阅读说明：本技术 RNase L抑制剂的应用 (Application of RNase L inhibitor ) 是由 黄昊 汤金乐 刘志宏 付子阳 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了RNase L抑制剂的应用,包括特定化合物在制备RNase L抑制剂、溶瘤病毒抗肿瘤增效剂、抗肿瘤产品中的应用以及药物组合物,这些特定的化合物其对于RNase L具有靶向的特异性。制得的RNase L抑制剂可以有效抑制RNase L的活性,避免溶瘤病毒发生降解,使溶瘤病毒可以在宿主肿瘤细胞内顺利复制并杀伤肿瘤细胞,有效提高溶瘤病毒的抗肿瘤功效。在此基础上,可以将RNase L抑制剂与特定的溶瘤病毒复合成抗肿瘤产品,保证溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞作用的正常发挥。(The invention discloses application of an RNase L inhibitor, which comprises application of specific compounds in preparation of RNase L inhibitors, oncolytic virus anti-tumor synergists and anti-tumor products and pharmaceutical compositions, wherein the specific compounds have targeted specificity on RNase L. The prepared RNase L inhibitor can effectively inhibit the activity of RNase L, prevent oncolytic virus from being degraded, ensure that the oncolytic virus can be successfully replicated in host tumor cells and kill the tumor cells, and effectively improve the anti-tumor effect of the oncolytic virus. On the basis, the RNase L inhibitor and the specific oncolytic virus can be compounded into an anti-tumor product, so that the normal exertion of the effect of killing tumor cells by the oncolytic virus is ensured.)

RNase L抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及抗癌技术领域，尤其是涉及一种RNase L抑制剂的应用。

背景技术

RNase L是在高等动物抵御病毒入侵和人体先天性免疫过程中起重要作用的一类蛋白分子。高等动物在遭到病毒入侵时会分泌干扰素，干扰素诱导2-5A合成酶(Oligo-adenylate Synthetase，OAS)的表达，2-5A合成酶与病毒双链RNA结合后被其激活，然后将ATP合成为2′-5′连接寡腺苷酸(2′-5′linked oligoadenylate，2-5A)。2-5A的化学结构包含三个线性连接的腺苷酸(A)：px5′A(2′p5′A)n，其中x＝1–3，n≥2。生成的2-5A与RNase L结合，将RNase L分子激活，使其具有降解病毒及宿主单链RNA的功能，导致病毒无法复制，从而达到人体抗病毒的功效。RNase L的底物选择性较弱，对很多单链RNA序列都可以降解，但是降解的速率有所不同。比如，其仍然倾向于UN^N(N代表任意核苷酸)序列的酶切位点，即在尿嘧啶核糖核苷酸U之后的两个N之间进行剪切。在不同的UN组合中，酶切的速率为UU>UA>>UG>UC。整体来讲，RNase L倾向于在UU与UA位点之后剪切。RNase L具有较广的抗病毒谱，包括脑心肌炎病毒、西尼罗河病毒、冠状病毒等。

RNase L不仅是人体重要的抗病毒免疫反应中的作用因子，同时也是抗肿瘤辅助药物的靶点。目前有一种新的癌症疗法，称为抗癌病毒疗法(Anticancer Viral Therapy)，利用低活性的病毒来选择性攻击癌症细胞。2015年，美国FDA正式批准Amgen的溶瘤病毒疗法(Oncolytic Virus Therapy)用于手术清除效果不佳的黑色素皮肤瘤。该溶瘤病毒疗法所使用的药物Talimogene laherparepvec(又名

或者T-VEC)，是一种经过基因改造的单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)。但是，利用体外病毒对人体内的癌细胞进行攻击时，人体自身免疫系统会对病毒的入侵进行抵抗，进而削弱病毒对癌细胞的攻击。例如，利用水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)开发抗癌溶瘤病毒疗法时，研究人员发现RNase L会对使用的VSV病毒进行攻击，导致VSV病毒对癌细胞的抑制效果不佳。与此同时，美国克利夫兰医学中心的科学家发现小分子抗癌药物舒尼替尼(Sunitinib)可以抑制人体先天免疫系统中的两种重要蛋白RNase L和PKR，其中Sunitinib对RNase L的抑制效果IC50＝1.4μM，对PKR的抑制效果IC50＝0.3μM。进一步的实验结果发现，将VSV病毒与RNase L的抑制剂Sunitinib结合使用，Sunitinib可以有效地抑制人体的抗病毒免疫反应，导致该病毒疗法在多种类型的肿瘤上都有非常好的效果，如膀胱癌、乳腺癌、肾癌。然而，Sunitinib作为一种酪氨酸激酶小分子抑制剂，其通过靶向多个受体酪氨酸激酶以抑制细胞信号的原理使其对RNase L不具有特异性抑制作用。因此，有必要开发出靶向RNase L的特异性抑制剂。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供特定化合物在制备RNase L抑制剂、溶瘤病毒抗肿瘤增效剂、抗肿瘤产品中的应用，其对于RNase L具有靶向的特异性。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备RNase L抑制剂中的应用，化合物选自：

