阅读说明：本技术 以耗氧速率为关键控制参数的连续流加补料生产庆大霉素的发酵方法 (Fermentation method for producing gentamicin by using continuous flow feeding material with oxygen consumption rate as key control parameter ) 是由 李敏超 张嗣良 庄英萍 储炬 杭海峰 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种以耗氧速率为关键控制参数的连续流加补料生产庆大霉素的发酵方法,包括一级种子制备、二级种子制备、发酵生产工艺,在发酵生产工艺,通过发酵过程中补糖速率或补氮速率的精确控制来实现调控氧消耗速率的目的,在发酵过程前期OUR从高峰下降至目标OUR时,开始补料,补料过程中维持OUR在15-30范围内,使得菌体代谢活力保持持续合成庆大霉素的能力。与现有技术相比,本发明通过连续补料实现过程OUR从初始培养利用后达到高峰下降不同的OUR后开始连续补料,维持菌体代谢活性,在中后期进入次级代谢产抗阶段后,营养不断补充,产物合成稳定,效价持续增加,持续产抗维持非常好。采用自动化控制后,采用连续补料维持OUR便于在工业生产规模控制。(The invention relates to a fermentation method for producing gentamicin by continuous fed-batch with oxygen consumption rate as a key control parameter, which comprises a primary seed preparation process, a secondary seed preparation process and a fermentation production process, wherein in the fermentation production process, the purpose of regulating and controlling the oxygen consumption rate is realized by accurately controlling the sugar supplement rate or the nitrogen supplement rate in the fermentation process, when the OUR in the early stage of the fermentation process is reduced from a peak to a target OUR, the feeding is started, and the OUR is maintained within the range of 15-30 in the feeding process, so that the metabolic activity of thalli can keep the capability of continuously synthesizing the gentamicin. Compared with the prior art, the method realizes continuous feeding after the OUR in the process is reduced to different OUR from the peak after initial culture and utilization by the continuous feeding, maintains the metabolic activity of thalli, continuously supplements nutrition after entering a secondary metabolic resistance generation stage in the middle and later stages, has stable product synthesis, continuously increases the titer, and has very good continuous resistance generation maintenance. After adopting automatic control, continuous feeding is adopted to maintain OUR, which is convenient for industrial production scale control.)

以耗氧速率为关键控制参数的连续流加补料生产庆大霉素的 发酵方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，尤其是涉及一种以耗氧速率为关键控制参数的连 续流加补料生产庆大霉素的发酵方法。

背景技术

庆大霉素是国内具备独立知识产权的被广泛应用于农业、医药和饲料行业的 氨基糖苷类的广谱抗生素；目前占据全球氨基糖苷类抗生素几乎一半市场，国内庆 大霉素原料药市场年产值接近10个亿的产值规模。因此对其工艺技术研究对提升 我国庆大霉素发酵水平和产品质量具有重要的社会现实意义。

在不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，尤其在抗生素发酵过程中特别明 显；发酵过程中氧的供给不仅直接影响微生物的生长而且对发酵过程中酶系的活 性、代谢途径及产物产量及其组成也有着重要影响。因此研究供氧大小对发酵的影 响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均 控制较高的供氧来避免氧的限制情况发生，以溶解氧浓度(Dissolved Oxygen，简 称DO)来表征供氧水平，通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制DO。溶 氧水平受供氧速率(OTR)和耗氧速率(OUR)两方面影响。其中OTR反映的是设 备供氧能力，主要影响因素主要有发酵液的流变特性和操作参数，例如流量、搅拌 转速、搅拌层数、搅拌浆型等均有关。而与DO和OTR明显不同的是OUR作为 一个典型的生理参数，反映的是单位时间内单位体积(质量)发酵液消耗的氧的(毫) 摩尔数，一般OUR高低可以表征发酵过程中菌体或细胞的能量代谢状态，可作为 发酵过程的控制的关键参数。目前一些专利报道了发酵产品均采用OUR作为发酵 过程控制的关键参数来进行发酵过程控制并实现了高产(专利号：CN 103642870 A、CN 105154490 A、CN108060144 A、CN 101560535 A、CN 102703540 A)，但 是未见报道通过连续补料控制发酵过程的OUR实现庆大霉素发酵过程优化控制并 提高庆大霉素发酵产量及改善其组分的报道。目前国内庆大霉素实际发酵单位基本 上维持在1300-1600u/ml的发酵水平；其生产方法基本上采用发酵过程采用固定周 期间歇补入全料，补料后出现黏度高的情况一般采用补水的方式控制黏度，发酵过 程控制相对简单。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种以耗氧速率(或称之为摄氧率，简写为OUR)为关键控制参数的连续流加补料生产庆大霉素 的发酵方法。该方法可稳定提高发酵生产水平并可以使得庆大霉素各组分得到改 善。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种以耗氧速率为关键控制参数的连续流加补料生产庆大霉素的发酵方法，是由棘孢小单胞菌作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生产庆大霉素的方法，具 体工艺包括一级种子制备、二级种子制备、发酵生产工艺，

