阅读说明：本技术 一种从烟草根茎中提取的异喹啉生物碱类化合物及其应用 (Isoquinoline alkaloid compound extracted from tobacco rhizome and application thereof ) 是由 曾婉俐 高茜 向海英 杨光宇 李雪梅 李晶 黄海涛 王晋 许�永 宋春满 孔维松 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从烟草根茎中提取的异喹啉生物碱类化合物及其应用。该化合物以烟草根茎为原料,经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离纯化后得到。分子式为C<Sub>16</Sub>H<Sub>17</Sub>NO<Sub>2</Sub>,具有下述结构式：<Image he="379" wi="657" file="DDA0002188911610000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>命名为：1-(6-羟基-7-异戊烯基-异喹啉-1-基)乙酮。该化合物具有重金属螯合功能的官能基团,能和重金属元素生成稳定的螯合物,在卷烟滤嘴中添加使用能显著降低卷烟烟气重金属元素的含量,同时对卷烟烟气没有明显的负面影响,和卷烟原有的味感协调性好,入口略带苦凉味和回甜感,还对卷烟抽吸的刺激性和余味有改善作用。本发明生产原料易得,且能变废为宝,成本低,化合物安全、无毒、制备工艺简单,具备大规模推广应用的条件。(the invention discloses an isoquinoline alkaloid compound extracted from tobacco roots and stems and application thereof, wherein the compound is obtained by taking the tobacco roots and stems as a raw material and separating and purifying the tobacco roots and stems by ethyl acetate extraction, silica gel column chromatography and high performance liquid chromatography, and has a molecular formula of C 16 H 17 NO 2 , and has a structural formula of named as 1- (6-hydroxy-7-isopentenyl-isoquinoline-1-yl) ethanone.)

一种从烟草根茎中提取的异喹啉生物碱类化合物及其应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体是涉及一种从烟草根茎中首次提取分离得到的异喹啉生物碱类化合物。该化合物具有重金属螯合功能的官能基团，能和游离态重金属元素生成稳定的螯合物，因此，本发明还涉及该化合物在降低卷烟烟气重金属含量中的应用。

背景技术

烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的研究，目前已从烟草中鉴定出来的单体化学物质超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，从中发现有开发利用价值的先导性化合物。烟草根茎为烟叶生产过程中的废弃物，但烟草根茎中也富含大量有综合利用价值的成分，如：含有大量植物纤维，烟茎可以压制纤维板或制成活性炭等；烟草茎杆中还含有相当多的果胶和果胶酶、树脂，果胶是多种工业大规模使用的化工产品。用烟草的根茎及低次档烟叶，可提取烟碱，烟碱有杀菌，止血功能，能防治农作物害虫及家畜皮肤寄生虫。特别是近几年来，国内外科研工作者从烟草根茎中发现了多个具有抗菌、抗氧化、抗病毒等活性的次生代谢产物，显著提升了烟草根茎的综合利用价值。

卷烟主流烟气中As、Pb、Cd、Ni、Cr等重金属元素为Hoffman名单中的有害物质。有研究表明，吸烟男性血镉浓度明显比不吸烟者高。因此，卷烟微量重金属控制是关系到吸烟安全性的重要问题，研究如何降低卷烟燃吸过程中的重金属含量具有重要的科学意义和应用价值。

本发明通过对烟草根茎化学成分的研究，提取分离得到了一种新的异喹啉生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。值得一提的是该化合物具有有重金属元素螯合功能的基团，能和重金属元素生成稳定的五元环螯合物，并能有效地截留卷烟主流烟气中的重金属元素，具有显著降低卷烟烟气重金属元素含量的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的异喹啉生物碱类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述异喹啉生物碱类化合物的方法。

本发明的目的还在于提供所述异喹啉生物碱类化合物在降低卷烟主流烟气重金属元素含量中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

一种异喹啉生物碱类化合物，其分子式为C₁₆H₁₇NO₂，具有下述结构式：

该化合物命名为：1-(6-羟基-7-异戊烯基-异喹啉-1-基)乙酮，英文名为：1-(6-hydroxy-7-prenyl-isoquinolin-1-yl)ethanone。

制备所述异喹啉生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)浸膏提取：取烟草根茎晒干，粉碎到35～60目，将粉碎后的样品置于玻璃反应釜中，用95％的乙醇回流提取2次，合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液稀释，再用乙酸乙酯萃取2次；萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得到生物碱部位浸膏；

(2)硅胶柱层析：步骤(1)所得浸膏用重量比1.5～3倍量的丙酮或者甲醇溶解，然后用浸膏重量0.8～1.6倍的80～100目硅胶拌样；装柱硅胶为160～200目，用量为浸膏重量的3～8倍；以体积比20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

