阅读说明：本技术 靶向muc1的嵌合抗原受体及其用途 (MUC 1-targeted chimeric antigen receptors and uses thereof ) 是由 王海鹰 金涛 于 2018-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及靶向MUC1的嵌合抗原受体及其用途。具体而言,本发明提供一种多核苷酸序列,选自：(1)含有依次连接的抗MUC1单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体,以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。(The present invention relates to chimeric antigen receptors targeting MUC1 and uses thereof. In particular, the invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) a polynucleotide sequence comprising the coding sequence of anti-MUC 1 single-chain antibody, the coding sequence of human CD8 alpha hinge region, the coding sequence of human CD8 transmembrane region, the coding sequence of human 41BB intracellular region, the coding sequence of human CD3 zeta intracellular region, which are connected in sequence; and (2) the complement of the polynucleotide sequence of (1). The invention also provides a related fusion protein, a vector containing the coding sequence, and applications of the fusion protein, the coding sequence and the vector.)

靶向MUC1的嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向MUC1的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种***的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。

第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chain fragment variable,scFV)、跨膜区(transmembrane region,TM)和胞内信号区——免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性(persistence)很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应。[Cancer Res.2007,67(22):11029-11036.]

第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(J Immunol.1998；161(6):2791-7.)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。

第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(Mol Ther.2005,12(5):933-941.)。最典型的就是UPen Carl June在CD28刺激因子的作用下又加了一个CD137(4-1BB)的刺激因子。

***的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12,其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用。[Expert Opin Biol Ther.2015；15(8):1145-54.]。

粘蛋白(mucin，MUC)是一类高分子量的糖蛋白，主要有上皮细胞分泌，对正常的上皮起润滑和保护作用，也起到一种生物性的机械屏障作用。分为膜结合型和分泌型粘蛋白两大类，MUC1是一种膜结合型粘蛋白，也是粘蛋白家族中最早被发现的蛋白。MUC1是一种高分子量、高糖基化跨膜粘蛋白，其白结构复杂，以O-糖苷键相连的核心肽和糖链组成，其中糖链占80％。人MUC1基因定位于染色体的1q21，cDNA长1821bp，含有7个外显子，其中2个外显子含有数量不等的串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)，不同人的VNTR数量从20～125不等，每一个VNTR结构中都含有60个碱基，富含GC，其表达产物为20个氨基酸，含有大量的O-糖基化位点。正常情况下，MUC1粘蛋白主要在乳腺、胰腺、消化道、呼吸道等多种组织器官上皮细胞中表达，呈顶端表达，极性分布，不易被免疫系统识别。早期研究证明，MUC1粘蛋白主要生物学功能表现在润滑、保护细胞、黏性维持、识别细胞、维持上皮完整性，介导细胞间信号转导，参与机体免疫调剂等。随着对MUC1粘蛋白的不断研究，发现：MUC1是一种多功能分子，在不同的情况下会出现截然相反的特点，如免疫活化与免疫抑制、黏附与抗黏附作用等。

MUC1粘蛋白在肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤中都表现为异常的高表达，且与肿瘤的恶性程度呈正相关。在肿瘤组织中，MUC1表达极性分布消失，均匀的分布表达于细胞表面，而且由于肿瘤细胞中糖及转移酶活性的增高，导致MUC1糖基化的不完全，糖链的变短，分支减小，结构简单，使得正常隐蔽的表位暴露，分布于癌细胞表面，可被免疫系统识别，成为肿瘤特异的抗原，使其具有免疫原性，成为肿瘤生物学治疗的靶点。

肿瘤的发生、侵袭和转移是一个复杂多步骤的过程，研究表明MUC1的高表达抑制Erbb1的降解，使细胞中EGFR的总量增加可能是发生癌变的机制之一。Singh PK等研究表明PDGFRβ与MUC1的相互作用促进了肿瘤的生长、浸润以及转移。此外MUC1激活wnt信号传导途径，导致β-catenin在胞浆中积聚，并在达到一定浓度后进人细胞核与转录因子淋巴细胞增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)相互作用，激活下游细胞周期蛋白Dl(cyclin D1)、c-Myc等基因的转录，使处于GO期的分化细胞重新获得增殖能力，导致肿瘤形成。因此β-catenin被认为是一种原癌基因。多项研究表明，在肿瘤细胞中，MUC1高表达可促进肿瘤细胞与基底膜蛋白的黏附作用，促进肿瘤细胞对基底膜的黏附而使之侵袭转移；MUC1可通过降低整合素与钙黏素细胞黏附分子的黏合作用，发挥抗黏附，降低肿瘤细胞间的黏附力，使癌细胞易于脱落为有活性的游离癌细胞，促使肿瘤转移，其机制可能是：(1)肿瘤中MUC1的VNTR序列的糖基化不完全，致使其空间构象变化，出现了新的糖链，从而抑制了肿瘤细胞之间的黏附，使肿瘤细胞的侵袭性增强；(2)癌细胞膜表面MUC1分子呈丝状高密度表达，可阻碍膜表面固定的配体与其受体的相互作用，降低胞外基质内整合素介导的细胞间相互作用。研究表明MUC1的表达使E-钙黏蛋白下调，从而使肿瘤细胞相互间的黏附力下降，增强肿瘤的侵袭性。(3)MUC1上Sialy LeX表位可作为钙黏蛋白的配体，与损伤或有炎症的血管内皮细胞上的E-钙黏蛋白相互作用，使癌细胞与血管内皮细胞黏附，易于穿过血管壁，从而利于癌细胞转移。文献报道：MUC1-/-的裸鼠中，乳腺肿瘤的进展延迟；而将MUC1转染入裸鼠黑素瘤细胞中导致这些细胞转移的加快。可见MUC1与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移有着密切的关系。终上所述，MUC1在肿瘤组织中的高表达，并且与肿瘤有密切的关系，成为肿瘤药物治疗研究的靶点。

