阅读说明：本技术 一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法 (Preparation method of sub-totipotent mesenchymal stem cell secretin ) 是由 王彬 林思恩 李刚 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本申请提供一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法,包括间充质干细胞预培养、间充质干细胞的大规模培养、间充质干细胞分泌素原液的制备和间充质干细胞分泌素冻干粉的制备。本申请的一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法,简单易行、快捷方便、易于大规模连续生产,该方法不添加任何生物因子,即可实现间充质干细胞的快速增殖,而且仅通过细胞培养液的更换方式就能高效、连续生产间充质干细胞分泌素,大大降低了生产成本；该间充质干细胞分泌素活性成分较高,具有显著提高皮肤细胞和骨细胞增殖的能力。(The application provides a preparation method of a sub-totipotent mesenchymal stem cell secretin, which comprises the steps of mesenchymal stem cell pre-culture, large-scale culture of mesenchymal stem cells, preparation of a mesenchymal stem cell secretin stock solution and preparation of mesenchymal stem cell secretin freeze-dried powder. The preparation method of the sub-totipotent mesenchymal stem cell secretin is simple, feasible, rapid and convenient, and easy for large-scale continuous production, the method can realize rapid proliferation of the mesenchymal stem cells without adding any biological factor, and the mesenchymal stem cell secretin can be efficiently and continuously produced only by changing the cell culture solution, so that the production cost is greatly reduced; the mesenchymal stem cell secretin has high active ingredient, and has the capability of remarkably improving the proliferation of skin cells and bone cells.)

一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(MesenchymalStemCell，MSC)是具有很强的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，是目前临床应用最多的干细胞。间充质干细胞与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入.可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。

间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。

目前，间充质干细胞是各大药企研究的重点。在美国FDA已批准了近60项临床试验，主要包括以下几个方面。

1.造血干细胞移植：增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入；治疗移植物抗宿主病。

2.组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。

3.自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。

4.作为基因治疗的载体。

其中移植物抗宿主病、克隆氏病的治疗在美国已经进入到三期临床阶段。国内已开始用间充质干细胞治疗临床上一些难治性疾病，如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。

因此，间充质干细胞及其分泌素的生产制备非常重要，能否提供杂质少、活性高、能持续有效的间充质干细胞分泌素是这些临床试验能否成功的关键因素。

目前，间充质干细胞的来源有很多种，例如骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。

然而，无论由何种原料中提出，间充质干细胞在来源中的含量通常很低，通常需要体外培养。目前，体外培养间充质干细胞的方式有很多，但通常仅仅是实验室规模的培养，无法达到大规模、连续化体外培养的目的，因而无法实现工业化的应用，特别是无法实现大剂量的敷料式应用。

发明内容

本申请为解决上述技术问题而提供。

本申请所采取的技术方案是：一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)间充质干细胞预培养

将间充质干细胞接种在Eagle培养基中，培养，获得间充质干细胞悬液；

2)间充质干细胞的大规模培养

将步骤1)得到的间充质干细胞悬液接种到间充质干细胞培养基液中混合均匀，转入生物反应器内，静置2h，以60rpm/min速度搅拌，并在37℃，5％CO₂，5％～20％O₂的条件下培养7～14天，获得间充质干细胞基液；

3)间充质干细胞分泌素原液的制备

将步骤2)间充质干细胞基液过滤，获得间充质干细胞，使用磷酸盐缓冲液冲洗间充质干细胞3次，加入100mL无血清基础培养基继续培养24小时，然后收取培养基，得到间充质干细胞分泌素原液；

4)间充质干细胞分泌素冻干粉的制备

将步骤3)获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后得滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

进一步的，所述间充质干细胞来源于脐带血、脐带、胎盘、自愿终止妊娠的人胎儿骨组织中的一种或多种组合。

进一步的，所述步骤1)采用的Eagle培养基为补充有10％胎牛血清和1％抗生素的改良Eagle培养基，即DMEM培养基。

进一步的，所述步骤1)中，间充质干细胞预培养采用单层培养，预培养时，间充质干细胞的接种量为0.5万/cm²，且在37℃条件下培养2～3代。

进一步的，所述步骤1)预培养获得的间充质干细胞悬液中间充质干细胞密度为10万/100mL～1000万/100mL。

进一步的，所述步骤1)预培养获得的间充质干细胞悬液中间充质干细胞密度为100万/100mL。

进一步的，所述步骤2)间充质干细胞培养基液为无菌生物微载体与细胞培养基以3g：100mL的比例制成的微载体基液。

进一步的，所述生物微载体为聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、水凝胶、海藻酸钠、甲壳素或者聚苯乙烯中的一种。

进一步的，所述步骤3)中无血清基础培养基为无血清α-最低必需培养基即α-MEM培养基。

本申请具有的优点和积极效果是：本申请的一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法，简单易行、快捷方便、易于大规模连续生产，该方法不添加任何生物因子，即可实现间充质干细胞的快速增殖，而且仅通过细胞培养液的更换方式就能高效、连续生产间充质干细胞分泌素，大大降低了生产成本；该间充质干细胞分泌素活性成分较高,具有显著提高皮肤细胞和骨细胞增值的能力。

