一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法

文档序号：16749 发布日期：2021-09-21 浏览：19次 >En<

阅读说明：本技术 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法 (Method for creating temperature-sensitive male sterile plant ) 是由谢洪涛代晓娟于 2020-03-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法,包括降低所述植物植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性的步骤,以及一种将植物从不育转为可育的方法。另外本发明提供了Rboh基因或其编码蛋白的抑制剂在培育植物不育系、或制备培育植物不育系的试剂或试剂盒中的用途。(The invention discloses a method for creating a temperature-sensitive male sterile plant, comprising the step of reducing the expression or activity of a Rboh gene or its encoded protein in the plant, and a method for transforming a plant from sterile to fertile. In addition, the invention provides the application of the inhibitor of the Rboh gene or the coded protein thereof in cultivating a plant sterile line or preparing a reagent or a kit for cultivating the plant sterile line.)

一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法

技术领域

本发明涉及农业和生物

技术领域

，具体地，涉及一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法。

背景技术

活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是一类生物体有氧代谢的副产物，主要包括超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)、羟自由基(·OH)及过氧化氢(H₂O₂)，ROS具有双重功能：一方面，可以作为有毒的次生代谢物对体内正常分子产生破坏作用；另一方面，作为重要的信号分子参与生物体的生长和发。研究发现，ROS的来源包括质膜NADPH氧化酶、过氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH氧化酶介导产生的ROS最受关注。

雄性不育是指植物的雌性器官功能正常而雄性器官(退化、无花粉或花粉没有活力)丧失授粉功能的现象。不育系的雄性器官发育异常，不能自花受精结实；雌性器官发育正常，具有受精能力，可以接受外来花粉受精结实。雄性不育可根据控制基因不同分为：细胞核雄性不育、细胞质雄性不育、核-质雄性不育。利用雄性雄性不育系作为母本，恢复系作为父本，从而可以获得优质杂种。

雄性不育系在水稻育种中广泛使用，目前杂交水稻培育主要有三系法和两系法。三系杂交法包括保持系、恢复系、不育系，比如水稻的三系杂交育种过程为：先用不育系做母体和保持系做父本杂交保留雄性不育品系。再用不育系做母本和恢复系做父本杂交得到杂交种。该方法是我国推广杂交水稻三十年历史普遍采用的方法，目前仍然大量使用。由于三系法的育种程序和生产环节较为复杂，以致选育新组合的周期长、效率低、推广环节多、速度慢，同时种子成本高、价格贵。两系杂交水稻包括不育系和恢复系，不育系可受温度和光照的影响而恢复育性，是继三系法杂交水稻之后水稻遗传育种上的又一重大科技创新。与三系法杂交水稻相比，两系法杂交水稻具有显著的优越性：一是不育系与恢复系配组自由，选育优良组合的几率增大；二是不育系一系两用，免除了保持系，在种子生产程序上减少了一个环节，从而降低了种子生产成本。第二是组配自由，几乎任何品种都可以作为恢复系。三是由于光温敏不育核基因遗传与细胞质无关，可克服三系法不育系中细胞质的负效应。四是能紧跟常规稻的选育不发，开辟籼粳亚种件杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标。两系法的优势，使得开发光温敏型雄性不育系成为实现杂种优势的目标之一。

筛选可恢复育性的雄性不育系的控制基因，可快速、高效实现不育系的制备，并在不同物种之间推广使用。然而目前，已知控制植物雄性不育系的基因并不是很多，因此开发相关功能基因，对于快速选育制备雄性不育系，推进杂交育种优势的利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供控制植物雄性不育系的基因，从而快速选育制备雄性不育系，推进杂交育种优势的利用。

在本发明的第一方面，提供了一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述方法在至少在花药发育时期，优选植物开花期，生长环境最高温度≥25℃，优选≥28℃，优选≥29℃，优选≥30℃，优选≥31℃，优选≥32℃，优选≥33℃，优选≥34℃，优选≥35℃的条件下进行。

在另一优选例中，所述方法在至少在花药发育时期，优选植物开花期，生长环境最高温度范围为25-35℃，较佳地，26－32℃，更佳地，28-30℃。

在另一优选例中，所述方法在植物花药发育时期，优选开花期，控制生长环境温度波动范围为12℃-35℃，较佳地，16℃-30℃，更佳地，18℃-30℃，更佳地，20℃-30℃的条件下进行。

在另一优选例中，所述的Rboh基因为在植物花药发育过程中特异性表达的基因。

在另一优选例中，所述Rboh基因来自选自下组的一种或多种植物：十字花科、禾本科、豆科、茄科、伞形科、藜科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的Rboh基因来自选自下组的一种或多种植物：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、花生、谷子、藜麦、番茄、烟草、油菜、辣椒、棉花、白菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、洋葱、油麦菜、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴。

在另一优选例中，所述Rboh基因包括：水稻的OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE、或其组合；番茄的LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH、或其组合；拟南芥的AtRBOHE；优选的，所述的RboH基因包括水稻的OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE、或其组合；番茄的LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH、或其组合。

在另一优选例中，所述Rboh基因包括野生型Rboh基因和突变型Rboh基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)、功能增强和/或功能减弱的突变形式。

在另一优选例中，所述的突变型Rboh基因编码的多肽与野生型Rboh基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型Rboh基因包括与野生型Rboh基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型Rboh基因包括在野生型Rboh基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Rboh基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1－7任一所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:8-14任一所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:8-14任一所示序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地，≥75％，更佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％，如99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:8－14任一所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Rboh蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1－7任一所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:1－7任一所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控植物性状功能的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1－7任一所示氨基酸序列的同源性≥60％(较佳地≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％，如99％)，具有所述Rboh活性的多肽。

在另一优选例中，所述的“降低”是指将所述植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性降低满足以下条件：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；

其中，A1为所述植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同Rboh基因或其编码蛋白表达或活性。

在另一优选例中，所述降低植物植株中Rboh基因或其编码蛋白的方法包括：使Rboh基因的表达水平下降、和/或使Rboh基因的编码蛋白的活性下降。

在另一优选例中，所述的下降指与野生型Rboh基因或其编码蛋白的表达水平E0相比，所述植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，较佳地0-40％，较佳的0-30％，较佳的0-20％，较佳的0-10％，更佳的0-5％；和/或与野生型的Rboh基因或其编码蛋白的活性A0相比，所述植株中Rboh基因或其编码蛋白的活性A1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，较佳地0-40％，较佳的0-30％，较佳的0-20％，较佳的0-10％，更佳的0-5％。

在另一优选例中，所述的降低植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、基因编辑技术、自然诱变、人工诱变(包括物理、化学、生物方法等)、抑制剂(如小分子化合物、核酸分子(RNAi)、或其组合)、调节基因表达控制元件、或其组合。

在另一优选例中，所述表达控制元件包括顺式作用元件和反式作用因子。

在另一优选例中，所述基因编辑技术包括TALEN、ZIN、CRISPR。

在另一优选例中，所述的植物为两性花或雌雄同株植物。

在另一优选例中，所述植物包括双子叶植物和单子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科、禾本科、豆科、茄科、伞形科、藜科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、花生、谷子、藜麦、番茄、烟草、油菜、辣椒、棉花、白菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、洋葱、油麦菜、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：水稻、小麦、玉米、番茄、油菜、辣椒、棉花、大豆、或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物不育系有选自下组的一种或多种特征：

(1)雌雄同株植物中雌性器官萎缩、畸形或者消失。

(2)不能形成正常的小孢子发生组织；

(3)小孢子发生异常，形成不完善的、不能存活的、畸形的或败育的花；

(4)花粉不能成熟或无萌发能力；

(5)形成有活力的花粉但花药不开裂。

在另一优选例中，所述植物不育系为高温敏感型植物不育系。

在另一优选例中，所述植物不育系为高温敏感型雄性不育系。

在另一优选例中，所述植物不育系包括细胞核雄性不育。

在另一优选例中，所述高温为≥25℃，优选≥28℃，优选≥29℃，优选≥30℃，优选≥31℃，优选≥32℃，优选≥33℃，优选≥34℃，优选≥35℃。

在另一优选例中，所述高温为25-35℃，更佳地，26－32℃，更佳地，28-30℃。

本发明第二方面提供了一种Rboh基因或其编码蛋白的抑制剂的用途，用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。

本发明第三方面提供了一种恢复植物不育系的育性的方法，包括步骤：在低温条件下培育本发明第一方面所述的植物不育系。

在另一优选例中，所述的低温条件为生长环境最高温度＜25℃，优选≤24℃，优选≤23℃，优选≤22℃，优选≤21℃，优选≤20℃。

在另一优选例中，所述的低温条件为生长环境温度波动范围为12℃-24℃，较佳地，16℃-22℃，较佳地，18℃-22℃。

在另一优选例中，所述环境温度包括植物生长出苔时期的环境温度，优选花药发育时期的环境温度，优选开花期的环境温度。

在另一优选例中，所述的恢复育性包括植物可授粉产生于具有繁殖能力的种子。

本发明第四方面提供了一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤：在低温条件下，培养用本发明第一方面所述的方法培育的植物不育系。

在另一优选例中，所述的低温条件为生长环境最高温度＜25℃，优选≤24℃，优选≤23℃，优选≤22℃，优选≤21℃，优选≤20℃。

在另一优选例中，所述的低温条件为生长环境温度波动范围为12℃-24℃，较佳地，16℃-22℃，较佳地，18℃-22℃。

在另一优选例中，所述环境温度包括植物生长出苔时期的环境温度，优选花药发育时期的环境温度，更优选开花期的环境温度。

在另一优选例中，所述的恢复育性包括植物可授粉产生于具有繁殖能力的种子。

本发明第五方面提供了一种植物育种方法，包括以下步骤：将本发明第一方面所述的植物不育系与另外一种亲本植物进行杂交，获得杂交种。

本发明第六方面提供了一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤；将植株由不育转为可育的步骤；和/或维持植株可育并育种的步骤；