本发明专利引入鼠源针对MUC1靶点的CAR-T细胞在体内发挥作用。为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。

发明内容

本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的抗MUC1单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗MUC1单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:2第1-21位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-138位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第154-265位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第266-312位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第313-334位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第335-382位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQID NO:2第383-493位氨基酸所示。

在一个或多个实施方案中，在所述抗MUC1单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-63位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第64-414位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第462-795位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQ IDNO:1第796-936位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第937-1002位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1003-1146位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1147-1479位核苷酸序列所示。

本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的抗MUC1单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白和任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；

优选地，所述抗MUC1单链抗体为抗MUC1单克隆抗体SM3。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白在所述抗MUC1单链抗体的N端还含有信号肽。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2第22-138位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第154-265位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第266-312位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第313-334位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第335-382位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第383-493位氨基酸所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白的片段。

本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。

本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗MUC1介导的疾病的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述MUC1介导的疾病为乳腺癌。

附图说明

图1为mucI-CAR逆转录病毒表达载体(MUC1-BBz)示意图。

图2为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的MUC1-BBz CART表达效率。

具体实施方式

本发明提供一种靶向MUC1的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有依次连接的抗MUC1单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区的片段。

适用于本发明的抗MUC1单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗MUC1单克隆抗体。

任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是克隆号为SM3的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第22-138位氨基酸残基所示。在其它实施方案中，所述抗MUC1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第154-265位氨基酸残基所示。

适用于本发明的人CD8α铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第266-312位氨基酸所示。

适用于本发明的人CD8跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第313-334位氨基酸所示。

适用于本发明的41BB可以是本领域已知的各种用于CAR的41BB。作为示范性例子，本发明使用SEQ ID NO:2第335-382位氨基酸序列所示的41BB。

适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3ζ胞内区。在某些实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第383-493位氨基酸所示。

形成本发明的融合蛋白的上述各部分，如抗MUC1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB和人CD3ζ胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有***氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，本发明抗MUC1单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由(GGGGS)_n连接，其中n为1～5的整数。

在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-493位氨基酸所示或如SEQ ID NO:2第1-493位氨基酸所示。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明也包括SEQ ID NO:2第22-493位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-493位氨基酸序列所示的CAR或SEQ ID NO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在SEQ ID NO:2第22-493位所示的氨基酸序列SEQ ID NO:2第1-493位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(***、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第64－1479位核苷酸所示，或如SEQ ID NO:1第1-1479位核苷酸所示。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列还包含编码EGFR的片段的核苷酸序列。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式***作以保证所述融合蛋白(CAR)的表达。在将核酸构建物***载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因***哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。

适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。

在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的逆转录病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白。

本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。

本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及CAR-T细胞治疗的疾病优选为MUC1介导的疾病。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、***或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗MUC1介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

本发明采用抗MUC1抗体(具体是衍生自克隆号SM3的scFV)的基因序列，并从NCBIGenBank数据库中搜索到人的CD8α铰链区、人的CD8跨膜区、人的41BB胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体抗MUC1scFv-CD8铰链区-CD8TM-41BB-CD3ζ的基因片段，***到逆转录病毒载体中。重组质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转化方法是基于逆转录病毒转化方法。该方法具有转化效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：MUC1scFv-CD8-41BB-CD3ζ基因序列的确定

从NCBI网站数据库搜索到人CD8α铰链区和跨膜区、人41BB胞内区、人的CD3ζ胞内区基因序列信息，抗MUC1单链抗体克隆号为SM3,这些序列在网站http://sg.idtdna.com/ site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

采用重叠PCR将上述序列依次按抗将上述序列依次按抗MUC1scFv、人CD8α铰链区和跨膜区、人41BB胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的MUC1-CAR基因序列信息。

用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连接***逆转录病毒MSCV(Addgene)的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。

将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的MUC1-CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：