(3)高效液相色谱分离：取8:2的氯仿-丙酮洗脱液进行高效液相色谱分离纯化：以58％甲醇水溶液为流动相，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，流速20mL/min，紫外检测器检测波长为338nm，每次进样0.5～1.0mL，收集34.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异喹啉生物碱类化合物粗品。

步骤(3)中，经高效液相色谱分离纯化后得到的化合物粗品再用纯甲醇溶解，并以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，得到的黄色胶状物，即为化合物纯品。

化合物的结构鉴定：

本发明化合物为黄色胶状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为278.1152[M+Na]⁺，结合¹H和¹³C NMR谱确定分子式为C₁₆H₁₇NO₂，为生物碱类化合物，且化合物的不饱和度为9。其红外光谱显示化合物中有羟基(3412cm^-1)、羰基(1665cm^-1)和芳环(1612、1568和1453cm^-1)信号，紫外光谱在220、264、299和338nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H、¹³C-NMR和DEPT谱(表-1)显示其含有16个碳和17个氢。包括：一个1,6,7-取代的异喹啉母核(C-1～C-10；H-3,H-4,H-5,和H-8)，一个异戊烯基(-CH₂CH＝C(CH₃)₂，C-1”～C-5”，H₂-1”、H-2”、H₃-4”和H₃-5”)，一个乙酰基(-CO-CH₃；C-1′和C-2′；H₃-2′)，以及一个酚羟基基(δ_H10.80s)。异喹啉母核的存在可通过化合物中H-3和C-1、C-4、C-10；H-4和C-3、C-5、C-9、C-10；H-5和C-4、C-9、C-10；以及H-8和C-1、C-9、C-10的HMBC相关(图-3)证实。异戊烯基的存在可通过H₂-1″和H-2″的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-1″和C-2″、C-3″，H-2″和C-1″、C-3″、C-4″、C-5″，H₃-4″和C-3″、C-2″、C-5″，H₃-5″和C-3″、C-2″、C-4″的HMBC相关得到证实，乙酰基的存在可通过H₃-2′和C-1′的HMBC相关得到证实。

化合物的母核和关键取代片段确定后，可进一步通过HMBC相关确定异戊烯基、乙酰基和酚羟基的位置。通过H₂-1″和C-6、C-7、C-8，H-2″和C-7，以及H-8和C-1″的HMBC相关，可证实异戊烯基取代在C-7位。通过H₃-2′和C-1的HMBC相关，可证实乙酰基取代在C-1位。通过酚羟基氢(δ_H 10.80)和C-5、C-6、C-7的HMBC相关，可证实酚羟基取代在C-6位。至此本发明化合物的结构得到确认，该化合物命名为：1-(6-羟基-7-异戊烯基-异喹啉-1-基)乙酮。

表-1、化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(溶剂CDCl3，500和125MHz)

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λ_max(logε)220(4.12)、264(3.53)、299(3.22),338(341)；IR(溴化钾压片)：ν_max 3412、3050、2954、1665、1612、1568、1453、1386、1243、1160、1056、936、794cm^-1；¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz,(CDCl₃)，见表-1；正离子模式ESIMS m/z 278[M+Na]⁺；正离子模式HRESIMS m/z 278.1152[M+Na]⁺(计算值C₁₆H₁₇NNaO₂，278.1157)。

本发明的异喹啉生物碱类化合物在降低卷烟主流烟气重金属元素含量中的应用。

1、化合物的重金属络合物稳定常数测定：

由于本发明化合物中异喹啉的氮和羰基氧可和重金属原子配位，形成稳定的五元环螯合物。故采用Scogs和Miniquad开发的经典方法测定本发明化合物的螯合物稳定常数。结果表明：本发明化合物和砷、铅、镉、汞四种毒性高的重金属元素在中性介质中(pH为6.2～7.9)均能生成稳定的螯合物，其稳定常数(lgK_MY)分别为：18.2、22.1、26.4和19.6。

2、化合物在卷烟滤嘴中的添加方法和烟气重金属元素降低效果分析：

用三醋酸甘油酯将所述的异喹啉生物碱类化合物配成0.5mg/mL的溶液。在卷烟滤嘴成型过程中，按滤嘴丝束重量的5-8％均匀地喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒与烟支卷接制作成卷烟，供卷烟烟气重金属元素测定用。

对在滤棒中添加了本发明化合物的卷烟进行主流烟气分析，烟气重金属元素测定参照中国烟草行业标准(YC/T 389-2011和YCT 404-2011)进行，并以未添加本发明化合物的同种卷烟作为对照，通过和对照样品比较计算重金属元素的降低率。