除了上面所描述的本申请解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的优点之外，本申请所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点，将在下文中结合附图作进一步详细的说明。

附图说明

图1为实施例1、实施例2和实施例3细胞大规模培养后在倒置荧光显微镜下的荧光照片；

图2为实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素处理AMSC，以及空白对照，在处理后第一、第三以及第五天使用alamar blue试剂盒测试细胞增殖能力的活性图；

图3为实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素处理AMSC，以及空白对照，在处理后HFB使用alamar blue试剂盒测试细胞增殖能力的活性图；

图4为人恶性黑色素瘤细胞、皮肤鳞状细胞癌细胞与间充质干细胞分泌素共注射，以及空白对照，IVIS 200体内成像系统测定的光密度图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。

实施例1

1、间充质干细胞预培养

取脂肪间充质干细胞以5000个细胞/cm²的密度接种在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素的改良Eagle培养基(DMEM)中，单层培养2代，获得细胞密度为10万/100mL～1000万/100mL的间充质干细胞悬液，在本实施例中，间充质干细胞悬液密度优选为100万/100ml。

2、间充质干细胞的大规模培养

将步骤1得到的间充质干细胞悬液接种到无菌生物微载体与细胞培养基以3g：100mL的比例制成的微载体基液中混合均匀，转入生物反应器内，静置2h，以60rpm/min速度搅拌，并在37℃，5％CO₂，20％O₂的条件下培养7天，获得间充质干细胞基液；本实施例中，微载体采用的是聚己内酯。

3、间充质干细胞分泌素原液的制备

将步骤2间充质干细胞基液过滤，获得间充质干细胞，使用磷酸盐缓冲液冲洗间充质干细胞3次，加入100mL无血清α-最低必需培养基(α-MEM)继续培养24小时，然后收取培养基，得到间充质干细胞分泌素原液。

4、间充质干细胞分泌素冻干粉的制备

将步骤3获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后取滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

实施例2

1、间充质干细胞预培养

取脂肪间充质干细胞以5000个细胞/cm²的密度接种在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素的改良Eagle培养基(DMEM)中，单层培养2代，获得细胞密度为10万/100mL～1000万/100mL的间充质干细胞悬液，在本实施例中，间充质干细胞悬液密度优选为100万/100ml。

2、间充质干细胞的大规模培养

将步骤1得到的间充质干细胞悬液接种到无菌生物微载体与细胞培养基以3g：100mL的比例制成的微载体基液中混合均匀，转入生物反应器内，静置2h，以60rpm/min速度搅拌，并在37℃，5％CO2，10％O2的条件下培养10天，获得间充质干细胞基液；本实施例中，微载体采用的是聚己内酯。

3、间充质干细胞分泌素原液的制备

将步骤2间充质干细胞基液过滤，获得间充质干细胞，使用磷酸盐缓冲液冲洗间充质干细胞3次，加入100mL无血清α-最低必需培养基(α-MEM)继续培养24小时，然后收取培养基，得到间充质干细胞分泌素原液。

4、间充质干细胞分泌素冻干粉的制备

将步骤3获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后取滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

实施例3

1、间充质干细胞预培养

取脂肪间充质干细胞以5000个细胞/cm²的密度接种在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素的改良Eagle培养基(DMEM)中，单层培养2代，获得细胞密度为10万/100mL～1000万/100mL的间充质干细胞悬液，在本实施例中，间充质干细胞悬液密度优选为100万/100ml。

2、间充质干细胞的大规模培养

将步骤1得到的间充质干细胞悬液接种到无菌生物微载体与细胞培养基以3g：100mL的比例制成的微载体基液中混合均匀，转入生物反应器内，静置2h，以60rpm/min速度搅拌，并在37℃，5％CO₂，5％O₂的条件下培养14天，获得间充质干细胞基液；本实施例中，微载体采用的是聚己内酯。

3、间充质干细胞分泌素原液的制备

将步骤2间充质干细胞基液过滤，获得间充质干细胞，使用磷酸盐缓冲液冲洗间充质干细胞3次，加入100mL无血清α-最低必需培养基(α-MEM)继续培养24小时，然后收取培养基，得到间充质干细胞分泌素原液。

4、间充质干细胞分泌素冻干粉的制备

将步骤3获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后取滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

试验例一、间充质干细胞体外培养的存活率测定

1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3中大规模培养获得间充质干细胞基液

2、试验方法：

分别取实施例1、实施例2和实施例3中大规模培养获得的间充质干细胞培养物，将间充质干细胞经钙黄绿素/二聚乙锭染色。染色方法：取50μLPBS配置20μM钙黄绿素与20μM二聚乙锭染色液与50μL间充质干细胞培养物混合，室温静置十分钟后取样在倒置荧光显微镜下进行观察，活细胞只会呈现绿色的细胞膜染色，而不会有红色的细胞核染色。

