阅读说明：本技术 一种利用淀粉废水发酵生产多糖的方法 (Method for producing polysaccharide by fermenting starch wastewater ) 是由 周文文 高凌霄 王珏帆 汪旖清 钱超 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用淀粉废水发酵生产多糖的方法,以淀粉废水为原料,利用多粘类芽孢杆菌进行发酵。本发明包括生产菌在淀粉废水中生长与多糖发酵适用性验证以及淀粉废水中芽孢杆菌生长与发酵曲线的测定,其中多粘类芽孢杆菌在淀粉废水中发酵多糖的生产方法,主要流程是在pH调节至中性的淀粉废水中接入芽孢杆菌在恒温下震荡培养。本发明公开的多糖生产方法不仅能够以较高的产糖效率生产得到具有多种用途的胞外多糖,而且以工业淀粉废水为原料,能够大大降低生产成本,同时发酵过程中能够明显降低废水中的淀粉和蛋白质等有机物含量,有效减少工业废水污染,具有极大的发展潜力。(The invention discloses a method for producing polysaccharide by fermenting starch wastewater, which takes the starch wastewater as a raw material and utilizes paenibacillus polymyxa to ferment. The invention comprises the verification of the growth of production bacteria in starch wastewater and the suitability of polysaccharide fermentation and the determination of growth and fermentation curves of bacillus in the starch wastewater, wherein the production method for fermenting polysaccharide by paenibacillus polymyxa in the starch wastewater mainly comprises the step of inoculating bacillus into the starch wastewater with the pH adjusted to be neutral and carrying out shake culture at a constant temperature. The polysaccharide production method disclosed by the invention can be used for producing extracellular polysaccharide with multiple purposes at high sugar production efficiency, and can be used for greatly reducing the production cost by taking industrial starch wastewater as a raw material, and meanwhile, the content of organic matters such as starch, protein and the like in the wastewater can be obviously reduced in the fermentation process, so that the industrial wastewater pollution is effectively reduced, and the polysaccharide production method has great development potential.)

一种利用淀粉废水发酵生产多糖的方法

技术领域

本发明属于微生物技术及糖的生产技术领域，特别涉及一种以淀粉废水为原料，利用多粘类芽孢杆菌发酵生产多糖的方法。

背景技术

淀粉废水是指在淀粉原料加工过程中产生的废弃液体，它是一种酸性且含有高浓度有机物的废水，是目前食品行业产生的污染程度较高的几种废水品类之一。根据我国环保部发布的《淀粉废水治理工程技术规范》，淀粉生产工厂会根据其最终获得淀粉废水的生物化学特性来选择废水处理的手段，目前主流的处理手段为凝絮沉淀以及生物处理，或是这两种方法相结合。但是淀粉废水中往往含有高浓度有机化合物如淀粉、多糖、粗蛋白、脂肪和粗纤维等，具有极高的资源化再利用价值(Jin B,Huang LP,Lant P.Rhizopusarrhizus-a producer for simultaneous saccharificationand fermentation ofstarch waste materialsto l(+)-lactic acid[J].Biotechnology Letters,2003,25(23):1983-1987.)。因此如果对淀粉废水进行合理地处理提升其再利用条件后对其进行再利用，可以有效的提升资源利用率，同时又可以起到减毒减害的作用。

多粘类芽孢杆菌胞外多糖是具有很高应用价值的发酵产物，可以作为食品、染料的稳定剂；医疗用的***或制成稳定的乳状液；用于生物选矿改善矿石表面的亲水性；化妆品的拼料；以及制成生物化学、医药工业和试验室用的吸附剂、固定化酶或固定化细胞的载体等(刘振华,井长勤,周晨妍.生防细菌多粘类芽孢杆菌多糖研究进展[J].上海农业学报,2015,31(4):146-150.)。由多粘类芽孢杆菌产生的胞外多糖具有较强的体外和体内抗氧化活性，可以作为天然的抗氧化剂应用于食品和医药工业等。因此利用多粘类芽孢杆菌处理淀粉废水，不仅能够得到胞外多糖产物，还能够减少淀粉废水中的主要有机污染物含量，在微生物多糖的生产，降低工业污染与环境保护具有良好前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用淀粉废水发酵生产多糖的方法，同时提供淀粉废水的适用性验证方法，以较高的效率生产得到具有多种应用领域的胞外多糖，并且能够减少淀粉废水对环境的污染，具有巨大的发展潜力。