结果表明：添加本发明化合物的6种不同规格卷烟烟气重金属释放量分别为：砷0.385～0.547μg/20支、铅2.58～3.67μg/20支、镉3.22～4.67μg/20支、汞0.148～0.213μg/20支，未添加本发明化合物的对照卷烟烟气重金属释放量分别为：砷0.527～0.785μg/20支、铅4.72～6.58μg/20支、镉5.61～8.86μg/20支、汞0.217～0.366μg/20支，四种重金属元素的降低率分别为：砷26.9％～33.2％、铅44.2％～45.5％、镉43.6％～47.8％、汞31.8％～42.3％；具有显著降低卷烟主流烟气中重金属元素含量的效果。

3、毒理学评价和感官评吸

对滤棒中添加了本发明化合物的卷烟烟气冷凝物进行了毒理学分析。细胞毒性实验、Ames试验、体外微核试验三项体外毒理学测试结果均表明：采用SPSS软件的one-wayANOVA对受试样品与对照样品卷烟烟气总粒相物产生的细胞抑制率进行统计学分析，在三项毒理学实验中，添加本发明化合物的卷烟和对照卷烟的烟气总粒相物间无统计学差异(P>0.05)。

还对添加了本发明化合物的卷烟进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：添加本发明化合物的卷烟入口略带苦凉味、后有回甜感，化合物添加后和卷烟原有的味感协调性好，没有明显的负面影响，而且对卷烟抽吸的刺激性和余味有改善作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明从烟草根茎中首次提取分离得到一种异喹啉生物碱类化合物，该化合物具有重金属螯合功能的官能基团，能和重金属元素生成稳定的螯合物；在卷烟滤嘴中添加使用能显著降低卷烟烟气重金属元素的含量，同时对卷烟烟气没有明显的负面影响，和卷烟原有的味感协调性好，入口略带苦凉味和回甜感，还对卷烟抽吸的刺激性和余味有改善作用。

(2)烟草根茎为烟叶生产过程中的废弃物，而且烟草在云南种植非常广泛，每年烟叶生产过程中均丢弃大量根茎，因此生产原料易得，且能变废为宝，成本低，容易实现产业化应用。

(3)本发明化合物安全、无毒、制备工艺简单，具备大规模推广应用的条件。

附图说明

图1为本发明异喹啉生物碱类化合物的核磁共振碳谱(¹³C NMR)；

图2为本发明异喹啉生物碱类化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图3为本发明异喹啉生物碱类化合物的关键HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。

实施例中所述的烟草不受地区和品种限制，均可以实现本发明。

实施例1

烟草根茎来自云南昆明，品种为红花大金元。取干燥的烟草根茎4.6kg，粉碎到35～60目，置于20L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇6～10L，回流提取35～60min，滤出提取液；再次往滤渣中加入95％的乙醇6～10L，回流提取35～60min，滤出提取液，合并两次提取液浓缩到小体积。然后用3％的酒石酸溶液4～6L稀释，用4～6L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用4～6L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏28.6g。在浸膏中加入45g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶38g拌样，拌样后，用200目硅胶86g装柱；用体积比分别为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品C(8：2)部分再以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，58％的甲醇为流动相，流速20mL/min，紫外检测器检测波长为338nm，每次进样0.6mL，收集34.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述异喹啉生物碱类化合物粗品。化合物粗品再次用纯甲醇溶解，并以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，收集本发明生物碱类化合物流出部分，蒸干溶剂得到的黄色胶状物，蒸干溶剂即为化合物纯品。

实施例2

烟草根茎来自云南大理，品种为云烟-85。样品粉碎到约40目，称取6.4kg粉碎后的样品，置于20L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇6L，回流提取50min，滤出提取液；再次往滤渣中加入95％的乙醇6L，回流提取50min，滤出提取液，合并两次提取液浓缩到小体积。然后用3％的酒石酸溶液6L稀释，用6L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用6L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏38.4g。在浸膏中加入80g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶45g拌样，拌样后，用180目硅胶120g装柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品C(8:2)部分再以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，58％的甲醇为流动相，流速20mL/min，紫外检测器检测波长为338nm，每次进样0.8mL，收集34.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述异喹啉生物碱类化合物粗品。化合物粗品再次用纯甲醇溶解，并以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，收集本发明生物碱类化合物流出部分，蒸干溶剂即为化合物纯品。