在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据本发明第一方面所述的方法培育的植物不育系进行维持；

在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用本发明第三方面或本发明第四方面所述的方法将植株由不育转为可育。

本发明第七方面提供了一种植物细胞，所述植物细胞和/或其发育成的植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性降低。

本发明第八方面提供了一种鉴定植物不育系或其繁殖材料的方法，包括步骤：检测植物样本中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，当所述植物样本中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性满足如下条件时，则所述植物为植物不育系或其繁殖材料：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；

其中，A1为所述植物样本中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性；A0为野生型同种类型植物样本中相同Rboh基因或其编码蛋白表达或活性。

在另一优选例中，当所述植物样本中Rboh基因或其编码蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，较佳地0-40％，较佳的0-30％，较佳的0-20％，较佳的0-10％，更佳的0-5％；和/或与野生型的Rboh基因或其编码蛋白的活性A0相比，所述植物样本中Rboh基因或其编码蛋白的活性A1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，较佳地0-40％，较佳的0-30％，较佳的0-20％，较佳的0-10％，更佳的0-5％时，则所述植物为植物不育系或其繁殖材料。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了拟南芥rbohe突变体在18℃-30℃以及20℃-22℃的变温条件下的种子生长情况。

图2显示了拟南芥rbohe突变体在18℃-30℃以及20℃-22℃的变温条件下的花粉产生情况。

图3显示了拟南芥rbohe突变体在18℃-30℃以及20℃-22℃的变温条件下的花粉发育情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，对于某些特定的植物不育系，通过调控Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性，可以调控所述植株的育性，实现不育性与育性之间进行可控的转换。本发明人还开发了相应的培育植物不育系等多种在农业育种等方面有广泛应用价值的技术。在此基础上完成了本发明。

Rboh基因

Rboh即植物NADPH氧化酶又称呼吸爆发氧化酶(Respiratoryburstoxidasehomologue，Rboh)，是哺乳动物巨噬细胞NADPH氧化酶催化亚基gp91^phox的同源物。植物NADPH氧化酶包含NADPH结合结构域、FAD结合结构域以及6个保守的跨膜结构域，这与哺乳动物的gp91^phox的保守结构域一致。而与哺乳动物不同的是所有植物Rboh蛋白都包含300个氨基酸大小的N末端延长区，该区域含有2个保守的Ca2+结合EF手性结构。NADPH氧化酶在不同类型的细胞中特定区域的定位方式，能使其在细胞特定的区域产生ROS，发挥特殊的生物学功能。

水稻中的OsRbohA为植物中第一个克隆的Rboh基因，随后从拟南芥、马铃薯、番茄、烟草等多种作物中克隆出Rboh基因。研究表明，植物中Rboh基因一般以基因家族的形式存在，拟南芥基因组中包括10个Rboh基因(AtRbohA-J)，水稻中包含7个Rboh基因(AtRbohA-G)。本发明中所述Rboh基因是指与植物花粉发育相关的Rboh亚型基因，可以是一个或多个Rboh亚型基因，也可以是多个亚型基因的组合。

适用于本发明的Rboh基因或其编码蛋白的植物来源没有特别限制，可以来自任何植物品种，本领域技术人员公知，不同作物中Rboh家族含有数量不等的亚型基因，本发明所述的Rboh基因优选与植物雄性器官(如花药、花粉)发育相关或在雄性器官发育过程中特异表达或在雄性器官相关组织中特异表达的Rboh亚型基因。代表性的植物及功能基因包括，但并不限于：

水稻的OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE、或其组合；番茄的LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH、或其组合；拟南芥的AtRBOHE；优选的，所述的RboH基因包括水稻的OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE、或其组合；番茄的LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH、或其组合。

在一优选实施方式中，OsRBOHA的蛋白序列如SEQ ID NO.:1所示，OsRBOHB的蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示，OsRBOHE的蛋白序列如SEQ ID NO.:3所示，AtRBOHE的蛋白序列如SEQ ID NO.:4所示，LeRBOHB的蛋白序列如SEQ ID NO.:5所示，LeRBOHE的蛋白序列如SEQID NO.:6所示，LeRBOH的蛋白序列如SEQ ID NO.:7所示；

OSRBOHA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示，OSRBOHB的核苷酸序列如SEQ IDNO.:9所示，OSRBOHE的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，LeRBOHB的核苷酸序列如SEQ IDNO.:11所示，LeRBOHE的核苷酸序列如SEQ ID NO.:12所示，LeRBOH的核苷酸序列如SEQ IDNO.:13所示，AtRBOHE的核苷酸序列如SEQ ID NO.:14所示。

如本文所用，术语“本发明的Rboh基因”、“NADPH氧化酶的基因”、“呼吸爆发氧化酶的基因”可互换使用，均指来源于植物(如拟南芥、水稻、番茄)的Rboh基因或其变体。在一优选实施方式中，本发明的Rboh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8-14所示。所述基因的变体可以通过核苷酸的插入、替换或删除，进行随机或定点突变等来获得。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:8-14)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控植物(如拟南芥、水稻、番茄)的性状(比如通过降低该基因或其编码蛋白的表达或活性而培育植物不育系)。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

在本发明中，SEQ ID NO.:8-14中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸，生成SEQ ID NO.:8-14的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:8-14的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:1-7所示的氨基酸序列。

另外，“在SEQ ID NO.:8-14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:8-14所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于拟南芥、水稻、番茄，但是来源于其它类似的植物(尤其是与拟南芥、水稻或番茄属于同一科或属的植物或与拟南芥、水稻或番茄的同源性比较高的其他科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ IDNO.:8-14所示)具有一定同源性(保守性，如具有50％以上，如60％，70％,80％，85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的Rboh的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列，比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:8-14所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的Rboh核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

Rboh基因编码的多肽

如本文所用，术语“本发明多肽”、“Rboh基因的编码蛋白”、可以互换使用，都是指来源于植物的Rboh的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1－7所示。

本发明涉及一种调控植物性状的Rboh多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1－7所示。本发明的多肽能够有效调控植物(如拟南芥、水稻或番茄)的性状(比如通过降低Rboh蛋白的活性，从而培育植物不育系)。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1－7所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“调控植物或农作物(如拟南芥、水稻或番茄)的性状(比如通过降低Rboh蛋白的活性，从而培育植物不育系)”。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有Rboh蛋白活性的Rboh蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Rboh蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:1－7所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:1－7的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

植物不育系及其培育的方法

本发明还提供一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性。

本发明所述的方法中，还进一步包括控制植物生长过程中的环境温度。所述方法中至少在花药发育时期，优选植物开花期，生长环境最高温度≥25℃，优选≥28℃，优选≥29℃，优选≥30℃，优选≥31℃，优选≥32℃，优选≥33℃，优选≥34℃，优选≥35℃。或者，在植物花药发育时期，优选开花期，控制生长环境温度波动范围为12℃-35℃，较佳地，16℃-30℃，更佳地，18℃-30℃，更佳地，20℃-30℃。

所述的植物不育系是指雌性器官发育正常而其雄性器官(如花药、花粉)不能正常发挥功能的植物品系。优选地，本发明所述的植物不育系为高温敏感型雄性不育，即植物的雄配子发育情况受到环境温度的影响。在高温条件下生长，雄配子活性降低或失去活性，而无法正常授粉。本发明所述的植物不育系(或材料)包括植物细胞、组织、繁殖材料、苗、成熟植株等。

在一优选实施方式中，本发明的Rboh蛋白可包含SEQ ID NO:1－7任一所示氨基酸的序列。然而，不限于此，因为根据植物种类或品种，该蛋白的氨基酸序列可能有所不同。换言之，其可以是突变型蛋白或人工变体，所述突变型蛋白或人工变体的氨基酸序列在SEQID NO:1－7任一所示氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通过弱化该蛋白的活性而培育植物不育系。本文的“几个”可根据蛋白中氨基酸残基的三维结构的位置或类型而有所不同，但尤其表示2-20，特别是2-10，更特别是2-5。此外，根据植物的个体或种类，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工变体或天然突变所致的那些。

可通过以下方式降低(弱化)本发明Rboh蛋白的活性：1)编码该蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，或替换一个或多个核苷酸或核苷酸片段，或插入一个或多个核苷酸或核苷酸片段，2)修饰表达调控序列以降低该多核苷酸的表达，3)修饰染色体上的序列或4)它们的组合。

在上文中，可利用染色体基因插入的载体，通过将编码内源性靶蛋白的多核苷酸替换为标记基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸来实施编码蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的长度可根据多核苷酸的种类而有所不同，但尤其是2bp-300bp，更特别是2bp-100bp，更特别是1bp-5bp。可利用突变技术实现单个或多个核苷酸的替换，利用同源重组技术实现核苷酸片段的插入或替换。

还可通过以下方式修饰表达调控序列来降低多核苷酸表达：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在表达调控序列中诱导突变以进一步弱化表达调控序列的活性，或将表达调控序列替换成活性更低的序列。表达调控序列包括编码启动子的序列、操纵子序列、核糖体结合位点和控制转录和翻译终止的序列。

此外，可通过以下方式修饰染色体上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在序列中诱导突变以进一步弱化该序列的活性，或将多核苷酸序列替换成经修饰的序列以便获得更弱的蛋白活性。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Rboh蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Rboh蛋白。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码Rboh蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Rboh蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Rboh蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用GDSL蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GDSL蛋白的转录产物。

本发明进一步还提供了恢复本发明所述植物不育系育性的方法，包括控制不育系繁殖材料在生长过程中的环境温度的步骤。至少在植物花药发育时期，优选开花期的最高环境温度＜25℃，优选≤24℃，优选≤23℃，优选≤22℃，优选≤21℃，优选≤20℃，或者在花药发育时期，优选开花期，控制生长环境温度波动范围在12℃-24℃，较佳地，16℃-22℃，较佳地，18℃-22℃。所述的育性恢复，是指繁殖材料在生长过程中，其雄配子可以基本正常发育，与雌配子(恢复系)受精产生种子，所述的种子仍然保有高温不育的特性。