本发明是通过以下技术方案实现的。

多粘类芽孢杆菌菌株，其保藏名称为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PYQ1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16444，保藏日期为2018年9月10日。所述的多粘类芽孢杆菌菌株PYQ1在申请号为CN201811216217.0的发明中已经公布。

一种利用淀粉废水发酵生产多糖的方法，步骤如下：

(1)多粘类芽孢杆菌菌株在平板培养基上活化，然后将活化后的菌种接种在种子培养基中，30-37℃条件下摇瓶培养8-12h，得到多粘类芽孢杆菌种子液；

(2)将淀粉废水调节pH至中性；以体积百分比1.5-2.5％接种量接种步骤(1)得到的种子液至淀粉废水，在25℃-35℃、转速150-220rpm的摇床中振荡培养48-72h。

作为本发明的优选，所述平板培养基各成分的质量体积分数分别为：1-2％蔗糖、0.5-1％蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.3％磷酸氢二钠、2％琼脂条，115℃高压蒸汽灭菌后倒平板。

作为本发明的优选，所述的种子培养基各成分的质量体积分数分别为：5％蔗糖、0.5％胰蛋白胨、0.1％酵母浸粉、0.3％磷酸氢二钠。

作为本发明的优选，在将多粘类芽孢杆菌菌种接入淀粉废水之前，所述淀粉废水首先需要经过废水中微生物生长和多糖发酵适用性验证，验证方法为：

a)废水中微生物生长适用性验证：将淀粉废水pH调节至中性后接入多粘类芽孢杆菌菌落，在30-37℃的环境下进行摇床培养24-48h后涂布计数，若最大数量达到10⁸CFU/mL则满足微生物生长的适用性；

b)多糖发酵适用性验证：将淀粉废水pH调节至中性后加入琼脂条制得淀粉废水平板，取多粘类芽孢杆菌菌液划线，30-37℃条件下摇床培养24-48h后观察废水平板上菌落***，若菌落***产生连续的糊状物质，挑起有丝状黏连，则满足多糖发酵的适用性，否则不满足。

本发明还提供了上述多糖作为晒后损伤修复剂的应用。将多糖作为晒后损伤修复护肤品的添加剂，在皮肤受到UV损伤之后，0-4h之内将含多糖的护肤品涂抹于受损皮肤上以起到晒后修复效果。护肤品中的多糖的添加量为100μg/mL-1000μg/mL。

本发明具备的有益效果是：

本发明提供的微生物生长与多糖发酵适用性验证实验，能够初步筛选出多粘类芽孢杆菌能正常生长与发酵产糖的淀粉废水，再通过60h内发酵曲线与生长曲线的绘制，得到该淀粉废水的产糖适用性与产糖能力结论，达到了对淀粉废水发酵可行性的系统评估，极大可能地避免了发酵失败的可能性。

本发明提供的多糖生产方式不仅能够在短时间内高效产糖，而且利用淀粉废水为原料，且不需添加其他营养物质，能够大大减少生产成本，有效减少淀粉废水中的淀粉和蛋白质等有机污染物，达到减少环境污染的作用，具有节约成本，简单高效，减少污染等优势。

附图说明

图1本发明方法在不同淀粉废水中多糖发酵情况判定结果；其中，A为小麦淀粉提取废液，B为土豆淀粉提取废液，C为玉米淀粉提取废液；

图2本发明方法多粘类芽孢杆菌在三种淀粉废水中的生长曲线；

图3本发明方法多粘类芽孢杆菌在三种淀粉废水中的发酵产糖曲线；

图4小麦淀粉废水发酵多糖的DEAE洗脱曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。

在多糖制备之前，首先配置培养基，制备种子液。使用的培养基包括平板培养基、种子培养基、废水发酵培养基和产糖培养基，其中产糖培养基作为阳性对照组。

平板培养基：2％蔗糖、1％蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.3％磷酸氢二钠、2％琼脂条，115℃高压蒸汽灭菌后倒平板。

种子培养基：蔗糖5％、胰蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.1％、磷酸氢二钠0.3％，30℃条件下摇瓶培养。

废水发酵培养基：淀粉废水。

产糖培养基：蔗糖5％、胰蛋白胨0.5％、酵母粉0.1％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.3％，余量为蒸馏水。所有组成成分添加量单位％等同于g/100ml。