中的至少一种。

本发明的第二方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂中的应用，化合物选自：

中的至少一种，溶瘤病毒抗肿瘤增效剂包括RNase L抑制剂，RNase L抑制剂为上述化合物或其药学上可接受的盐。溶瘤病毒抗肿瘤增效剂是指在溶瘤病毒疗法中，与溶瘤病毒配合使用，降低免疫系统的抗病毒免疫反应，从而能够增强溶瘤病毒对癌细胞抑制效果的产品。

本发明的第三方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤产品中的应用，化合物选自：

中的至少一种，抗肿瘤产品包括溶瘤病毒和作为溶瘤病毒抗肿瘤增效剂使用的RNase L抑制剂，RNase L抑制剂为上述化合物或其药学上可接受的盐。

根据本发明的实施例，溶瘤病毒为单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、心肌炎病毒、西尼罗河病毒、冠状病毒中的至少一种。

本发明的第四方面，提供一种药物组合物，包括：

(a)溶瘤病毒；

(b)化合物Ⅰ或其药学上可接受的盐，化合物Ⅰ选自：

中的至少一种。

根据本发明的实施例，溶瘤病毒为单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、心肌炎病毒、西尼罗河病毒、冠状病毒中的至少一种。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包括：

(a)溶瘤病毒；

(c)化合物Ⅱ，化合物Ⅱ以(b)为先导物经修饰或改造得到；

其中，(b)为化合物Ⅰ或其药学上可接受的盐，化合物Ⅰ选自：

中的至少一种。

其中，改造或修饰包括但不仅限于以上述化合物为母体进行侧链添加、删减、片段补充等，以

为例，参考下式：

R₁-R₃、R₅-R₇分别独立选自卤基(包括F、Cl、Br、I)、未被取代的C1至C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1至C3的饱和烷基中的任一种；

R₄选自羟基、卤基(包括F、Cl、Br、I)、未被取代的C1至C3的饱和烷基、苯基中的任一种。上述修饰结果所采用的是本领域所熟知的修饰方法，不会对类药小分子的活性等造成较大的影响，本领域技术人员基于已公开的10G5、10G-1、10G5-2有理由推测上述修饰后的化合物具有类似的化学性质，可以作为RNase L的抑制剂使用。

根据本发明的实施例，溶瘤病毒为单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、心肌炎病毒、西尼罗河病毒、冠状病毒中的至少一种。

本发明的第六方面，提供RNase L抑制剂的筛选方法，包括根据药物结合口袋与待筛化合物的相互作用进行评估的步骤，RNase L的药物结合口袋以RNase L的假性激酶结构域为对象，组成药物结合口袋的氨基酸残基为A373、R398、D502和K503。

根据本发明的实施例，RNase L假性激酶结构域氨基酸残基R398的原始侧链位置被10G5占据，共晶中R398侧链位于片段分子平面上方，形成Pi-Cation相互作用。

根据本发明的实施例，组成该药物结合口袋的氨基酸残基除A373外，其他均为带电荷残基。

该药物结合口袋临近假性激酶结构域ATP结合位点，可以以此使用片段连接法设计苗头化合物。

本发明实施例的有益效果是：

本发明所提供的化合物能够特异性抑制RNase L的活性，可应用于制备RNase L抑制剂。这些制得的RNase L抑制剂可以有效抑制RNase L的活性，避免溶瘤病毒发生降解，使溶瘤病毒可以在宿主肿瘤细胞内顺利复制并杀伤肿瘤细胞，有效提高溶瘤病毒的抗肿瘤功效。在此基础上，可以将RNase L抑制剂与特定的溶瘤病毒复合成抗肿瘤产品，保证溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞作用的正常发挥。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的RNase L小分子片段抑制剂酶活筛选和相对应的半数有效抑制浓度(IC₅₀)测定结果。A是全长RNase L表达纯化过程中考马斯亮蓝染色实验结果，B是相对荧光强度检测结果，C是类药分子的筛选结果，D是IC₅₀测定结果，E是筛出的两种类药分子的结构式。