本发明所述的温度范围，是农作物的生长过程中的温度波动范围，波动方式可以是瞬间升温或降温，也可以是梯度缓慢升温或降温。优选地，其模拟或等同于自然界温度变化范围和规律，在一定时间段内完成梯度升温和降温，例如每小时升温或降温0.5℃-5℃，具体的如0.5℃或1℃或1.5℃或2℃或3℃或4℃等，变温模式例如可以是在早晨六点温度为16℃，中午12时温度升至22℃，下午14时温度降至20℃，下午六点降至16℃。优选地，在最高温度(25-35℃，优选26-32℃，更优选28-30℃)时，保持1-3h，优选2h，花粉发育败育，而对植物生长没有影响。本发明所述的温度范围可上下波动±5℃，优选±3℃，而不会对发明技术效果产生太大影响。另外，不同农作物所适应的低温和高温有所不同，基于作物的生长发育特性，本领域技术人员适宜的上下调整本发明所述的温度范围同样可以获得本发明的技术效果，基于不同作物生长特性所获得技术方案同样包含在本发明范围内。

本发明还提供了一种鉴定雄性不育系或其繁殖材料的方法，包括检测Rboh基因或其蛋白的表达或活性的步骤。所述繁殖材料包括愈伤组织、根、茎、叶、花、种子等。所述的鉴定方法可以本领域常用的基因和蛋白检测方法，包括Northern杂交、RT-PCR(reversetranscribed PCR)、生化反应检测法、免疫学检测法等。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了一种通过降低植物中Rboh基因或其编码蛋白的表达或活性来创制植物不育系的方法，利用该方法可极大丰富雄性不育资源的多样性。

(b)提供了一种通过在低温条件下培养本发明的不育系，从而使不育植株的性状转化为可育的方法,使不育系可以保种，降低了种子生产成本。

(c)通过本发明获得的雄性不育植株，可用作两系杂交制种中的母本，在杂交育种中保持杂种优势。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1敲除OsRBOH对水稻发育的影响

1、基因编辑位点的设计

设计同时敲除OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE的基因编辑载体，分别选取OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE基因的靶向位点，针对靶标位点设计sgRNA序列：

OsRBOHA：TCCGACTTCGCCGAATGCAT(SEQ ID NO.:15)

OsRBOHB：GCAATCTGGGCTCGAGCAAC(SEQ ID NO.:16)

OsRBOHE：GGTGAGGCAGTTCGCGTCGA(SEQ ID NO.:17)

2、基因编辑载体构建

A)以SF55-scaffold-tRNA质粒为模版，用正/反向引物tRNA-gRBOHA-F/tRNA-RBOHB-R对目标片段进行扩增，获得PCR产物(长度约230bp,引物退火温度为58)。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸10s，35个循环，72℃后延伸5分钟

B)以SF55-scaffold-tRNA质粒为模版，用正/反向引物gRBOHB-gRNA-F/tRNA-gRBOHE-gRNA-R对目标片段进行扩增，获得PCR产物(长度约230bp,引物退火温度为58)。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸10s，35个循环，72℃后延伸5分钟

C)用BsaI酶切CRISPR-Cas9载体载体(35S-OsU6-tRNA)

D)分别将各个片段进行跑胶回收

E)将克隆片段和载体酶切回收片段进行同源重组

PCR反应条件为：50℃30min

F)转化大肠杆菌，挑单克隆M13F/T6-R测序验证片段成功连入载体。

3、遗传转化

(A)上述构建质粒直接转化农杆菌EHA105：

(1)农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，之后冰浴30min,放入液氮中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min，冰上放置5min

(2)取出离心管，加入700ul YEP培养基，振荡培养2～4hr。

(3)取出菌液与含相应抗生素的YEP培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养,2天左右菌落可见。

(B)水稻转基因：

(1)愈伤组织诱导，去壳种子用NaClO浸泡消毒，无菌水冲洗后接种于NB诱导培养基中，在培养箱中培养10–15天。

(2)愈伤组织继代，将诱导出的愈伤组织用单面刀切下，放入继代培养基，相同条件下培养。

(3)农杆菌浸染与抗性愈伤组织筛选，将转入目的载体的农杆菌EH105菌株扩繁，后浸泡状态较好的愈伤组织。

(4)吸出或倒掉菌液，将愈伤组织放在箱暗培养48–72h。

(5)共培养结束后的愈伤组织用Carbenicillin抗性的无菌水浸泡冲洗，以除去农杆菌。

(6)愈伤组织吸干液体，将其接种于含抗生素的筛选培养基上，光照培养两周。

(7)愈伤组织分化培养，挑选生长旺盛的愈伤组织(抗性愈伤组织)转移到含抗生素的分化培养基上。一周时间内大部分愈伤组织快速生长，并在愈伤组织表明出现绿点，变绿的愈伤组织会快速分化出幼苗。

4、植株培养及突变体筛选

(1)将分化出的健壮幼苗转移至含抗生素的生根培养基中生根培养一周，室温练苗2-3天后，温室基质栽培15-20天后移栽入大田。

(2)取每株植物的叶片，提取基因组DNA，在靶向位点两侧设计引物。扩增得到的片段进行Sanger测序，确定每株植物的基因型。

(3)检测OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE基因突变类型，在T0代筛选到敲除掉OsRBOHA、OsRBOHB、OsRBOHE基因的突变类型，并经过4-5代的不断扩繁，不断增加突变类型群体。

(4)在不同温度下处理突变体，观察在高温情况下突变体的育性。

5、实验结果

高温情况下突变体水稻的花粉相对野生型出现败育现象，不能正常授粉。

实施例2敲除LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH基因对番茄发育的影响

1、基因编辑位点设计

设计同时敲除LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH的基因编辑载体，分别选取LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOH基因的靶向位点，针对靶标位点设计sgRNA序列：

LeRBOHE：TCTAGCAAGTAATCCGTCTT(SEQ ID NO.:18)

LeRBOHB：TAAGCACAACCACTGTCGAC(SEQ ID NO.:19)

LeRBOH：TAGCTAGCAAGCTCGAAAAG(SEQ ID NO.:20)

2、CRISPR-Cas9基因编辑工具的构建

A)以SF55-scaffold-tRNA质粒为模版，用正/反向引物gRBOHE-F/gRBOHB-R对目标片段进行扩增，获得PCR产物(长度约230bp,引物退火温度为58)。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸10s，35个循环，72℃后延伸5分钟

B)以scaffold-tRNA质粒为模版，用正/反向引物gRBOHB-F/gRBOH-R对目标片段进行扩增，获得PCR产物(长度约230bp,引物退火温度为58)。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸10s，35个循环，72℃后延伸5分钟

C)用BsaI酶切CRISPR-Cas9载体载体(35S-AtU6-tRNA)

D)分别将各个片段进行跑胶回收

E)将克隆片段和载体酶切回收片段进行同源连接

PCR反应条件为：50℃30min

F)转化大肠杆菌，挑单克隆M13F/T6-R测序验证片段成功连入载体。

3、载体遗传转化

A)上述构建质粒直接转化农杆菌EHA105：

(1)农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，之后冰浴30min,放入液氮中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min，冰上放置5min。

(2)取出离心管，加入700ul YEP培养基，振荡培养2～4hr。

(3)取出菌液与含相应抗生素的YEP培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养,2天左右菌落可见。

B)番茄转基因：

(1)无菌苗获得：75％乙醇消毒30-60s，无菌水冲洗1-3次，再用(有效氯1％)NaClO消毒15min，无菌水冲洗5次。用无菌水浸种6h后播种与种子培养基。25℃暗培养2-3d后转移至光下培养。

(2)外植体预处理：待子叶完全展开，第一真叶微露时，将子叶剪成5mm见方的叶片，置于预培养基中，25℃暗培养2d。

(3)农杆菌活化与菌液制备：28℃摇菌培养至OD600＝0.6-0.8。离心后，用等体积的侵染液重悬菌体。

(4)侵染与共培养：侵染15min，用无菌滤纸吸干多余菌液后，置于共培养培养基上，25℃暗培养2d。

(5)筛选培养：子叶转到A2抗性培养基上。前2次继代每5d左右继代一次，后期每14d左右继代一次。

(6)分化培养：愈伤形成后，将其转移到A3培养基上诱导出芽成苗。每14d左右继代一次。

4、植株培养及突变体筛选

(1)待分化出的幼苗长至1-2cm时，将幼苗切下，转移至生根培养基中。待幼苗长出根后取样检测。

(2)取每株植物的叶片，提取基因组DNA，在靶向位点两侧设计引物。扩增得到的片段进行Sanger测序，确定每株植物的基因型。

(3)检测LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOHA基因突变类型，在T0代筛选到敲除掉LeRBOHE、LeRBOHB、LeRBOHA的突变类型，并经过4-5代的不断扩繁，不断增加突变类型群体。

(4)在不同温度下处理突变体，观察在高温情况下突变体的育性。

5、实验结果

高温情况下突变体番茄的花粉相对野生型出现败育现象，不能正常授粉。

实施例3拟南芥rboh突变对植物发育的影响

获取拟南芥呼吸爆发过氧化物酶基因T-DNA插入导致的功能缺失突变体rbohe，在不同温度条件下进行处理，获得温度敏感型雄性不育植株。

本研究所用的T-DNA插入突变体rbohe(SALK_150096C)是从ABRC获得，背景为Col-0生态型。

本实验中拟南芥材料种植方法如下：

(1)拟南芥Col-0和突变体rbohe种子表面消毒，铺在1/2MS培养基上。4℃低温春化3d，转移到20-22℃长光照(16h)条培养箱培养4-5d。

(2)将培养皿中的幼苗移栽到已浇绿肥土壤中，转移到温室中进行培养，用塑料薄膜保湿，同时在塑料薄膜上剪开少数透气孔。

(3)一周左右去掉塑料薄膜，每周浇一次营养液，待植物抽薹。

(4)将一部分快要抽薹的Col-0和突变体rbohe放在变温光照培养箱中，设置温度如下：

时间	温度	照明
			9:00	22℃	光照
12:00	26℃	光照
			14:00	30℃	光照
16:00	26℃	光照
			19:00	22℃	光照
22:00-9：00	18℃	黑暗

