阅读说明：本技术 一种靶向bcma的t细胞受体融合蛋白和应用 (BCMA-targeted T cell receptor fusion protein and application thereof ) 是由 张坤 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白和应用,属于肿瘤免疫药物领域。所述靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白包括：依次连接的信号肽、靶向BCMA的单链抗体、第一柔性连接序列和TCR复合体亚基,所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示,所述靶向BCMA的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示,所述第一柔性连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。该T细胞受体融合蛋白在具备高抗肿瘤活性的同时能产生更少的细胞因子,从而展现出良好的应用前景。(The invention discloses a BCMA-targeted T cell receptor fusion protein and application thereof, belonging to the field of tumor immunity drugs. The BCMA-targeting T cell receptor fusion protein comprises: the signal peptide, the single-chain antibody of targeting BCMA, the first flexible connecting sequence and the TCR complex subunit are connected in sequence, and the nucleotide sequence of the signal peptide is shown as SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of the BCMA-targeting single-chain antibody is shown as SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the first flexible connecting sequence is shown as SEQ ID NO: 3, respectively. The T cell receptor fusion protein has high anti-tumor activity and can generate less cytokines, thereby showing good application prospect.)

一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例，其中淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤的发病率居高不下，并且近年来的研究表明，血液肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)是将融合有CAR基因以核酸的形式导入到宿主T淋巴细胞基因组中构建而成。CAR-T在血液瘤中的应用中对复发、难治的B淋巴细胞白血病病人，缓解率达到90％以上。虽然CAR-T细胞可以有效的杀死肿瘤细胞，但同时也带来了细胞因子风暴的不良反应，严重时可导致患者死亡。因此，亟需一种安全的T细胞受体融合蛋白用于治疗恶性肿瘤。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白(T cell receptor fusion constructs，TRuCs)和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白，包括：依次连接的信号肽、靶向BCMA的单链抗体、第一柔性连接序列和TCR复合体亚基，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向BCMA的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：2所示，所述第一柔性连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体地，所述TCR复合体亚基为TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ。

具体地，所述TCR复合体亚基为CD3ε，且所述TCR复合体亚基的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述的T细胞受体融合蛋白。

具体地，所述载体为慢病毒载体。

再一方面，本发明实施例提供了一种T细胞受体融合蛋白的应用，所述应用包括：将所述T细胞受体融合蛋白作为抗肿瘤药物。

具体地，所述肿瘤包括：急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。

优选地，所述肿瘤为多发性骨髓瘤。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白和应用，该T细胞受体融合蛋白包括：依次连接的信号肽、靶向BCMA的单链抗体、第一柔性连接序列和TCR复合体亚基，该嵌合抗原受体不仅能够有效识别BCMA抗原表达的肿瘤细胞，而且，该T细胞受体融合蛋白在具备高抗肿瘤活性的同时能产生比CAR-T更少的细胞因子，从而展现出良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的T细胞受体融合蛋白示意图；

图2是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；

图3是本发明实施例二提供的IL-2分泌量的对比图，其中K562为不表达BCMA的细胞，K562-BCMA为表达BCMA的细胞；

图4是本发明实施例二提供的IFNγ分泌量的对比图，其中K562为不表达BCMA的细胞，K562-BCMA为表达BCMA的细胞；

图5是本发明实施例提供的TRuCs-T与靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T的IL-2分泌对比图；

图6是本发明实施例提供的TRuCs-T与靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T的IFNγ分泌对比图；

图7是本发明实施例提供的TRuCs-T与靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T的TNFα分泌对比图；

图8是本发明实施例提供的TRuCs-T与靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T的IL-4分泌对比图；

图9是本发明实施例二提供的细胞杀伤效率图，图中A为表达BCMA的K562细胞，B为不表达BCMA的K562细胞，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白，如图1所示，该T细胞受体融合蛋白包括：依次连接的信号肽、靶向BCMA的单链抗体、第一柔性连接序列和TCR复合体亚基，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向BCMA的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第一柔性连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体地，TCR复合体亚基可以为TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ。

优选地，TCR复合体亚基可以为CD3ε，且TCR复合体亚基的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

从NCBI网站数据库分别搜索到人CD8α信号区和人CD3ε胞内区基因序列信息，靶向BCMA的单链抗体的克隆号为J22.9，这些序列在网站http：//sg.idtd na.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成T细胞受体融合蛋白序列，结构为CD8α leader-Anti BC MA-CD3ε，标记为aBCMA-TRuCs。

本实施例中，该T细胞受体融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

实施例二

本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和实施例一提供的T细胞受体融合蛋白。载体可以为慢病毒载体。

