阅读说明：本技术 一种高产脂肪酶酶活菌株的筛选方法 (Screening method of high-yield lipase live strains ) 是由 蔡志强 张宇 纪元 郭静 朱孝霖 杨广花 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物发酵工程领域,具体公开了一种高产脂肪酶酶活菌株的筛选方法。采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变菌株,在致死率为70-90％的条件下成功筛选出一株酶活高达73.33U/g的产酶菌株。并通过后续优化试验确定菌株最适的培养基组分以及生长条件：豆粕20g,初始含水量68％,葡萄糖含量3％,蛋白胨含量1％,猪油含量5％,CaCl<Sub>2</Sub> 0.04％,FeCl<Sub>3</Sub> 0.04％,接种量4％,培养温度28℃,培养3天后酶活高达93.33U/g,大大提高了菌株产酶能力,达到理想目标。(The invention belongs to the field of biological fermentation engineering, and particularly discloses a screening method of a high-yield lipase live strain. An enzyme-producing strain with the enzyme activity as high as 73.33U/g is successfully screened out by adopting an Ethyl Methane Sulfonate (EMS) mutagenesis strain under the condition that the lethality is 70-90%. And determining the optimal culture medium components and growth conditions of the strain through subsequent optimization experiments: 20g of soybean meal, 68 percent of initial water content, 3 percent of glucose content, 1 percent of peptone content, 5 percent of lard oil content and CaCl 2 0.04％，FeCl 3 0.04 percent, 4 percent of inoculation amount, 28 ℃ of culture temperature, and the enzyme activity after 3 days of culture is as high as 93.33U/g, thereby greatly improving the enzyme production capability of the strain and achieving the ideal target.)

一种高产脂肪酶酶活菌株的筛选方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程领域，特别涉及一种高产脂肪酶酶活菌株的筛选方法。

背景技术

脂肪酶，是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于能源、油脂加工、食品、医药等行业领域。自然界中，脂肪酶普遍存在于植物种子、动物组织及微生物中，其中，工业用脂肪酶多源于微生物。1834年初，埃伯尔首次在兔胰中检测出脂肪酶酶活。微生物体内脂肪酶的含量丰富、种类繁多、分布广泛、具有优于动植物的适应能力等优势，因此如今微生物是工业酶生产的主要方式。在微生物发酵工业中，菌种是直接决定产品质量和产量是否达标的关键性因素，一般从自然界分离到的菌株积累产物能力非常低，无法实现规模化生产要求，因此需要对菌种进行改造或改良，即育种。常用的诱变方式主要有三种，即物理、化学，复合诱变法。

在当今社会，由于食品工业的迅猛发展，消费者的食品安全和健康意识日益增强，对面粉及豆制品的要求越来越高。若想生产好的面粉，就要有优质的原材料,所以需要在食品处理中添加催化酶，酶的催化效率特别高，比普通催化剂高出100倍以上，它不仅能提高面包的烘焙品质，还可以延长制品的保质期。

另外，随着社会能源储量的减少，人类不断开发机油、汽油等替代燃料，其中生物柴油是一种清洁的理想替代燃料。生物柴油是由动物或植物油脂与短链醇制备脂肪酸酯。截止目前为止，制备柴油仍存在诸多不足之处，对环境造成很多不好的影响，脂肪酶能催化反应，并且作用条件温和，不会出现一系列副反应。因此，开发出脂肪酶制备生物柴油的工艺显得十分重要。

发明内容

本发明的目的是解决目前国内脂肪酶酶活普遍偏低，无法进行工业生产酶制剂，从而制定出一套针对青霉菌属Penicillium sp.Y-21的诱变方法及其固态发酵条件的优化，最终使该菌株的酶活相比原始菌株的48.67U/g提高了91.76％达到93.33U/g。

为实现上述目的，本发明采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变法来突变菌株，该诱变技术通过下述步骤进行：

(1)将2ml的孢子悬液与甲基磺酸乙酯(EMS)均匀混合后进行振荡诱变反应；

(2)诱变结束后添加Na₂S₂O₃消除诱变剂，终止反应，取一定量处理液采用无菌生理盐水稀释100倍，然后涂布到平板中进行培养。

(3)挑选菌株进行复筛固体发酵培养，得到1株高产脂肪酶酶活菌株Penicilliumsp.Y-21。

其中，步骤(1)所述的孢子悬液配置方法为：

将青霉菌(Penicillium sp.)放入种子培养基中培养2天后，取2ml种子液加入到离心管中，3,000rpm离心5min，弃上清后加入生理盐水冲洗2次，3,000rpm再次离心5min，弃上清，加入5ml磷酸缓冲液制成孢子悬液。