(5)剩余的拟南芥放在20-22℃光照条培养箱继续生长。

(6)亚历山大染色观察花粉发育：取尚未散粉的拟南芥花药(花苞露白时期)，浸于亚历山大染液中，室温放置4-8小时，显微镜观察照相。

(7)继续放在不同的温度下处理，等到拟南芥结实之后观察结实率。

5、实验结果

(1)拟南芥rbohe突变体植株在18℃-30℃的连续变化的温度条件下不能结种子，当温度降低至20℃-22℃的变温条件下可以正常结种子，而野生型在在两个条件下都可以正常结种子(参见图1)。

(2)亚历山大染色显示拟南芥rbohe突变体在18℃-30℃的连续变化的变温条件下不能产生正常花粉，当温度降低至20℃-22℃的变温条件下可以产生正常花粉(参见图2)。

(3)扫描电镜结果显示拟南芥rbohe突变体在18℃-30℃的连续变化的变温条件下花粉败育，当温度降低至20℃-22℃的变温条件下可以产生正常花粉(参见图3)。

实验结论

本发明的研究发现，降低、抑制或敲除植物花药中特异表达的呼吸爆发过氧化物酶基因RBOH，可使植物在高温条件下表现为雄性不育，用做亲本制备杂交种。在低温下又可恢复育性，正常结种子。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法

<130> P2020-0009

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 943

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Arg Gly Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Arg Trp Gly Ser Ala Gly

1 5 10 15

Thr Thr Pro Arg Ser Leu Ser Thr Gly Ser Ser Pro Arg Gly Ser Asp

20 25 30

Asp Arg Ser Ser Asp Asp Gly Glu Glu Leu Val Glu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ala Arg

65 70 75 80

Gly Glu Leu Thr Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser Arg Ser

85 90 95

Pro Ser Ile Arg Arg Ser Ser Ser His Arg Leu Leu Gln Phe Ser Gln

100 105 110

Glu Leu Lys Ala Glu Ala Met Ala Arg Ala Arg Gln Phe Ser Gln Asp

115 120 125

Leu Thr Lys Arg Phe Gly Arg Ser His Ser Arg Ser Glu Ala Gln Ala

130 135 140

Pro Ser Gly Leu Glu Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg Gln

145 150 155 160

Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Gly Ala His Lys Ala Leu Arg

165 170 175

Gly Leu Arg Phe Ile Ser Ser Asn Lys Ala Asn Asn Ala Trp Met Glu

180 185 190

Val Gln Ala Asn Phe Asp Arg Leu Ala Arg Asp Gly Tyr Leu Ser Arg

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Glu Cys Ile Gly Met Thr Glu Ser Lys Glu Phe Ala

210 215 220

Leu Glu Leu Phe Asp Thr Leu Ser Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Asp

225 230 235 240

Thr Ile Asn Lys Asp Glu Leu Arg Glu Ile Trp Gln Gln Ile Thr Asp

245 250 255

Asn Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe Glu Met Val Asp Lys

260 265 270

Asn Ala Asp Gly Arg Ile Thr Glu Ala Glu Val Lys Glu Ile Ile Met

275 280 285

Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu

290 295 300

Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Gly Leu Gly

305 310 315 320

Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr

325 330 335

Tyr Met Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu Ser

340 345 350

Gln Asn Leu Ala Gly Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ile Arg Lys Ile Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ser Tyr Tyr Phe Glu Asp Asn Trp Lys Arg Leu Trp Val

370 375 380

Leu Ala Leu Trp Ile Gly Ile Met Ala Gly Leu Phe Thr Trp Lys Phe

385 390 395 400

Met Gln Tyr Arg Asn Arg Tyr Val Phe Asp Val Met Gly Tyr Cys Val

405 410 415

Thr Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Leu Asn Met Ala Ile

420 425 430

Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser Thr

435 440 445

Arg Ala Ala Arg Ala Leu Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys

450 455 460

Thr Ile Ala Ala Ala Ile Val Val Gly Ile Ile Leu His Ala Gly Asn

465 470 475 480

His Leu Val Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile Lys Ser Ser Asp Glu Lys

485 490 495

Tyr Ala Pro Leu Gly Gln Tyr Phe Gly Glu Ile Lys Pro Thr Tyr Phe

500 505 510

Thr Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Ile Thr Gly Val Ile Met Val Val

515 520 525

Cys Met Ile Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg Arg Ser

530 535 540

Leu Val Lys Leu Pro Arg Pro Phe Asp Lys Leu Thr Gly Phe Asn Ala

545 550 555 560

Phe Trp Tyr Ser His His Leu Phe Ile Ile Val Tyr Ile Ala Leu Ile

565 570 575

Val His Gly Glu Cys Leu Tyr Leu Ile His Val Trp Tyr Arg Arg Thr

580 585 590

Thr Trp Met Tyr Leu Ser Val Pro Val Cys Leu Tyr Val Gly Glu Arg

595 600 605

Ile Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Val Arg Leu Leu Lys

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675 680 685

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Ile Ile Leu Leu Trp Leu Leu Ala Met Ile Gly Leu Phe Ile Trp Lys

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Ile Leu Met Thr Ile Ala Phe Ile Leu Ala Thr Arg Arg Phe Arg Arg

245 250 255

Ser Val Pro Lys Leu Pro Thr Pro Leu Asn Arg Leu Thr Gly Phe Asn

260 265 270

Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Leu Ala Phe Val Tyr Ile Leu Leu

275 280 285

Leu Leu His Gly Thr Phe Leu Phe Phe Val His Lys Trp Tyr Gln Lys

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Thr Thr Trp Met Tyr Ile Ser Ile Pro Leu Ile Leu Tyr Ile Ala Glu

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Arg Thr Leu Arg Thr Trp Arg Ser Glu Asp Tyr Ala Val Lys Ile Leu

325 330 335

Lys Val Ser Val Leu Pro Gly Asp Val Leu Ser Leu Ile Met Ser Lys

340 345 350

Pro Ala Gly Phe Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Ile Phe Leu Gln Cys

355 360 365

Pro Thr Ile Ser Ser Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala

370 375 380

Pro Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Val Tyr Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp

385 390 395 400

Thr Lys Glu Leu Lys Arg Val Phe Thr Glu Ile Pro Ala Cys Leu Val

405 410 415

Gly Arg Ala Lys Phe Glu Glu Gln Glu Asn Val Asp Gln Arg Gly Leu

420 425 430

Pro Arg Leu Leu Val Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr

435 440 445

Gln Asn Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr

450 455 460

Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Asn Asn Thr Arg Ala Asp

465 470 475 480

Glu Asn Val Asp Ser Asn Thr Glu Thr Ser Ala Ser Asp Asp Ser Trp

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

Ser Leu Glu Trp Phe Lys Gly Val Met Asn Glu Val Ala Glu Met Asp

530 535 540

His Lys Gly Gln Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu

545 550 555 560

Glu Gly Asp Ala Arg Ser Thr Leu Ile Thr Met Leu Gln Ala Leu Asn

565 570 575

His Ala Lys His Gly Val Asp Ile Leu Ser Gly Thr Lys Val Arg Thr

580 585 590

His Phe Ala Arg Pro Lys Trp Thr Glu Val Phe Lys Arg Ile Ala Leu

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<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

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Asp Ala Arg Leu Gln Ile Phe Phe Asp Met Ala Asp Ser Asn Gly Asp

180 185 190

Gly Lys Ile Thr Arg Asp Glu Val Gln Glu Leu Ile Met Leu Ser Ala

195 200 205

Ser Ala Asn Lys Leu Ser Lys Leu Lys Glu Arg Ala Ala Glu Tyr Ala

210 215 220

Ser Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Cys Leu Gly Tyr Ile Glu

225 230 235 240

Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Arg Asp Asn Tyr Met Thr

245 250 255

Tyr Ser Arg Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Gly Trp Gly Gln Asn Leu

260 265 270

Gly Thr Leu Asn Lys Thr Lys Asn Leu Val Lys Arg Ala Ser Tyr Ala

275 280 285

Phe Lys Cys Leu Val Leu Asp Asn Trp Gln Arg Gly Trp Ile Leu Leu

290 295 300

Leu Trp Val Met Val Met Ala Val Leu Phe Thr Trp Lys Phe Leu Gln

305 310 315 320

Tyr Arg Gln Arg Ala Ala Phe Gln Val Met Gly Tyr Cys Leu Ala Thr

325 330 335

Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Leu Asn Met Ala Leu Ile Leu

340 345 350

Leu Pro Val Cys Arg Asn Ile Leu Thr Trp Leu Arg Ser Thr Arg Ala

355 360 365

Lys Leu Leu Leu Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys Val Lys

370 375 380

Cys Thr Gln Thr Glu Tyr Ile Val Gln His Pro Arg Ile Phe Leu Thr

385 390 395 400

Met Leu Phe Gln Leu Gln Ile Ile Ala Tyr Ala Ile Gly Val Gly Ile

405 410 415

Leu Leu His Ala Gly Asn His Leu Ala Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile

420 425 430

Asn Ser Ser Pro Glu Lys Phe Ala Leu Ile Ala Ser Asp Phe Asp Asn

435 440 445

Val Lys Pro Thr Tyr Lys Ser Leu Leu Thr Gly Ile Glu Gly Val Thr

450 455 460

Gly Ile Ala Met Val Ile Leu Met Ala Ile Val Phe Thr Leu Ala Thr

465 470 475 480

Arg Thr Phe Arg Arg Asn Val Leu Lys Leu Pro Pro Pro Phe Ser Arg

485 490 495

Leu Thr Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Leu Ala Val

500 505 510

Val Tyr Val Leu Leu Leu Val His Gly Thr Phe Leu Phe Leu Val His

515 520 525

Gln Trp Trp Gln Lys Thr Thr Trp Met Tyr Ile Ser Met Pro Leu Leu

530 535 540

Leu Tyr Val Ala Glu Arg Ser Leu Arg Thr Cys Arg Ser Glu His Tyr

545 550 555 560

Ala Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Leu Pro Gly Asp Val Phe Ser

565 570 575

Leu Thr Met Ser Lys Pro Asn Ser Phe Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr

580 585 590

Ile Phe Leu Gln Cys Pro Thr Ile Ser Ser Phe Glu Trp His Pro Phe

595 600 605

Ser Ile Thr Ser Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Val His Ile Arg

610 615 620

Met Val Gly Asp Trp Thr Asn Glu Leu Lys Arg Val Phe Thr Glu Asp

625 630 635 640

Asp Ser Ser Ala Cys Glu Ile Gly Arg Ala Lys Phe Arg Glu Arg Gly

645 650 655

Asn Val Asp Gln Arg Gly Leu Pro Arg Leu Leu Val Asp Gly Pro Tyr

660 665 670

Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Gln Asn Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val

675 680 685

Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu

690 695 700

Leu Asn Asn Ser Arg Ser Glu Glu Leu Asp Ser Thr Thr Glu Thr Ser

705 710 715 720

Ala Ser Asp Asp Ser Trp Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ser Met Ala Ser

725 730 735

Thr Gly Lys Lys Lys Ser Leu Arg Thr Lys Ser Ala His Phe Tyr Trp

740 745 750

Val Thr Arg Glu Pro Gly Ser Phe Glu Trp Phe Lys Gly Val Met Asn

755 760 765

Glu Met Ala Glu Ile Asp His Lys Gly Leu Ile Glu Met His Asn Tyr

770 775 780

Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Thr Leu Ile Thr

785 790 795 800

Met Val Gln Ala Leu Asn His Ala Lys His Gly Val Asp Ile Leu Ser

805 810 815

Gly Thr Gln Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Lys Glu Val

820 825 830

Phe Asn Lys Ile Ala Ser Lys His Pro Tyr Ser Thr Val Gly Val Phe

835 840 845

Tyr Cys Gly Leu Pro Ala Leu Ala Lys Glu Leu Lys Lys Leu Ser Gln

850 855 860

Glu Leu Thr Tyr Lys Thr Ser Thr Arg Phe Glu Phe His Lys Glu Tyr

865 870 875 880

Phe

<210> 7

<211> 865

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 7

Met Glu Ile Glu Asn Thr Thr Asp Ser Val Arg Gly Ser Arg Val Gly

1 5 10 15

Phe Ser Gly Ser Leu Val Ser Gly Lys Lys Ser Ala Arg Phe Lys Asp

20 25 30

Asp Glu Ser Tyr Val Glu Ile Thr Leu Asp Val Arg Asp Asp Ser Val

35 40 45

Leu Val Gln Asn Ile Lys Gly Ala Asp His Glu Ala Ala Leu Leu Ala

50 55 60

Ser Lys Leu Glu Lys Arg Pro Asn His Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ser

65 70 75 80

Phe His Leu Lys Gln Val Ser Lys Glu Leu Lys Arg Met Thr Ser Ser

85 90 95

Asn Lys Phe Gln Lys Ile Asp Arg Ser Lys Ser Gly Ala Ala Arg Ala

100 105 110

Leu Arg Gly Leu Gln Phe Met Asn Arg Asn Val Gly Thr Glu Gly Trp

115 120 125

Ser Glu Val Glu Ser Arg Phe Asp Gln Leu Ala Val Asp Gly Met Leu

130 135 140

Ala Lys Thr Leu Phe Gly Gln Cys Ile Gly Met Lys Glu Ser Ser Glu

145 150 155 160

Phe Ala Glu Glu Leu Phe Asp Ala Leu Ala Arg Lys Arg Cys Ile Thr

165 170 175

Ser Pro Ala Val Thr Lys Asp Glu Leu His Glu Phe Trp Glu Gln Ile

180 185 190

Thr Asp Thr Ser Phe Asp Ala Arg Leu Gln Thr Phe Phe Asp Met Val

195 200 205

Asp Lys Asp Ala Asp Gly Arg Ile Thr Glu Glu Glu Val Lys Glu Ile

210 215 220

Ile Ser Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Lys Ile Glu Asp Asn

225 230 235 240

Ser Asp Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Gly Asn

245 250 255

Val Gly Tyr Ile Glu Leu Tyr Asn Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Ala

260 265 270

Pro Ser His Ser Met Asn Leu Ser Thr Asn Ser Arg Val Leu Ser Gln

275 280 285

Met Leu Ser Gln Lys Leu Lys Pro Thr Lys Glu Arg Asn Pro Phe Lys

290 295 300

Arg Cys Lys Arg Arg Leu Asp Tyr Phe Ile Glu Asp Asn Trp Lys Arg

305 310 315 320

Ile Trp Val Met Val Leu Trp Leu Ser Ile Cys Ala Gly Leu Phe Thr

325 330 335

Trp Lys Phe Ile Gln Tyr Lys Arg Arg Ala Val Phe Asp Val Met Gly

340 345 350

Tyr Cys Val Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala Glu Thr Thr Lys Phe Asn

355 360 365

Met Ala Leu Val Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu

370 375 380

Arg Ser Arg Thr Lys Leu Gly Lys Ile Ile Pro Phe Asp Asp Asn Ile

385 390 395 400

Asn Phe His Lys Val Ile Ala Phe Gly Val Ala Val Gly Val Gly Leu

405 410 415

His Ala Ile Ser His Leu Thr Cys Asp Phe Pro Arg Leu Leu His Ala

420 425 430

Thr Asp Glu Glu Tyr Glu Pro Met Lys Pro Phe Phe Gly Asp Glu Arg

435 440 445

Pro Asn Asn Tyr Trp Trp Phe Val Lys Gly Thr Glu Gly Trp Thr Gly

450 455 460

Val Val Met Val Val Leu Met Ile Ile Ala Tyr Val Leu Ala Gln Pro

465 470 475 480

Trp Phe Arg Arg Asn Arg Leu Asn Leu Pro Ser Thr Ile Lys Lys Leu

485 490 495

Thr Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Phe Val Ile Val

500 505 510

Tyr Val Leu Phe Ile Ile His Gly Tyr Phe Leu Tyr Leu Ser Lys Lys

515 520 525

Trp Tyr Lys Lys Thr Thr Trp Met Tyr Ile Ala Val Pro Met Ile Leu

530 535 540

Tyr Ala Cys Glu Arg Leu Leu Arg Ala Phe Arg Ser Gly Tyr Lys Ala

545 550 555 560

Val Arg Ile Leu Lys Val Ala Val Tyr Pro Gly Asn Val Met Ala Val

565 570 575

His Met Ser Lys Pro Gln Gly Phe Lys Tyr Thr Ser Gly Gln Tyr Ile

580 585 590

Phe Val Asn Cys Ser Asp Val Ser Ser Phe Gln Trp His Pro Phe Thr

595 600 605

Ile Ser Ser Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Val His Ile Arg Thr

610 615 620

Leu Gly Asp Trp Thr Ser Gln Leu Lys Thr Leu Phe Ser Lys Val Cys

625 630 635 640

Glu Pro Pro Thr Gly Asp Gln Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Ile Gly

645 650 655

Lys Ala Asp Tyr Lys Pro Arg Leu Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro

660 665 670

Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Lys Lys Tyr Asp Val Val Leu Leu

675 680 685

Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Leu Ile Ser Ile Val Lys Asp

690 695 700

Val Leu Asn Asn Ile Asn Gln Gln Lys Asp Ile Glu Asp Gly Thr Lys

705 710 715 720

Gly Ser Lys Lys Ser Pro Phe Ala Thr Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr Trp

725 730 735

Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Glu Trp Phe Lys Gly Val Met Asp

740 745 750

Glu Val Ser Glu Asn Asp Gln Glu Gly Leu Ile Glu Leu His Asn Tyr

755 760 765

Cys Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr

770 775 780

Met Leu Gln Ser Ile His Gln Ala Lys Ser Gly Val Asp Ile Val Ser

785 790 795 800

Gly Thr Arg Val Lys Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Arg Gln Val

805 810 815

Phe Lys Arg Val Thr Ile Asn His Pro Asp Gln Lys Ile Gly Val Phe

820 825 830

Tyr Cys Gly Pro Gln Gly Leu Val Gly Glu Leu Arg His Leu Ser Gln

835 840 845

Asp Phe Ser His Lys Thr Asp Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu Asn