下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得aBCMA-TRuCs基因序列，在aBCMA-TRuCs基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoRI，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoRI的双酶切反应，得到含有aBCMA-TRuCs的酶切片段和含有ppCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buffer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的Xba I酶；2μL的EcoR I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有aBCMA-TRuCs的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有a BCMA-TRuCs的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到aBCMA-TRuCs酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到的aBCMA-TRuCs酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-aBCMA-TRuCs-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的aBCMA-TRuCs酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffer。

将连接产物转入Stbl3感受态细胞(购置于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为2000bp的目标片段。经测序鉴定可知该目标序列为aBCMA-TRuCs基因序列。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。

采用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72ug质粒(target plasmid)、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，收集含慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μL PBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒(嵌合抗原受体的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×10⁵个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLv^TMLentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为3.6×10⁸TU/mL。

制备T细胞受体融合蛋白的T细胞，具体方法如下：

PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×10⁷个。

慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI＝5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的TRuCs-T细胞。

慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的TRuCs-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的TRuCs-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图2所示。

TRuCs-T细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过慢病毒转染后的TRuCs-T细胞是否被有效激活，本实施例采用TRuCs-T细胞和不表达TRuCs的T细胞分别与靶细胞(含BCMA靶蛋白的K562细胞)共培养后，通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×10⁶个TRuCs-T细胞和每孔1×10⁵个靶细胞接种至6孔板中，于37℃、浓度为5％的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图3和图4所示，图3为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图4为细胞因子IFNγ分泌量的对比图。结合图3和图4可知，本发明实施例提供的TRuCs-T细胞分泌的细胞因子IL-2和细胞因子IFNγ均增加，由此可知该经过慢病毒转染后的TRuCs-T细胞已经被有效激活。

比较TRuCs-T和CAR-T细胞因子分泌情况，具体操作如下：

比较本发明实施例提供的靶向BCMA的TRuCs-T细胞与现有技术中常用的靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T细胞经过抗原刺激后，细胞因子的分泌情况，其中，靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。将未转染的T细胞、靶向BCMA的TRuCs-T细胞和靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T分别与表达BCMA的K562细胞共培养后，检测IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌情况。具体地，按照每孔1×10⁶个未转染T细胞、每孔1×10⁵个靶向BCMA的TRuCs-T细胞和每孔1×10⁵个靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T接种至6孔板中，于37℃浓度为5％的CO₂培养箱中培养24h。吸取每个孔内的上清液，于1000rpm离心5min，去除细胞沉淀，得到培养上清液。按照ELISA剂盒说明书的操作方法检测该培养上清液中的IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌量，结果如图5～图8所示。由图5～图8可知，本发明实施例提供的TRuCs-T的细胞因子分泌量明显少于靶向BCMA的CD28-CD3ζCAR-T的细胞因子分泌量，可见，本发明实施例提供的TRuCs-T细胞能够有效减少细胞因子分泌，避免产生细胞因子风暴。

体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL1×10⁴个靶细胞(记作Ack)，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝10∶1)。①组靶细胞为含BCMA靶蛋白的K562细胞，效应细胞为转染的TRuCs-T细胞。

②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为含BCMA靶蛋白的K562细胞，效应细胞为未转染的T细胞(不表达TRuCs结构的T细胞)。

将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Acn为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不含细胞的培养基和CCK-8溶液)。图9为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图9所示，本发明实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的TRuCs-T细胞对K562细胞杀伤能力明显优于不含TRuCs结构的T细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有良好的抗肿瘤活性。

又一方面，本发明提供了一种上述T细胞受体融合蛋白的应用，应用包括：将嵌合体抗原受体作为抗肿瘤药物。

具体地，肿瘤可以包括：急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。

优选地，肿瘤可以为多发性骨髓瘤。

本发明实施例提供了一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白及其表达载体和应用，该T细胞受体融合蛋白包括：依次连接的信号肽、靶向BCMA的单链抗体、第一柔性连接序列和TCR复合体亚基，该T细胞受体融合蛋白不仅能够有效识别BCMA抗原表达的肿瘤细胞，而且，该T细胞受体融合蛋白在具备高抗肿瘤活性的同时能产生比CAR-T更少的细胞因子，从而展现出良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种靶向BCMA的T细胞受体融合蛋白和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro

20

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Ser Ala Thr

20 25 30

Thr Pro Ser Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Val Thr Val

35 40 45

Gly Gly Ile Ala Pro Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Ala Pro Ser Leu

50 55 60

Leu Ala Leu Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Thr Leu Thr

65 70 75 80

Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr Gly Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Ala Ala Thr Leu Ser Cys Leu Ala