其中，种子培养基的组成如下：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄1g/L，琼脂粉20g/L。

磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的组成如下：KH₂PO₄ 3.92g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 79.24g/L。

所述的甲基磺酸乙酯在混合溶液中的体积浓度为1-5％，反应时间为0-60min，终止反应所添加的NaS₂O₃体积量与EMS的添加量相同。

步骤(2)所述固体发酵培养培养基的组成如下：以20g固体基质(米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉)，初始含水量为培养基总质量的60-75％，单一碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖)含量为固体基质总质量的1-8％，发酵氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH₄Cl、KNO₃)含量为固体基质总质量的1％，诱导油(橄榄油、大豆油、椰子油、油脂、猪油)含量为固体基质总质量的5％，金属离子(MgSO₄、CaCl₂、FeCl₃、K₂HPO₄、BaCl₂)含量为固体基质总质量的0.02-0.1％。

固体发酵培养的条件为：接种量2-10％，培养温度28℃，培养时间3天。

最优固体发酵培养培养基的组成为：以20g豆粕为固体基质，初始含水量为培养基总质量的68％，葡萄糖含量为固体基质的3％，蛋白胨含量为固体基质的1％，猪油含量为固体基质的5％，CaCl₂为固体基质的0.04％，FeCl₃为固体基质的0.04％，发酵培养的生长条件为：接种量4％，培养温度28℃，培养时间3天。

本发明在诱变结束后还提供了对菌株发酵培养基的优化方案。通过对培养基组分中固体基质、碳氮源及其浓度、含水量、接种量、金属离子及其浓度、油脂诱导剂的选择，建立单因素试验和正交试验从而得到菌株产酶最高的培养基组分。同时本发明采用固体发酵培养菌株，使得在操作过程中具有操作简便、能耗低、发酵过程易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染等优点。

附图说明

图1为青霉菌(Penicillium sp.)Y-21在不同固体基质下发酵生长曲线图；

图2为接种量对菌株产酶的影响；

图3为初始含水量对菌株产酶的影响；

图4为碳源对菌株产酶的影响；

图5为碳源浓度对菌株产酶的影响；

图6为氮源对菌株产酶的影响；

图7为氮源浓度对菌株产酶的影响；

图8为金属离子对菌株产酶的影响；

图9为金属离子浓度(Ca²⁺浓度)对菌株产酶的影响；

图10为金属离子浓度(Fe³⁺浓度)对菌株产酶的影响；

图11为油脂诱导剂对菌株产酶的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明，这些实施例仅用于解释说明的目的，并不对本发明做任何形式的限定。本发明采用的试剂均为市售分析纯及以上，试验所用菌株为常州大学实验室保藏菌株。本发明中测定脂肪酶酶活(鲜曲酶活)能力的方法采用的是指示剂滴定法，具体方法见中华人民共和国国家标准法发布的GB/T 23535-2009。

实施例1

青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的诱变

(1)青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的初筛

将从常州大学菌种保藏室中取出的青霉菌(Penicillium sp.)放入种子培养基中培养2天后，取2ml种子液加入到离心管中，3,000rpm离心5min，弃上清后加入生理盐水冲洗2次，3,000rpm再次离心5min，弃上清，加入5ml磷酸缓冲液制成孢子悬液。将制成的孢子悬液与甲基磺酸乙酯(EMS)原液混匀制成1-5％体积浓度的甲基磺酸乙酯母液振荡反应0-60min，对照加入与EMS相同体积量的生理盐水，诱变结束后再次加入与EMS相同体积量的Na₂S₂O₃静置10min，3,000rpm离心5min后留1mL处理液。再用无菌生理盐水稀释100倍处理液，将稀释好的菌液涂布到固体平板培养基上，待培养基上长出单菌落后进行复筛。

种子培养基的组成如下：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，琼脂粉20g/L。磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的组成如下：KH₂PO₄ 3.92g/L，Na₂HPO₄·12H₂O79.24g/L。

(2)青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的复筛

1.从致死率在70-90％的平板中共挑选出形状、大小、色度不一的23株诱变菌(见表1)进行固体发酵培养，接种量2mL，培养温度28℃，培养时间3d。发酵结束后根据国标方法测定这23株菌所产脂肪酶酶活，从中挑选出酶活最高的一株菌(#21)进行后续的优化。

以20g豆粕为固体基质，初始含水量为培养基总质量的70％，葡萄糖含量为固体基质的4％，蛋白胨含量为固体基质的1％，橄榄油含量为固体基质的1％，MgSO₄为固体基质的0.02％，CaCl₂为固体基质的0.02％。