850 855 860

Phe

865

<210> 8

<211> 12536

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

tttgtgcttt tggtcgacct gtctgtcacc catatattgc tctcccgctg ctcttcctct 60

ttcctcggct cggctcgtct cctctcccgc tccgacgcgt cgcgagggcg ccttttccca 120

gagattccac atccatccag cccgcggccg gcgagcattt ggcccatcac gcgagctgga 180

gaggttggcc cggcggcggc ggcggtgatg aggggcggcg cctcctcggg accccagcga 240

tggggctcgg cggggacgac accgcggtcg ctgagcacgg gctcgtcgcc gcgcgggtcc 300

gacgaccgga gctccgacga cggggaggag ctggtcgagg tcacgctcga cctgcaggac 360

gacgacacca ttgtgcttcg gagcgtcgag cccgcggcgg cggcggcggc gggggtgggg 420

gcgggggcgg gggcggcgtc ggcgcggggg gagctcacgg gtggcccgtc gtcgtcgtcg 480

tcgcggtcga ggtcgccgtc gatccggagg agctcgtcgc accggctgct gcagttctcg 540

caggagctca aggcggaggc catggcccgg gcgcggcagt tctcgcagga cctgaccaag 600

cggttcggcc gcagccacag ccgcagcgaa gcgcaggcgc cgtcgggcct cgagtccgcg 660

ctcgccgccc gcgccgcgcg gcggcagcgc gcgcagctcg accgcacacg ctccggcgcc 720

cacaaggcgc tccgcggcct ccgcttcatc agcagcaaca aggccaacaa cgcctggatg 780

gaggtgcagg ccaacttcga ccgcctcgcc cgcgacggct acctctcccg ctccgacttc 840

gccgaatgca tcggtatccc tacccaccga tcgcccacca ccaccatttt tccccccacc 900

gaattgcttt ctcacgcagc atccgcgaca ttgtcgtcgt gcagggatga cggaatcgaa 960

ggagttcgcg ctcgagctgt tcgacacgct gagccggcga cgacagatga aggtggacac 1020

gattaacaag gatgaactcc gcgagatctg gcagcagatc accgataaca gcttcgactc 1080

ccgtctccaa atcttcttcg aaatgtaatt agctacccaa tccactatct ctgcaatttt 1140

gccattatta ccagtactac tagataaaca gagtatcaac tctgctaaat tttgtggcga 1200

ttttcgtctg catttttacc agggtggata agaacgcgga cggccggatt acggaggcgg 1260

aggtgaaaga ggtgagcaaa acataatcca cgcccatgtc tatgctgttc ctacgcttgg 1320

tggtccagca gtacgagttc ttctgtgctt tttttctcca ttctttttaa atttgctatt 1380

tcaggatatc aaatcgaata atttagaccg ttttgacaac cgtagttgta tatttggtcg 1440

attgagctgt cctcgccttg cttgggccac accaatattt gttttctccc tccaaaatat 1500

gcacacatct aagtcgcgat tcgcaacctt accggatagg attacttctt aattctgatt 1560

agagggaaga acagttctta attaacacgt aacaatccga taagagagga cattttagat 1620

cagaagcgta ctacgcaggg aaaggagaga ggcatgcagt acaaaggtac gagaaaagaa 1680

gaaaaaatgc ttggcttcca atcggagtcg gtgagcgaaa ccggcgggga aagcatcacg 1740

gcgacaccaa ctcctacctg ccagttttgg gacactcatt ttctttaact tttaggaaaa 1800

gccgaaaagg ggtacccttt ctagaacgtg tgagggcagt ttcggtaatc cggtgggctt 1860

cgtggcttac agaagccctg tgaagcggca gtaggtgagg ggcatttctg tcaaacccac 1920

taagggcaag ttttatagta gaggtggcca ccacatccaa tttcatgcat gacatatata 1980

attaaattaa gaggtgatat gtataataga ttacctctac tacacaatcc ccaatatctc 2040

taatactctc acatgtttat tgaagtttat ccccaatatc cccaatatcc cttgtatgag 2100

aggtgactat ttctctctca tccttgttct ctcctccacc tcactattta gtcccatgtg 2160

gcatcttagg gcttgtgctt ggatgcccat agtacttgcc ctaatgctct ctgatcagct 2220

caaacgatgc gttgacaaga tgagttataa agtagccttt taaaaaaaaa acgattcgct 2280

aattttttgc ctctcactga tgtcactaac agtgctgcgg agcaaattga gttggtaggg 2340

gtttttttgg ctgctctggg ttgctttctt gaggtttgga agatgttgga tcatgttgac 2400

tcagctcgtg tttctccttt cacctacgcg cagattatta tgttgagcgc gtctgccaat 2460

aaactgtcga ggcttaagga gcaagcagaa gagtacgccg ctttgatcat ggaggagctt 2520

gatcctgaag ggctcggcta cattgaggta agctcgatgt tcttaagcag ttaagctggt 2580

gtaaaccctc ataatgcgct tatatctgta atagttgtac tcatgcactg taaacccaca 2640

ctatttactt ccaccaaacc tttaggaata gttgactgaa gctgtctgtt ttgggatggt 2700

agtgctgtag tggggtagta ccagtagagc ctaattgatg acttcgtgca gttctatttt 2760

atctgtcaca ttgctccggt gatgggtgtc ccccaaccgg ccaagcgcgc ttgttatgat 2820

aattaaacaa aaatttgtcc gtcacagcgt caaggccaac tacttgcaaa gggacgcatc 2880

attcataaca aaaagatgat gctggtaccc cacaaacttc ttgcccaccc atcatcattt 2940

atatcgaagt tgttgagcag acgtagacca gtgtagctgt gtagcatcca tttcagtttg 3000

ggaacagttt cgcttcgctc ccctgcctaa ttcaatgcca tccttgctgc ccacagcttg 3060

ttgccgcacc atttacaaag gaatcattta caatgccaga aatgttccat cacggttcca 3120

tggctcttgg tcgtgcattg ctctgccttg cccgggtgca agggtaggga agctgatgta 3180

gtaactaata agcagggtag caagtactag ggatttagga accaggatta acccatgcgc 3240

tcatgtacta gtaggaatgt cgatcaaggg tgtttatctg gaccatgcag ccagtggctt 3300

tggtgattgc catccatgat ccatgttagg cctcatttgt tatggtttta gttcaccagg 3360

tgattcaagt cccacctttt ctagcagtgg gatagctaca acttcagttt ggtggggatt 3420

catatttttg tgcaaccgta ccaattagat cgccgtgtag tgttaacttg tctcgtactt 3480

tttttaccct catagtattt gaagtaaatt aactttacat gttcgataag ttgacgcttc 3540

tttttcaaaa gatagcaaga gataactagt tgacacaatt gtttcatttg agtcaacact 3600

gatttaatat ttgtttgtcc aaaatggtta gttaagcttg agaaagttca tgtacatatt 3660

tcatagggta atttcaggac acatttgcca atattagtaa agcagcaaac tgtaaattcg 3720

agtttctctt aaataaatta ttgaactatg aattatatac atctgaagaa aatgtttgat 3780

atcttcttga tgagaagcgt tgcatctatt cacaaatcac aagtaccatg tactgcatct 3840

ggtatgactg cacaactttt tacatgaaag tcctttcata tataaaaaag gaggtgtttt 3900

acaatgatct ctactagtag tgcaacattt tattttttgc cattgcagca taattctgtt 3960

gttatataat cttgatatta ttatgtattg gatggtgaaa attgatgtgc tgttgttgac 4020

atgctcatgt gtttcttgca aacaatttgt tgagctaatg gaagtgtgag gacgtcccaa 4080

agcctaggtg gtgcaacgct ccgaggcatg tcagcgcgaa atatctggat ggatgggttc 4140

tcaaataaag cccaaataaa tacggtaacc atccaacctc atcgcagacc ccgacatgtc 4200

ttgaagagtg cactacatag gctctaagcc atcggatatg aaatagaaga cacaactgtt 4260

ggaatagcca caccagtcat ctacgtcata tgcccgtcaa ccactcgatg gtggcgacaa 4320

aaaacatacc ccagagactc gatctcaaca gaggcatatt ccccggttat ctcaaccatt 4380

tcaaacccat cctcatgtgg gactagtcgc ccaggaatgc aacatagtct cacataaatc 4440

atctcaagca tgatatccaa ataataattg gttctaagca ataagcataa atagtcttaa 4500

taaggttcta agtagtactt ggcgacaagc cataaatatt ggttcatgcg gtaagcgtgc 4560

tacccaaaag cccataggca aaccgactag ggtaaatccc tagttagaac catcctggaa 4620

atctgcaaca tcacaagctg catcaaactc ctcatccaaa cagtcattac ctgcagcgcg 4680

gtctgagcat aaacaagtaa aaaaaagcaa gaaatcagta cattaatcaa attaatgtat 4740

tggcaagtcg gaaacaatcc tagcatacta catgttggcc atattcaagg ataagctgtg 4800

tataggttaa tttgcataaa tgccaatttt agttcacaac atgtttcgca acggaatttt 4860

ataacaatag tatagagtaa gtaaaacttg taatgtgaat gaataaataa tacacatcta 4920

cccctcaagt catcacatac cacatatcat taatcaattt catcatatca cgaaccatag 4980

gaagttccga taagttacca aaacccggta acccataccc ttcggcctac caagatgcaa 5040

ggctaaactc taaacaactt aataggttga ggccagccca tacttagcac atgtggtttg 5100

tactgttttc attagttggt gacatagagt ggggtcctta atcgacccgg gcgaacgctc 5160

cccctatcgg tgtacaacta ccaccctatg tacactcgcc gcccaagtct aaaaacaagt 5220

tatttccatt ttcagttcac aatactcaca cacttaaatt tctgtccagc aacatcaaaa 5280

taaccatttt cacatataac atttatcaaa acgagtaatt tgcaaggcgg taaccaaata 5340

taagcatata gcagcaatat aagcatagta taatcccaaa gaacacaata attgtattca 5400

aaagcactct atggttacaa ccagcaaggg ttcaatattt caaggtggat tatgcagcaa 5460

ttaggtcata tctaccattc ccacatttat ataatatttt ttttaccaaa attaatacta 5520

gctaacgtat gcatgtttgc aatagaatca tttagcccaa tagaacatag gatcaatgtg 5580

gtcaaaggag gggcaaactt tccttcgtct gcaaactcct gagcctggtc gtcaacaaac 5640