图2是本发明的一个实施例的10G5与RNase L复合物晶体以及药物结合口袋分析结果。A是10G5与RNase L的复合物晶体和衍射数据，B是10G5与RNase L的共晶结构，C是MST技术测量RNaseL和10G5结合常数的结果。

图3是本发明的另一个实施例的10G5-1和10G5-2的结合常数测定结果。A是基于共晶结构的10G5衍生物分子对接示意图，B和C分别是MST方法测量衍生物10G5-1/10G5-2和RNaseL结合常数的结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例中采用赛默飞旗下Maybridge公司的Maybridg Ro3片段文库(含1000种类药分子)。这1000种类药分子含有强药效团和具有优越的ADME(吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及***(excretion))性质；且结构多样性广、含有容易结合的基团、符合“Rule of Three”性能(脂水分配系数系数logP小于3、分子量小于300Da、不超过三个氢键供体、不超过三个氢键受体、不多于三个可旋转的键等)；因此，采用该Maybridge Ro3片段文库筛选出来的具有生物活性的片段分子具有优良的先导化合物性能和药物开发潜力。

实施例中，各原料试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

1实验方法

1.1 RNase L蛋白样品的制备

由本实验室原始保存并用于表达RNase L的原核表达载体为pGEX-FL-RNase L(通过将RNase L的核苷酸序列片段NM_001097512***载体pGEX-4-T1的BamHI和XhoI多克隆位点而构建得到)和pGEX-N21732，其中包含野生型RNase L基因序列(曾用于解析RNase L的全长晶体结构：包含全部结构域、N-端和C-端切除了少部分无二级结构的片段)。将相关质粒转化至原核表达大肠杆菌菌株BL-21中。挑取单克隆扩大培养，最终通过加入IPTG低温诱导过夜。将所获菌体高压破碎及高速离心以获得蛋白上清，将所获上清与GST亲和层析介质混合低温孵育，随后用结合缓冲液将层析介质清洗干净，直接加入TEV蛋白酶低温酶切过夜，次日，收集酶切下来的RNase L蛋白悬液，最后通过SEC分子层析纯化获得高纯度的RNase L及其突变体蛋白。

1.2 RNase L活性检测方法

采用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的酶活性检测方案。在RNA底物的两端分别标记荧光基团和猝灭基团构成RNA探针，当完整的RNA探针被激发光激发时，能量被转移到近端的猝灭基团，而当RNA探针被切割后，猝灭基团远离荧光基团，荧光基团被激发光激发后发射光被荧光光度计检测，从而可以表明核糖核酸酶L对RNA底物进行了剪切。

1.2.1底物材料

RNA荧光探针底物：6-FAM-UUAUCAAAUUCUUAUUUGCCCCAUUUUUUUGGUUUA-BHQ-1；FAM(羧基荧光素)为荧光报告基团，BHQ1为荧光猝灭基团，该序列源自呼吸道合胞病毒基因组的RNA序列，包含多个切割位点(UU和UA)，对RNase L酶的切割具有高度敏感性。

1.2.2酶活性检测

混合RNase L蛋白(25pg/μL)、2-5A(1nM)、RNA荧光探针底物(100nM)，22℃孵育1h。利用多孔酶标仪(PerkinElmer Envision 2104)在480nm激发光和535nm发射光波长下检测荧光信号，读数强度减幅设置为0％，测定相对荧光强度(RFU)值。

1.3 RNase L小分子片段抑制剂筛选与鉴定

针对Maybridg Ro3片段文库用上述酶活性检测的方法筛选RNase L抑制剂。

1.4蛋白共晶的获得与验证

1.4.1蛋白共晶的获得

通过共孵育法或晶体浸泡法获得抑制片段与RNase L的共晶，并采用微尺度热泳(Microscale thermophoresis，MST)测定抑制片段与RNase L的结合常数。