145 150 155 160

Ser Gly Ser Val Gly Ser Ala Val Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly

165 170 175

Gly Ala Pro Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly

180 185 190

Ile Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Pro Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Ala Pro Ala Val Thr Thr Cys Gly

210 215 220

Gly Thr Ala Ala Thr Pro Leu Thr Pro Gly Ala Gly Thr Leu Leu Gly

225 230 235 240

Leu Leu

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Gly Thr His Thr Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Thr Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gly Thr Pro Thr Leu Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Ile Leu Thr Gly His Ala Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Gly Gly Ala Gly Ala Ala Leu Ala Ile Gly Ser Ala Gly Ala

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Leu Gly Pro Ser Gly Leu Gly Gly Ser Gly Thr Thr

85 90 95

Val Cys Thr Pro Ala Gly Ser Leu Pro Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu

100 105 110

Thr Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Ala Cys Met Gly Met Ala Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Ala Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Thr Thr Thr Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu

145 150 155 160

Pro Val Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala

165 170 175

Leu Gly Ala Pro Pro Pro Val Pro Ala Pro Ala Thr Gly Pro Ile Ala

180 185 190

Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Ser Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ile

195 200 205

<210> 5

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gly Pro Gly Gly Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro

35 40 45

Thr Pro Ser Ala Thr Thr Pro Ser Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu

50 55 60

Gly Leu Val Thr Val Gly Gly Ile Ala Pro Ser Ser Ser Thr Ile Ala

65 70 75 80

Thr Ala Pro Ser Leu Leu Ala Leu Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Leu Ala Thr Leu Thr Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr

100 105 110

Ala Val Thr Thr Cys Ala Ser Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Thr

115 120 125

Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gly Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Ala Ala Thr

165 170 175

Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Ser Val Gly Ser Ala Val Ala Thr Thr

180 185 190

Gly Gly Leu Pro Gly Gly Ala Pro Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ala Ser

195 200 205

Leu Ala Pro Ser Gly Ile Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Gly Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Ala Pro Ala

225 230 235 240

Val Thr Thr Cys Gly Gly Thr Ala Ala Thr Pro Leu Thr Pro Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Leu Leu Gly Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Ser Gly Thr His Thr Ala Val Leu

275 280 285

Gly Leu Cys Leu Leu Ser Val Gly Val Thr Gly Gly Ala Gly Ala Gly

290 295 300

Gly Met Gly Gly Ile Thr Gly Thr Pro Thr Leu Val Ser Ile Ser Gly

305 310 315 320

Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Ile Leu

325 330 335

Thr Gly His Ala Ala Leu Ala Ile Gly Gly Ala Gly Ala Ala Leu Ala

340 345 350

Ile Gly Ser Ala Gly Ala His Leu Ser Leu Leu Gly Pro Ser Gly Leu

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Thr Thr Val Cys Thr Pro Ala Gly Ser Leu Pro Gly

370 375 380

Ala Ala Ala Pro Thr Leu Thr Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Ala Cys

385 390 395 400

Met Gly Met Ala Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Ala Ile

405 410 415

Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Thr Thr Thr Ser Leu Ala

420 425 430

Ala Leu Ala Leu Ala Leu Pro Val Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly

435 440 445

Ala Gly Ala Gly Gly Ala Leu Gly Ala Pro Pro Pro Val Pro Ala Pro

450 455 460

Ala Thr Gly Pro Ile Ala Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Ser Gly Leu

465 470 475 480

Ala Gly Ala Ala Ile

485

<210> 6

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctggtgga atctggcgga ggactggtgc agcctggcgg ctctctgaga 120

ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttc agccggtact ggtttagctg ggtgcgccag 180

gcccctggca agggactcgt gtgggtggga gagatcaacc ccagcagcag caccatcaac 240

tacgccccca gcctgaagga caagttcacc atcagcagag acaacgccaa gaacaccctg 300

tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgccagcctg 360

tactacgact acggcgacgc ctacgattac tggggccagg gcacactggt gactgttagc 420

tccggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga gatcgtgatg 480

acacagagcc ctgccaccct gagcgtgtcc ccaggcgaaa gagctaccct gagctgcaag 540

gccagccaga gcgtggaaag caacgtggcc tggtatcagc agaagcccgg acaggctcct 600

cgggccctga tctacagcgc cagcctgaga ttcagcggca tccccgccag gtttagcggc 660

tctggcagcg gcaccgagtt caccctgaca atcagcagcc tgcagagcga ggactttgcc 720

gtgtattact gccagcagta caacaactac cccctgacct tcggagccgg caccaagctg 780

gagctgaagt tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaaca ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 1080

cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1140

gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1200

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1260

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag 1320

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1440

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1494