tcaccctctt cttcttcgac gtattcttcc tctatacaaa atacgtgtat acgataaata 5700

caaaaatgca taaaaaccaa aatgcatgaa aatgcatgaa atttatgcag tgagtgtgtg 5760

ctggtctcag gtggtctctg gtgaaggaat ttttattttg tcacttttta tttacagaga 5820

tatgcatttt acaattaaaa aggtttaaaa gggctaagtt ttattaagca acatttttgt 5880

acagaagtga acaaaattcc ttttacaaag ttatagagca tgattttaga aagttaacag 5940

aagtggtttc acaattttta gagctatatt caattcgtta tggatttaac aagttctagg 6000

caacattatg gcaaaacaaa aataaaggaa aagtttgtac agaaagtacc catttttata 6060

tttttgtaaa atatttcaca gctttatgga tctaacaaaa ctggtttcac aatttttgaa 6120

gttaaaatga attttctaca aattttagaa gttctgctca ttctctgctt taaaccaaaa 6180

tagaaatcaa aatttgaaat tgcattccag ccgggtccac aggtcagtga aagaagattt 6240

gcagagaggc cctcggaagt tgggggaatc atcccgcact tcttctgcca cctggacagc 6300

aaactttatt aagagtctct attcttttgt ttatttccat caaggtcctg ctatagtaat 6360

atgagtcatg gcagttttca gattggaccc tagagtcgat caaattcaag aaatgaagtc 6420

cccagctatc tcacatcggg agcagccatg gctgagctcg gtctacggct caccggcggc 6480

gatcagtgga tcgaatcggt tcgagcacaa aagagaaaat gtagagaacg ttcttgcgca 6540

tccgtgagtg gtgctggtga gggaaatggt ggtctgtagc ccatagaaca tgagctacag 6600

cggtggtgtg tctcggtatg cccatgtatg tgcatgcaga ggcttggtta gtgcaaaggg 6660

ttagtgcatg tgctctcata tggtaccagg gtgctcacca agcagagaaa cggaggcagc 6720

gaggtccagg gagcggcgga gacggtggtt gatggccaac ggcggcaaaa ctccggcgtc 6780

gacgtcgccg ggtcgactca aggcgcgaac tgtaacttcg agagtacggg ggtgttagag 6840

atgagccaca gagggtgcat gcgcgaggaa tccggcggaa actcaccgga gcttggtgtt 6900

gcttcggtgg tgaggaacgg cggccggagc ggcgtcggcg gttcgggtgg ccggcggcga 6960

ggacggtgac gcccaccacg tgctcgacag attggtccta gggcaaaagg ggtacgggtg 7020

agctcggcgt gatgcgtagg tcacgttcca taggaggaaa gagagaggga ctcaccgggg 7080

atgcacggcg acgacggcta agtcgccgga gccggggaag atggccgagc tctgggcatt 7140

ctgtgcgtgg ggtgtgtttt cttggacttg gaacgcgatg tggggagcga gctgttgctt 7200

ctggtgcttt ggcttgggaa ataaggaaga gtggagtggg ggagtgagag agagagaggt 7260

ggctggtgca ctcattgtgt tccttgggca tttattgggc atgaggaacg gtggatgctg 7320

tgaggggaga gtgggaggct gtcatgtggg tcccgggggt tgtggggccc actgtcagtg 7380

aaagaaattc gaaaatagcc ttggaggcta agtcaatgag ggttacctgc caaggatctt 7440

tggaggggat tcaaggtgga ttttgagcag caagaaatct ggctagatat cctcttggtc 7500

aggggtgatg tggagagtaa atgtgctgaa gtgggttggg ttagaagtct ctggtttagg 7560

tttgatggag tgatgaacat gtgttgacag tgttggttag cagcagttga cagtgcagtt 7620

agcagctgat tggatttttg gagggagaga agaaagggtt agagagtgat ccagggtatg 7680

ccactcctca gggtgttaga agaaagttag tagaagactt tggctgaaac caaacttcaa 7740

aaagaggttt tgaaataaat tttacagaga gagcaagttt gaatctgcta agcagttttt 7800

tttttcagga ttttggagag attaaagtag atcaacaagt tagcaaacct tactgaaaaa 7860

ctctgaaaat ttgtgggttg atttctgaca tatcaaggta tttttgagaa tttttgtgga 7920

atttttggat gcatataatt accagattaa ttgtttttgt gactctaggc ctatcaagat 7980

gcatgtgatg atgagatgat taagatccaa aaacaattaa aatcactcca caaccacatg 8040

atgcatttaa attaaattta gttctcaggt ttataggctt gggtatgtta caggaaggga 8100

ccaactttca tttttaatag ggagtatcta aaaaactgcc gcaagttttt ttgagtgaaa 8160

aactttcaca tgtaactata gtataatcga agtgtaacta cattgtaact atactataac 8220

tgcattgtaa ctatactgta actatgatat aacttatata aaacttgtat ttaactatgg 8280

tttgattggt tagcaccgga atattacacg tgacatgtgc gcaaatttct ttctagcaat 8340

tttttccctt catgcacaaa tctcgaggca atccgatggc tacaaatccg aaagttttgg 8400

aggcaaaaga acttgtggaa gttttctagc aattccattt taatatcaca gaacactata 8460

tatattaatt taggcggtct tgtgctatgt attcagtatc ctccatgtgt agtacatgta 8520

tagtggccca gtggttgagc ttatggacct tcatagtaca atttctttct ttaggaacca 8580

gttttgagag agtagcttat gttttgttca tagaatatta tcctcaaatc aactaaatgt 8640

gcttatagtt ttgcatcaat gaaatgtgaa tgacatgact tctgaaaaat acactgtttt 8700

tttttttgtt tgtgttacag ctatggcaat tggagacact tctgttgcag aaagatacct 8760

atatgaacta tagtcaggcc cttagttaca caagccaagc actgagccag aatcttgcag 8820

ggctaaggaa gaagagttca atccgcaaaa taagcacctc tttaagctac tatttcgagg 8880

acaactggaa acgtttatgg gtgcttgcat tgtggattgg gataatggct ggactgttca 8940

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

cctcctgctg ccgccactac tactaccatt gccaagccag gccaggccag accggccatc 60

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<210> 11

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<212> DNA

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cgttagcaaa ctcaaagtcg agagataaga gggggggaaa gggtagcctg gtgcactaag 3600

ctaccactat gccagggtcc tgggaagtgc cggaccacaa gggtctactg tacgtatccc 3660

taccttgcag ttctgcaaga agctgtttcc acagctcaaa tttgtgaact cctggtcacg 3720

tggaggcaac tttactagtt ctgcaaggct ccccttgtta taaataaagt cattcactaa 3780

tgatagtctt ttctctaagt atttaatagc attcctaaat tactagagat gatataagca 3840

tctggttcct acagcctcca cccacaagac agtagtaaag aaacaaataa aacatattga 3900

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tttttctttg atccttacag gtttctgtac ttccaggaga tgtatttagc cttaccatgt 4020

caaagcctaa tagtttcaaa tacaagagtg ggcaatacat attcctgcag tgcccaacaa 4080

tctcctcatt tgaatggtaa gtgcagtatt tctggattta actcaatcat gcctcaacca 4140

acagatattt aacatatatc ttgatgcttc tccaggcatc cattttctat aacatcagcc 4200

ccaggagatg actacctcag tgttcacatt cgcatggtgg gtgattggac caatgaactt 4260

aagcgggtat tcacagagga tgatagttca gcatgtgaaa tagggcgggc taagtttaga 4320

gaacgtggga atgttgatca aagagggtaa cttcctttgt gtgatttttt aacagaaaca 4380

tatcaagatt tccttattga gaagtctaaa gggcttgtaa tgacgcagtt tacctcgatt 4440

gcttgttgat ggaccatatg gtgccccagc acaggactat caaaattatg atgtcttgct 4500

cctcgtggga ctaggtattg gagctacgcc ttttataagt atcctaaaag atctattgaa 4560

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agagaaatgg aaaagaaata taatgtagta aggaatttta gcttagctca acgagcgcca 5220

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<210> 13

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<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

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tgctgttgat ggaatgctag caaaaacatt gtttggtcaa tgcataggtt tgttcattac 720

acaaattctt ttggatttat acaataaaag tttctaataa ttagcatttt tgcaattgta 780

attaaggtat gaaggaatca agtgagtttg ctgaggaatt atttgatgct ctagctagga 840

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acatcaattt ccacaaggta tatagcctga gaatataaat ggaaacacga aatcgttgaa 2040

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caaacaacta ctggtggttt gtgaaaggca cggaaggatg gaccggtgtt gtgatggttg 2280

tccttatgat catagcgtat gtactagccc aaccatggtt tcgtagaaac cgactcaatc 2340

ttccatcaac aatcaagaaa ctcactggat ttaacgcttt ttggtactcc catcacttat 2400

tcgttatagt ctatgtcctc ttcatcattc acggatactt cctctacctc tcgaaaaaat 2460

ggtacaagaa gacagtaagt tcttaacaaa ataaattata tctaatgcta atcatgccct 2520

gccttgccat ataatggatc taatatcttt ctttttactc tgaaatattg agcagacatg 2580

gatgtatatc gcggtgccta tgatactata tgcttgtgaa cgtctgcttc gtgcatttag 2640

gtccgggtac aaggcagtga ggattttgaa ggtacataag agcttagacc attgcaagca 2700

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gtagctgtat atcctggaaa tgtaatggca gtgcacatgt ctaagcctca gggctttaag 2820