表1甲基磺酸乙酯(EMS)诱变复筛表

本实施例说明，通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变后筛选出一株产酶活最高菌株(#21)，酶活可达73.33U/g，相比原始菌株的酶活提高了50.66％。

实施例2

选取Penicillium sp.Y-21生长的最优固体基质，采用米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉发酵菌株，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：

在超净工作台中，用接种环从平板中挑取少许菌接入已灭好菌的种子培养基中，培养至对数生长期后按2％的接种量接入到上述提到的以米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉为固体基质的发酵培养基中，在28℃恒温培养箱中培养3天，取样测定菌株所产酶活，结果如图1所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，在发酵第3天时，菌株所产脂肪酶酶活最高，达到70U/g；以麸皮、米糠为发酵底物时，菌株所产酶活微乎其微。因此我们最终选择以豆粕为菌株发酵底物来进行后续培养基组分的优化。

实施例3

确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中的最适接种量，选取2％、4％、6％、8％、10％的接种量接入到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图2所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，按4％的种子接种量接入到发酵培养基中培养至第3天时，菌株所产脂肪酶酶活最高，达到74.49U/g。因此我们最终选择4％为适合菌株产酶的最佳接种量。

实施例4

确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中的最佳初始含水量，选取60％、65％、70％、75％的初始含水量添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图3所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，按4％的接种量接入到初始含水量为70％的发酵培养基中培养至第3天时，菌株所产脂肪酶酶活最高，达到75.04U/g。

实施例5

确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适碳源及其浓度，选取了葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖为发酵碳源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的碳源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：

发酵培养基配制过程中选取葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖为单一碳源并保证其他变量不变，培养基制备完成后115℃灭菌30min。在超净工作台中，用灭好菌的枪头吸取2mL种子液接入到发酵培养基中，再用无菌玻璃棒将培养基搅拌均匀放入28℃恒温培养箱中培养3天后，取样测酶活。从中挑选出适合菌株产酶的最佳碳源，进而优化其碳源浓度，结果如图4,5所示。

本实施例说明，适合菌株产酶的最适碳源为葡萄糖，以葡萄糖为碳源发酵脂肪酶酶活可达75.67U/g，进而优化葡萄糖浓度为4％时，菌株所产酶活最高，达到78.76U/g。

实施例6

确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适氮源及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，选取了牛肉膏、蛋白胨、NH₄Cl、KNO₃为发酵氮源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的氮源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图6,7所示。

本实施例说明，适合菌株产酶的最佳氮源为蛋白胨，以蛋白胨为氮源发酵菌株脂肪酶酶活可达78.59U/g，进而优化蛋白胨浓度为1％时，菌株所产酶活最高，达到79.17U/g。

实施例7

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适金属离子及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，选取了一定量的MgSO₄、CaCl₂、FeCl₃、K₂HPO₄、BaCl₂添加到发酵培养基中，而后选择0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％的金属离子浓度再次添加到发酵培养基中，确定适合菌株产酶的最适金属离子浓度，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图8,9所示。

实施例8

为了验证该菌株(Penicillium sp.Y-21)是否为油脂诱导型产酶菌株，我们在发酵培养基中添加了相同体积量的橄榄油、大豆油、椰子油、油脂、猪油，然后以不加油的培养基作为对照，培养3天后取样测酶活，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图10所示。

本实施例说明，该菌株(Penicillium sp.Y-21)为油脂诱导型产酶菌株，菌株在不添加诱导油的培养基中发酵酶活只能达到50.12U/g，在添加猪油的培养基中发酵酶活最高能达到90.33U/g。

实施例9

通过实施例4、5、6、8的单因素试验，为了更好探究菌株产酶条件，我们选取葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、初始含水量、猪油浓度四个因素进行4因素3水平的正交设计试验，正交试验的具体因素水平见表1。根据正交设计助手软件设计的正交表进行试验，试验结果见表2。

表1正交试验因素水平表

表2正交试验结果表

本实施例说明，影响脂肪酶酶活的因素从主到次分别为：猪油含量，蛋白胨含量，初始含水量，葡萄糖含量。菌株Penicillium sp.Y-21的最优产酶条件为：以20g豆粕为固体基质，初始含水量为培养基总质量的68％，葡萄糖含量为固体基质的3％，蛋白胨含量为固体基质的1％，猪油含量为固体基质的5％，CaCl₂为固体基质的0.04％，FeCl₃为固体基质的0.04％，发酵培养的生长条件为：接种量4％，培养温度28℃，培养时间3天。以上述条件发酵菌株，三天后测定酶活高达93.33U/g，相比原始菌株提高了91.76％，大大提高了菌株产酶能力，达到理想目标。