(1)共孵育法

将筛选获得的阳性抑制片段与蛋白RNase L晶体共孵育，化合物与分子比例在20-40之间，常温孵育2小时，然后以悬滴法点晶体，然后开始悬滴点晶体(晶体条件：0.1M Tris(7.0-8.5)、0.15M(NH₄)₂SO₄、PEG4000(15％-20％)、5mM DTT)。20℃放置，2-3天内晶体会生长出来。用20％乙二醇做保护液，挑6-8个晶体，液氮冻存后放到液氮罐中，送往上海同步辐射中心，衍射收集数据。

(2)晶体浸泡法

直接生长RNase L晶体，挑取晶体到50mM浓度的化合物中浸泡，20℃放置，2到4小时甚至过夜。挑3-4个浸泡晶体，经冻存后，送往上海同步辐射中心，收集数据。

2.实验结果

2.1小分子片段抑制剂筛选结果

通过初步筛选获得了26个阳性小分子片段，随后对这26个小分子片段进行三次重复试验，确认获得2个具有抑制效应的小分子片段。并通过浓度梯度试验测定获得2个分子片段的半数有效抑制浓度IC50，结果如图1所示。图1是本发明的一个实施例的RNase L小分子片段抑制剂酶活筛选和相对应的半数有效抑制浓度(IC₅₀)测定结果。A是全长RNase L表达纯化过程中考马斯亮蓝染色实验结果，B是相对荧光强度检测结果，C是类药分子的筛选结果，D是IC₅₀测定结果，E是筛出的两种类药分子的结构式。从中可以看到，RNase L蛋白的相对分子质量为83.9kDa，获得了高浓度的野生型RNase L蛋白，纯度较高。将RNase L与RNA探针混合后在25℃条件下反应，每隔3分钟检测一次相对荧光强度得到B中的曲线。从中可以看出，实验组的RNase L蛋白具有很好的酶活性曲线特征，表明成功获得了具有生物活性的RNase L蛋白。筛选结果显示，10G5的IC₅₀为85μM，11F5的IC₅₀为681μΜ，均达到了微摩尔级别。

2.2共晶分析结果

图2是本发明的一个实施例的10G5与RNase L复合物晶体以及药物结合口袋分析结果。A是10G5与RNase L的复合物晶体和衍射数据，B是10G5与RNase L的共晶结构，C是MST技术测量RNaseL和10G5结合常数的结果。从中可以看出，10G5结合位点有两个关键带正电荷氨基酸残基R398和K503，此位点非常接近假性激酶域ADP结合口袋。MST技术测量RNaseL和10G5的结合常数为93μM，和酶活方法测量所得常数一致(83μM)。RNase L的该药物结合口袋以RNase L的假性激酶结构域为对象，组成药物结合口袋的氨基酸残基为A373、R398、D502和K503，RNase L假性激酶结构域氨基酸残基R398的原始侧链位置被10G5占据，共晶中R398侧链位于片段分子平面上方，形成Pi-Cation相互作用。组成该药物结合口袋的氨基酸残基除A373外，其他均为带电荷残基。该药物结合口袋临近假性激酶结构域ATP结合位点，可以以此使用片段连接法设计苗头化合物。

本实施例中，采用国际先进的基于片段的药物开发方法(FBDD)，筛选出了能有效抑制靶点蛋白RNase L酶的活性的类药分子，为进一步开发增强溶瘤病毒疗法抗癌效应的RNase L酶的特异性抑制剂提供了明确的方向，并可以此制备得到相应的抗肿瘤产品。

实施例2

分别取10G-1和10G-2这两种10G5的衍生物作为两抑制片段，采用微尺度热泳(Microscale thermophoresis，MST)测定抑制片段与RNase L的结合常数。结果如图3所示，图3是本发明的另一个实施例的10G5-1和10G5-2的结合常数测定结果。A是基于共晶结构的10G5衍生物分子对接示意图，B和C分别是MST方法测量衍生物10G5-1/10G5-2和RNaseL结合常数的结果。从图中可以看到，10G5-1和10G5-2的结合常数分别是14μM和10μM。

实施例3

一种抗肿瘤药物组合物，包括脑心肌炎病毒和

实施例4

一种抗肿瘤药物组合物，包括西尼罗河病毒和

实施例5

一种抗肿瘤药物组合物，包括牛痘病毒和

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。