tacacaagtg gacagtacat ttttgtgaac tgttctgatg tttcttcatt tcaatggtaa 2880

atttgaaata aaccaagctc ctaatcaaac aaactgtata caaattatta ttattattat 2940

tactgctaaa atcatacata ttttgtactg taggcatcct tttaccatct cctcagctcc 3000

gggagatgat tacctaagtg tgcacattcg aacattgggc gattggacat ctcagcttaa 3060

aactctcttt tctaaggtat cgaattcatt aaatcagtta taacacagca aagacgaaat 3120

cttttgaaga aactttggaa gactaataat gcttgtactg atcatatttt aggtctgtga 3180

gcctccaact ggtgatcaaa gtggcctttt aagagcagat atagggaaag ctgactataa 3240

gcctaggtaa gggagtaaag tttgaaaatt tccaagtgct tttaacttat tttcccctga 3300

attttgattc atatcaatgt aaacagattg ccaaaactat tgattgatgg cccttatgga 3360

gcaccagcac aggattacaa gaaatacgac gtagtcctct tagtaggcct tggcattgga 3420

gcaacacctt tgataagcat agtaaaagat gtgctcaata acatcaacca acaaaaggac 3480

attgaagatg gtactaaggg tagtaaaaaa agtccttttg caactaaacg agcttacttc 3540

tattgggtaa cacgcgagca aggctcgttt gagtggttta agggtgtgat ggatgaggtc 3600

tcggagaacg atcaagaagg cctaattgag cttcacaact actgcaccag cgtttatgaa 3660

gaaggcgatg cccggtctgc actaatcaca atgcttcaat caatccacca agctaagagt 3720

ggcgtagaca ttgtctctgg gacaagagtc aagactcatt ttgctagacc aaattggcgc 3780

caagttttca aacgtgttac aattaatcat cctgatcaaa aaattggtta gtacgcatct 3840

ttgattacta ttcattaaaa ttaaaccgcc tctctacttc acaaactagg ggtaaggtcg 3900

atctttctgg actatattat atccagacct cacttatgaa attatacgtg ttaaattgac 3960

attcttattt tgaatttatg atattacagg tgtgttttat tgtggcccac aaggtctagt 4020

tggagaacta agacatctat ctcaagattt ctcacacaag acagacacaa agtttgaatt 4080

tcataaagaa aatttctaag 4100

<210> 14

<211> 5434

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

gttgaaaatt gtgtgtttgt tttttttgta tcaatcggtt gagaagtgcc tctcttgttt 60

ttttttcctc tctttcttct ttattcatat ttcactttct ttctttcttt caaaatttct 120

caccttcttt ctcttctctt ctttgcttct acagttttca tggccatcgg tgaaaaccgt 180

gtagagaaat attaaatttg atatatattg tgttaagtgt tggttggttg gttaatctct 240

ctcactgatg aagttatcgc ctctgagttt ctctacgagt tcgagtttca gtcacgccga 300

tggaatcgac gacggtgttg agttaatatc atctccattt gccggcggcg caatgctgcc 360

ggtttttctc aacgatttga gtcgtaacag tggagaatcc ggaagcggta gtagctggga 420

aagagagctc gtggaggtta cgttagagct cgacgtcggc gatgactcca tactcgtctg 480

cggaatgtct gaggcggcgt ctgttgattc tcgggcgaga tcggtggatt tggtaaccgc 540

gaggttatcg aggaatttat cgaatgcgtc tacgagaatc cgccagaaac tagggaagtt 600

actgaggtcg gaatcgtgga aaacgacgac gtcttctacc gccggcgaga gagatagaga 660

tcttgaacgt cagacggcgg tgactttggg gattctgacg gcgagggata aacggaaaga 720

agacgcgaaa ctacagcgat caacgtcgag tgcgcaaaga gcgttaaaag gattacagtt 780

tataaataaa accacgagag gaaatagctg cgtctgcgat tgggattgcg attgcgatca 840

gatgtggaaa aaagttgaaa agcgattcga atcgctttct aaaaatggat tactcgcccg 900

agacgatttt ggcgagtgcg ttggtaagtc aataaatatc tatatataca tacgaaaatg 960

atcatggacc aatccactgt tttgtaaatt taaagggatg gtggattcga aggactttgc 1020

ggtgagtgta ttcgacgcgt tggctaggag aagaagacag aaactggaga agataacgaa 1080

agatgaactt catgatttct ggttacagat ttctgaccaa agcttcgacg cacgtcttca 1140

aattttcttc gacatgtacg tgtctctttg attctctctt tctttttatt tttaagtcaa 1200

gtttttgggt ttgtctttac gtttataact gttacgggaa taacgcactg caattagcaa 1260

aagcataaga aaacaaatgt attgatccaa gtgcaacgaa taattcagtt gacgttaata 1320

attgaagaaa gttttatcta taattgatat tccaaattct gaataacgcc ggcgaggtct 1380

catcaacttg cattttaata agatttgagt tgatttttgt tttctggtgg tattttatga 1440

agtttagctg attaaattca cttattgagt aaaaatgttg ttgattaaag ataatgttag 1500

cttaccaatc attctttgat tgtaatttgt tatctcttta gtgagaacta ccgcaacttc 1560

acaataattt tctacaattt tgggaattat tagccttaaa taaaataaca tgtgttggtt 1620

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tatagataga tacatcattt aaatcacgtg gtgttcttag ccgttggatc tggtagttca 1740

cgcaatcaat ggcgaaaatg gtctagtgag tttaagtaat gggccgcggt ttacttggcc 1800

cagtaaaaaa taaactttta ccaaattttc aaaaagtttc ctctttcagc tttctttttc 1860

ccgcaataag tttcttgcaa gtataagata caatgactct tatatacacc aagctgccaa 1920

aatgagtttg caatttttta ctctttttat ggccaaacat ttaattcagt aacattatgg 1980

tttacactca actcgttttg ttattctgtc atttttatga cataactaaa tatattttgt 2040

tgtttaatga ttctacaatt ctgttataat ttgtagtgtt actgaaagaa aaaaaaagat 2100

tctaactggt accggttttt tgttacaggg ctgatagtaa cgaagacggg aagatcacta 2160

gagaagaaat caaagaagta actttcttta ttcttcaaca tagagattac gtttaaaaca 2220

atcaatctct ttaacaactc ttgtactttt gaaacgcagc ttctaatgct aagtgcatca 2280

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gagcttgatc ctgagaattt tggatacatt gaggttcaaa aaaacataat atattcgaac 2400

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caagcggtgg agtaagtaca ccaagacgga atctaataag acctcgtcat gtggttcaaa 2580

agtgtagaaa aaaacttcaa tgtctgattc tagataactg gcaaagaagc tgggttcttt 2640

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aagctgcgtt taaggtcatg gggtattgtt taaccactgc taaaggagct gcagagactc 2760

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gatctacacg cgctcgagct tgtgttcctt ttgatgacaa catcaatttc cataaggtac 2880

cttccttcag tctttcgatt tttcagtttt agtcagagca caacatttga gataaactct 2940

ttctctctct cttgtcctgt ttgtgtgcca gattattgct tgtgccatag cgattgggat 3000

acttgttcat gctggtactc atttggcgtg tgatttcccc cggattataa actcgagtcc 3060

agaacaattt gtcttgatcg cttctgcctt caatggtact aagcctacat tcaaagacct 3120

gatgacaggt gcagaaggaa tcaccgggat ctcgatggtg atcttgacaa ccattgcatt 3180

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gttgactggc tttaacgcat tctggtacac tcatcacctt ctagtggttg tctacatcat 3300

gctcattgtc cacgggacct tcctgttctt tgctgataag tggtatcaga aaacggtaag 3360

cagcagcaac cataatctct ctttacttta aaccgaaaaa ccaaatgtcc tgaaacctaa 3420

attattgttg attaccactg ttcccagact tggatgtaca tctcggttcc tttggtgctc 3480

tacgtggcag aacgaagtct gcgagcttgt aggtcaaagc attactctgt caaaatcctc 3540

aaggcaacca ccataaaccg agcaaattca ttcctgttaa aaggtgtttt aataacaaaa 3600

taaacccatg aaccttcaat ctgatctctg caggtttcca tgctacctgg agaagtactc 3660

agcttaatca tgtcaaagcc tcctggattc aagtacaaga gcggtcagta catattcttg 3720

cagtgtccaa ctatctctcg atttgaatgg tgagtactga taccgaattc ccatagtgtt 3780

aacaaacatc tcaggtttca ctcagaaaga tattccctaa acttttccag gcacccattt 3840

tctattacct ctgcaccagg agatgaccaa cttagtgttc acatccgaac actcggagac 3900

tggacagagg agctacgacg agttctaact gtgggcaaag atctttcaac atgcgtgatt 3960

gggcgttcaa aattctctgc ctattgcaat attgatatga taaagtaaat ttcaagacat 4020

ctttgctttc tccttactca cttggatacc tattattaac atggcttgtt gatcctgcac 4080

tgacagccga ccaaaattac tagtagacgg tccatatgga gctccagcac aggactacag 4140

aagctatgat gtcttgctcc tcattggact gggaatagga gctactcctt tcataagcat 4200

cctgaaggat ctgctgaaca attcaagaga cgaacaaaca gtaagtccaa ttcagtgcac 4260

cagaaaagtt agtcttttct agaaccttgc accaaataca tatctctaaa cttcatatgg 4320

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ccacagcaac cccaacttca acacatggag ggaaaaagaa agcagtgaag gctcactttt 4440

actgggtcac aagggagcca ggatccgttg aatggtttag aggagtaatg gaggaaatat 4500

cagacatgga ctgcagagta atactaaaca ccagcatatc attcatttgc atcacctctt 4560

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aagaattgat gcagggcata taaccagaaa ctatttgcca atattaccta taactgacaa 4800

aataacatca ttcaaacagg tgagaacaca ttttgcaagg cccaactgga aggaagtctt 4860

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tgcttaccat caagacatct tataaatctc tcttctagga ctaacgaatt aataccattg 4980

gaaaagaaag aaaacttgca ataggaatta tgacacatgc aaacacatga acatgtctgc 5040

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agtcaaaaaa caaccacacg gttcgagttc cataaggagc atttctaatt caatgttaca 5220

agccagcttc tatcactttc cctaaagtga gattcaaatc cagcccgcca ttattttttt 5280

tcacactaac ttcacagtca cttagcaaag tagattatat acactatgtt aaaaaaggaa 5340

acattgtctt gcctgtttgt atagaccccg cctaaaggca tgaaaataac aaatctaagt 5400

tactatacga aataatatac gtgtctttcc caag 5434

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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tagctagcaa gctcgaaaag 20

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