正义:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC

反义:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。

实施例2：包含CAR分子的核酸序列的病毒载体的构建

将实施例1中制备的CAR分子的核苷酸序列经NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切、经T4连接酶(NEB)连接***逆转录病毒RV载体的NotI-EcoRI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。

实施例3：逆转录病毒包装

1.第1天293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜；

2.第2天293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为RV-MUC1-BBz为12.5ug，Gag-pol为10ug，VSVg为6.25ug，CaCl₂250ul，H₂O为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37度培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；

3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。

实施例4：逆转录病毒感染人的T细胞

1.用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的CD3+T细胞，用含5％AB血清X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL。将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人50ng/mlCD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml 41BB抗体(北京同立海元)，再加入100IU/ml的白细胞介素2(北京双鹭)，刺激培养48小时后病毒感染。

2.T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包被non-tissue treated培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。

3.T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA的HBSS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的HBSS洗板两次。

4.病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。

5.弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1×10⁶个，体积1ml，培养基为T细胞培养基中添加IL-2 200IU/ml。30℃，1000g，离心10min。

6.离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

7.感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。

8.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/ml左右，使细胞扩增。

由此获得分别感染了实施例3所示逆转录病毒的CART细胞。

实施例5：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞表面CAR蛋白的表达

分别离心收集感染后72小时的CAR-T细胞和NT细胞(对照组)，PBS洗涤1次后弃上清，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测CAR(anti-mouse IgGF(ab')antibody(Jackson Immunoresearch))。

图2显示，使用实施例2制备得到的逆转录病毒感染T细胞72小时后，MUC1CAR+的表达效率达76.4％。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技有限公司

<120> 靶向MUC1的嵌合抗原受体及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 2

atggttctgc tggtcacttc actgctgctg tgcgaactgc cccatcccgc ctttctgctg 60

attccccagg tccagctgca ggagagcgga gggggcctgg tgcagccagg cggctctatg 120

aagctgagct gcgtggcctc cggcttcacc ttcagcaact actggatgaa ttgggtgcgg 180

cagtccccag agaagggcct ggagtgggtg gcagagatca gactgaagtc taacaattac 240

gccacacact atgccgagtc cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga cgatagcaag 300

agctccgtgt acctgcagat gaacaatctg agggccgagg acacaggcat ctactattgc 360

accggcgtgg gctttgccta ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagcggagga 420

ggaggctccg gaggaggagg ctctggcggc ggcggcagcg acatcgtggt gacacaggag 480

tccgccctga ccacatctcc tggcgagacc gtgacactga cctgtagatc ctctaccggc 540

gccgtgacca caagcaacta cgccaattgg gtgcaggaga agcccgacca cctgttcaca 600

ggcctgatcg gaggaaccaa caatagggca ccaggagtgc ctgcacgctt tagcggctcc 660

ctgatcggcg acaaggccgc cctgacaatc accggagcac agaccgagga tgaggccatc 720

tatttctgtg ccctgtggta ttcaaatcat tgggtgttcg ggggagggac taaactgact 780

gtgctgggga gcgagactac aactccagca cccagacccc ctacacctgc tccaactatc 840

gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg 900

catactcggg gactggactt tgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 1020

agaggccgga agaagctgct gtacatcttc aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact 1080

acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 1140

ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 1200

ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 1260

ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 1320

aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa 1380

agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 1440

acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg ccaccaaga 1479

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 2

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Gly Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Pro Leu Leu Ile Pro Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gly Pro Gly Gly Ser Met Leu Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly

35 40 45

Pro Thr Pro Ser Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Ala Gly Ser Pro Gly

50 55 60

Leu Gly Leu Gly Thr Val Ala Gly Ile Ala Leu Leu Ser Ala Ala Thr

65 70 75 80

Ala Thr His Thr Ala Gly Ser Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala

85 90 95

Ala Ala Ser Leu Ser Ser Val Thr Leu Gly Met Ala Ala Leu Ala Ala

100 105 110

Gly Ala Thr Gly Ile Thr Thr Cys Thr Gly Val Gly Pro Ala Thr Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Val Val Thr Gly Gly

145 150 155 160

Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala

165 170 175

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Gly

180 185 190

Gly Leu Pro Ala His Leu Pro Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Ala Ala

195 200 205

Ala Ala Pro Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Leu Ile Gly Ala

210 215 220

Leu Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ile

225 230 235 240

Thr Pro Cys Ala Leu Thr Thr Ser Ala His Thr Val Pro Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Leu Leu Thr Val Leu Gly Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala

275 280 285

Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly

290 295 300

Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Ala Pro

325 330 335

Ser Val Val Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly

340 345 350

Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser

355 360 365

Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu

370 375 380

Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly

385 390 395 400

Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu

405 410 415

Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala

420 425 430

Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met

435 440 445

Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala

465 470 475 480

Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

485 490

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 3

agcatcgttc tgtgttgtct c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 4

tgtttgtctt gtggcaatac ac 22