实施例3

实施例1制备得到的异喹啉生物碱类化合物的结构通过以下方法进行鉴定：

化合物为黄色胶状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为278.1152[M+Na]⁺，结合¹H和¹³C NMR谱确定分子式为C₁₆H₁₇NO₂，为生物碱类化合物，且化合物的不饱和度为9。其红外光谱显示化合物中有羟基(3412cm^-1)、羰基(1665cm^-1)和芳环(1612、1568和1453cm^-1)信号，紫外光谱在220、264、299和338nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H、¹³C-NMR和DEPT谱(表-1)显示其含有16个碳和17个氢。包括：一个1,6,7-取代的异喹啉母核(C-1～C-10；H-3,H-4,H-5,和H-8)，一个异戊烯基(-CH₂CH＝C(CH₃)₂，C-1”～C-5”，H₂-1”、H-2”、H₃-4”和H₃-5”)，一个乙酰基(-CO-CH₃；C-1′和C-2′；H₃-2′)，以及一个酚羟基基(δ_H10.80s)。异喹啉母核的存在可通过化合物中H-3和C-1、C-4、C-10；H-4和C-3、C-5、C-9、C-10；H-5和C-4、C-9、C-10；以及H-8和C-1、C-9、C-10的HMBC相关(图-3)证实。异戊烯基的存在可通过H₂-1″和H-2″的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-1″和C-2″、C-3″，H-2″和C-1″、C-3″、C-4″、C-5″，H₃-4″和C-3″、C-2″、C-5″，H₃-5″和C-3″、C-2″、C-4″的HMBC相关得到证实，乙酰基的存在可通过H₃-2′和C-1′的HMBC相关得到证实。

化合物的母核和关键取代片段确定后，可进一步通过HMBC相关确定异戊烯基、乙酰基和酚羟基的位置。通过H₂-1″和C-6、C-7、C-8，H-2″和C-7，以及H-8和C-1″的HMBC相关，可证实异戊烯基取代在C-7位。通过H₃-2′和C-1的HMBC相关，可证实乙酰基取代在C-1位。通过酚羟基氢(δ_H 10.80)和C-5、C-6、C-7的HMBC相关，可证实酚羟基取代在C-6位。至此本发明化合物的结构得到确认，该化合物命名为：1-(6-羟基-7-异戊烯基-异喹啉-1-基)乙酮。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λ_max(logε)220(4.12)、264(3.53)、299(3.22),338(341)；IR(溴化钾压片)：ν_max 3412、3050、2954、1665、1612、1568、1453、1386、1243、1160、1056、936、794cm^-1；¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz,(CDCl₃)，见表-1；正离子模式ESIMS m/z 278[M+Na]⁺；正离子模式HRESIMS m/z 278.1152[M+Na]⁺(计算值C₁₆H₁₇NNaO₂，278.1157)。

实施例4

取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物。测定与实施3相同，确认实施例2制备的化合物为所述异喹啉生物碱类化合物——1-(6-羟基-7-异戊烯基-异喹啉-1-基)乙酮。

实施例5

由于本发明化合物中异喹啉的氮和羰基氧可和重金属原子配位，形成稳定的五元环螯合物。故采用Scogs和Miniquad开发的经典方法测定本发明化合物的螯合物稳定常数。结果表明：本发明化合物和砷、铅、镉、汞四种毒性高的重金属元素在中性介质中(pH为6.2～7.9)均能生成稳定的螯合物，其稳定常数(lgK_MY)分别为：18.2、22.1、26.4和19.6。

实施例6

用三醋酸甘油酯将所述的异喹啉生物碱类化合物配成0.5mg/mL的溶液。在卷烟滤嘴成型过程中，按滤嘴丝束重量的5-8％均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒与烟支卷接制作成卷烟，供卷烟烟气重金属元素测定用。

对在滤棒中添加了本发明化合物的卷烟进行主流烟气分析，烟气重金属元素测定参照中国烟草行业标准(YC/T 389-2011和YCT 404-2011)进行，并以未添加本发明化合物的同种卷烟作为对照，通过和对照样品比较计算重金属元素的降低率。

结果表明：添加本发明化合物的6种不同规格卷烟烟气重金属释放量分别为：砷0.385～0.547μg/20支、铅2.58～3.67μg/20支、镉3.22～4.67μg/20支、汞0.148～0.213μg/20支，未添加本发明化合物的对照卷烟烟气重金属释放量分别为：砷0.527～0.785μg/20支、铅4.72～6.58μg/20支、镉5.61～8.86μg/20支、汞0.217～0.366μg/20支，四种重金属元素的降低率分别为：砷26.9％～33.2％、铅44.2％～45.5％、镉43.6％～47.8％、汞31.8％～42.3％；具有显著降低卷烟主流烟气中重金属元素含量的效果。

实施例7

对滤棒中添加了本发明化合物的卷烟烟气冷凝物进行了毒理学分析。细胞毒性实验、Ames试验、体外微核试验三项体外毒理学测试结果均表明：采用SPSS软件的one-wayANOVA对受试样品与对照样品卷烟烟气总粒相物产生的细胞抑制率进行统计学分析，在三项毒理学实验中，添加本发明化合物的卷烟和对照卷烟的烟气总粒相物间无统计学差异(P>0.05)。

还对添加了本发明化合物的卷烟进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：添加本发明化合物的卷烟入口略带苦凉味、后有回甜感，化合物添加后和卷烟原有的味感协调性好，没有明显的负面影响，而且对卷烟抽吸的刺激性和余味有改善作用。