多粘类芽孢杆菌菌株在平板培养基上活化，然后将活化后的菌种接种在种子培养基中，30℃条件下摇瓶培养12h，得到多粘类芽孢杆菌种子液。

实施例1：废水中生长与多糖发酵适用性验证

废水中微生物生长适用性验证：

1)蘸取多粘类芽孢杆菌种子液扩培后的菌液，在平板上划线，经48h后，在平板上形成较为明显的分离的菌落；

2)调节玉米淀粉废水、小麦淀粉废水、土豆淀粉废水三种生产废水的pH至中性，用竹签蘸取平板上菌落加入废水中，在30℃的环境下进行摇床培养；

3)摇床培养48h后，对废水菌液进行计数，由于淀粉废水本身为浑浊液，比浊法无法适用，因此采用涂布计数法。将获得的淀粉废水培养液分别稀释4、5、6个数量级，然后在平板上培养48h后进行涂布计数，通过分析相应实验数据得出结论。

多糖发酵适用性验证：

1)调节玉米、小麦、土豆三种淀粉废水的pH至中性，加入琼脂条制得淀粉废水平板；

2)用竹签蘸取多粘类芽孢杆菌种子液扩培后的菌液于三块平板，在平板上进行划线培养，在30℃条件下摇床培养48h；

3)培养48h后，得到如图1所示的多糖发酵情况，通过观察三种淀粉废水平板上菌落***都产生了连续的糊状物质，挑起有丝状黏连，判断这三种淀粉废水均满足多糖发酵适用性。

实施例2：多粘类芽孢杆菌在淀粉废水中的生长、发酵曲线测定

生长曲线测定：

1)取玉米、小麦、土豆三种不同的淀粉废水调节pH至中性。每个种类的培养基均设置三组平行样本，接种种子液后在30℃，150rpm摇床进行连续培养，监测总时长为60h；

2)前12h每隔3h取一次样，12-36h内每隔4h取一次样，36-60h内每隔6h取一次样，将每个时间点取得的废水样根据预实验的实验结果，选择一定的稀释倍数，将废水分别稀释到相应梯度进行涂布计数；

3)对数据进行处理，绘制生长曲线，得到如图2所示的多粘类芽孢杆菌在三种淀粉废水中的生长曲线，证明在淀粉废水中多粘类芽孢杆菌能够正常生长。

发酵曲线测定：

1)取玉米、小麦、土豆三种不同的淀粉废水调节pH至中性。每个种类的培养基均设置三组平行样本，接种种子液后在30℃，150rpm摇床进行连续培养，监测总时长为60h；

2)前12h每隔3h取一次样，12-36h内每隔4h取一次样，36-60h内每隔6h取一次样，将每个时间点取得的废水样根据预实验的实验结果，选择一定的稀释倍数，用硫酸-苯酚测总糖的方法对不同时间点芽孢杆菌的产糖量进行测定；

3)对数据进行处理，绘制发酵曲线，得到如图3所示的多粘类芽孢杆菌在三种淀粉废水中的发酵产糖曲线，证明在淀粉废水中多粘类芽孢杆菌能够高效产糖。以产糖培养基为阳性对照组，如图3小麦淀粉废水组在前30h的淀粉产量都要高于对照组，且在48h内的最高产糖量与对照差别不大，因此小麦淀粉废水可作为一种芽孢杆菌高效发酵产糖的原料。

实施例3：淀粉废水发酵多糖的纯化分析

将小麦淀粉废水发酵得到的多糖菌液经过提取，除杂，纯化后经过DEAE-52纤维素离子交换柱洗脱：

1)预处理：取一定量DEAE-纤维素柱材料，纯水充分溶胀后，加入0.5M NaOH，边搅拌边浸泡1h，再用纯水充分浸泡洗涤洗到中性。随后加入0.5M HCl，边搅拌边浸泡1h，用纯水充分浸泡洗涤洗到中性。再次加入0.5M NaOH，边搅拌边浸泡1h，用纯水充分浸泡洗涤洗到中性即可完成预处理；

2)装柱：选择柱材料相应体积层析柱，用纯水清洗，在底部加入棉花充分覆盖后向层析柱内加入DEAE-纤维素柱材料，在加入过程中要注意观察是否有气泡产生并及时出去。约填满三分之二的柱体积即可，在柱材料上加一片滤纸分离液面；

3)样品洗脱：加入5mL样品，配置0.1-0.5mol/L5个不同梯度的NaCl溶液，依次进行洗脱。用恒流泵控制洗脱液进入柱子的流速恒定，用定时收集器进行组分收集；

4)洗脱曲线绘制：用硫酸-苯酚法测定不同时间洗脱液的含糖量，绘制洗脱曲线，得到如图4所示的小麦淀粉废水发酵多糖的DEAE洗脱曲线，观察分析洗脱情况，形成了2个不同的峰，说明小麦淀粉废水发酵多糖由两个不同分子量的组分构成。