatgattgcagggatgcttttattgtcttagcatttcttttttttatataggggtcatttttgcaggaaagcggaactgaaaggtatcaagattaagtggcttctccttttttgggtgctgtcgcctcacagcccgtgttatgtcgtaggttcttttgaaacttgattttagttgaaggcgaagtattttgtattattgttcacgaacaaaaacactcgtactatattctcaatggtccaatggatccaaaaacaacaatttgaggcgggcattgaaacacgcccagttcatttccaccacttctgattatatgtcttctatcgcacaaaatgctttgtttcatgaatataatccaaaattatttgtgttaagaactttcaatggattgacaggccaataattatctattaaactaattttaagattctcttaatctagttttcaggcaatgcaacgctactgctatcttgttcaatagcttctttattttcaactcagctaaaatttggaggtaaagttaaagttaaaaaaacttaattagataatgttttaacggtcggctccctcaatcggcagagtatcacactctttgagctgtcagaaaaaaaatttcccttataaataggtcctctgctaacctctca
实施例2
2方法
2.1启动子proDoMYB75驱动GUS表达的载体构建及遗传转化
设计引用扩增启动子proDoMYB75并构建超表达载体，所用的高保真酶为东洋彷高保真DNA聚合酶试剂盒(KOD FX)，具体操作参见说明书。所用的引物为proDoMYB75-1391ZF：ACGGATCCCCGGGAATTCCGATGTGGAACCAACATCCG，proDoMYB75-1391ZR ACGA CGGCCAGTGAATTCTGAGAGGTTAGCAGAGGACC，下划线表示构建载体所用的接头，以铁皮石斛基因组DNA为模板，扩增获得启动子proDoMYB75片段。构建载体采用TaKaRa的In-Fusion试剂盒。同源重组反应体系如下：
50℃反应60min后立即放在冰上，可进行后续的转化实验，或-20℃保存待用。将连上目的片段的载体转化DH5α，涂在含有Kan(50mg/L)的LB固体培养板上，37℃倒置培养12h。待长出菌落，挑取单菌落在含有Kan(50mg/L)的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，后进行菌液PCR验证阳性重组子，引物为：proDoMYB75-1391ZF：ACGGATCCCCGGGAATTCCGATGTGGAACCAACATCCG，proDoMYB75-1391ZR：ACGACGGCCAGTGAATTCTGAGAGGTTAGCAGAGGACC。阳性克隆送至华大基因测序。构建成功的重组质粒，利用冻融法转入农杆菌菌株EHA105，采用花序侵染法转化拟南芥，鉴定阳性收获种子，得到T1代proDoMYB75::GUS拟南芥转基因。
2.2proDoMYB75::GUS转基因材料的盐胁迫处理
取适量T1代proDoMYB75::GUS拟南芥转基因种子于1.5mL离心管中，用现配的1％NaClO消毒10min。室温稍离心，弃上清，无菌水漂洗6次后播种在1/2MS+质量分数1.5％蔗糖+质量分数0.8％琼脂粉(pH 5.7)培养基中。4℃黑暗同步化至少2天后，移至培养室，在22℃±2℃，16-h光照/8-h黑暗条件下培养。将7-d小苗转移到1/2MS+质量分数1.5％蔗糖+质量分数0.8％琼脂粉+150mM NaCl(pH 5.7)培养基培养，以转移到1/2MS+质量分数1.5％蔗糖+质量分数0.8％琼脂粉(pH 5.7)的培养基上的小苗作为对照，小苗培养24h后进行GUS染色。
2.3GUS染色
采用中科瑞泰GUS染色试剂盒对转基因材料进行染色，染色操作参照说明书进行。在超景深数码体视镜(Leica DVM6)对染色的材料进行拍摄。
2.4结果
对proDoMYB75驱动的GUS转基因株系进行盐胁迫处理24h后进行GUS染色，相对与对照，转基因株系叶片和茎的颜色变色，说明在盐诱导下proDoMYB75驱动GUS基因的表达(图3)。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2050
<212> DNA
<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)
<400> 1
acggatcccc gggaattccg atgtggaacc aacatccgca acgtgcgggg tgcaactttt 60
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<211> 873
<212> DNA
<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)
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