3、试验结果：间充质干细胞体外培养的存活率见图1。

由图1可知，使用血清培养条件下，经过培养的间充质干细胞存活率大于90％。

试验例二、间充质干细胞分泌素对成人间充质干细胞细胞增殖能力的影响

1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉；α-MEM完全培养基:含有10％血清，10％PSN抗生素；成人骨髓间充质干细胞(AMSC)；alarmablue细胞增殖试剂盒:Alarma Blue^TMCell Viability Reagent,Catalog number:DAL1025

2、试验方法：

分别取实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉，配制成终浓度均为10ng/mL的α-MEM培养基，并用配制好的各个α-MEM培养基处理AMSC，即试验组，同时用不添加间充质干细胞分泌素冻干粉的α-MEM培养基处理AMSC，即对照组。每三天换一次相应的α-MEM培养基，并分别在处理后第一、第三以及第五天使用alamar blue试剂盒测试细胞增殖能力。测试方法为，将1/10体积比的alamar blue配置于α-完全培养基中。将对照组和试验组一起在37℃细胞培养箱中孵育4小时后取出培养上清，使用分光光度计于570nm和600nm处测量吸光度值，根据试剂盒提供数学公式计算分泌素处理组细胞相对于对照组细胞的增殖能力变化情况。

3、试验结果：由图2可知,经间充质干细胞分泌素冻干粉处理后，AMSC相对增殖能力试验组相比对照组于本实验所测三个时间点之间均持续增高。实验结果显示实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉均显著促进AMSC的代谢增殖能力。

试验例三、间充质干细胞分泌素对人皮肤细胞增殖能力的影响

1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉；α-MEM完全培养基:含有10％血清，10％PSN抗生素；人皮肤成纤维细胞(Human fibroblast,HFB)；alarma blue细胞增殖试剂盒:Alarma Blue^TMCell Viability Reagent，Catalognumber:DAL1025

2、试验方法：

分别取实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉，配制成终浓度均为50ng/μL的α-MEM培养基，并用配制好的各个α-MEM培养基处理HFB，即试验组，同时用不添加间充质干细胞分泌素冻干粉的α-MEM培养基处理HFB，即对照组。每三天换一次相应的α-MEM培养基。并分别在处理后第三天使用alamar blue试剂盒测试细胞增殖能力。测试方法为，将1/10体积比的alamar blue配置于α-完全培养基中。将对照组和试验组一起在37℃细胞培养箱中孵育4小时后取出培养上清，使用分光光度计于570nm和600nm处测量吸光度值，根据试剂盒提供数学公式计算分泌素处理组细胞相对于对照组细胞的增殖能力变化情况。

3、试验结果：由图3可知,经间充质干细胞分泌素冻干粉处理后，HFB的相对增殖能力试验组与对照组相比，试验组均高于对照组。实验结果显示分泌素冻干粉显著促进HFB的代谢增殖能力。

试验例四、分泌素成瘤性试验

1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉，人恶性黑色素瘤细胞，皮肤鳞状细胞癌细胞,Matrigel TM(BD)、2只裸鼠(雄性，20-25g)，D-荧光素。

2、试验方法:

分别取实施例1、实施例2和实施例3获得的间充质干细胞分泌素冻干粉溶解在PBS溶液中，制成间充质干细胞分泌素浓度均为50μg/mL的PBS溶液，即实施例1溶液、实施例2溶液和实施例3溶液，取实施例1溶液、实施例2溶液和实施例3溶液各50μl，并均悬浮1x10⁶个人恶性黑色素瘤细胞，然后与等体积的Matrigel TM(BD)混合，制成试验液1、试验液2和试验液3；取实施例1溶液、实施例2溶液和实施例3溶液各50μl，并均悬浮1x10⁶个皮肤鳞状细胞癌细胞，然后与等体积的Matrigel TM(BD)混合，制成试验液4、试验液5和试验液6；取1x10⁶个人恶性黑色素瘤细胞悬浮在50μl不含有间充质干细胞分泌素的PBS溶液中，并与等体积的Matrigel TM(BD)混合，制成对照液1；取1x10⁶个皮肤鳞状细胞癌细胞悬浮在50μl不含有间充质干细胞分泌素的PBS溶液中，并与等体积的Matrigel TM(BD)混合，制成对照液2，然后在1只裸鼠背部注射试验液1、试验液2、试验液3和对照液1，在另外一只裸鼠背部注射试验液4、试验液5、试验液6和对照液2，4周后测定细胞荧光强度。测定方法：在腹膜内注射D-荧光素(30mg/mL；5μL/g)，然后用IVIS 200体内成像系统测定肿瘤生长情况。

3、试验结果：由图4可知,人恶性黑色素瘤细胞、皮肤鳞状细胞癌细胞与间充质干细胞分泌素共注射，IVIS 200体内成像系统测定的光密度均低于对照组，间充质干细胞分泌素不促进肿瘤细胞的生长。

以上对本申请的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本申请的较佳实施例，不能被认为用于限定本申请的实施范围。凡依本申请的申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本申请的专利涵盖范围之内。