在发酵生产工艺，通过发酵过程中补糖速率或补氮速率的精确控制来实现调控氧消耗速率的目的，在发酵过程前期OUR从高峰下降至目标OUR时，开始补料， 补料过程中维持OUR在15-30范围内，使得菌体代谢活力保持持续合成庆大霉素 的能力。

发酵生产工艺中，为了防止发酵过程中氧浓度低于临界氧浓度以下，采用搅拌 联动，控制溶氧不低于40％。

发酵生产工艺中，发酵液体积控制策略是当发酵液达到35kg，放掉5kg，然后 继续补料后体积达到35kg后继续放料。

发酵过程中氧消耗速率从发酵前期高峰下降至目标OUR是指准备补料控制的 OUR水平。

在本发明的一个实施方式中，发酵生产工艺中，可根据代谢活性分阶段控制控 制OUR，一般是从高缓慢下降。

在本发明的一个实施方式中，OUR控制的一个优选案例是：OUR在14h～48h 维持在30-28，48～72h维持在28-25，72～96h维持OUR在20-25。

在本发明的一个实施方式中，发酵生产工艺中，使用THERMAL FISHER公司 的过程质谱仪BP400，基于“发酵之星”软件包实现尾气检测并计算发酵过程OUR 生理参数。

其中，“发酵之星”软件包由发酵之星、发酵网信和辅助软件构成，主要功 能有对发酵过程数据进行在线采集、在线计算、离线数据输入、事件记录录入、图 像录入，是一款成熟的已知操作软件，可获得方式：国家生化工程技术研究中心(上 海)，该软件相关信息可参考http://www.doc88.com/p-9943458130154.html、 http://www.nc-bio.com/products/reconstruction-projects/352.html。

在本发明的一个实施方式中，发酵生产工艺中，控制OUR补料的补料氮培养 基(g/L)为：蚕蛹粉22、玉米浆30、高温豆粉120(100目)、柠檬酸20、硫 酸铵0.76、硝酸钾3.8氯化钴0.004、泡敌0.04和有机硅油0.04；灭菌前使用氢 氧化钠调节pH至9.0。

在本发明的一个实施方式中，发酵生产工艺中，控制OUR补料的补料糖组成 为葡萄糖(浓度为500g/L)。

在本发明的一个实施方式中，所述的一级种子培养基组成(g/L)：葡萄糖1.4、 玉米淀粉15、玉米粉20、安琪蛋白胨2.6、低温豆粉为20、硫酸铵2.5、硝酸 钾0.054、碳酸钙6.2、泡敌0.03、硅油0.05pH 7.2；

二级种子培养基(g/L)：玉米淀粉23、玉米粉30、安琪蛋白胨13、豆饼粉为 13、硫酸铵5、硫酸镁7.1、硝酸钾0.5、碳酸钙7、氧化钴0.002、泡敌0.05 和有机硅油0.03，pH 7.8；

发酵基础培养基(g/L)：玉米淀粉50、玉米粉20、中温豆粉25、安琪蛋 白胨23、硫酸铵5、硫酸镁7.1、硝酸钾0.5、碳酸钙7、氧化钴0.002、泡敌 0.05和有机硅油0.03，pH 9.0。

在本发明的一个实施方式中，一级种子培养条件为：在15L种子罐中按照一 级种子培养基成分进行配比，先将一级种子培养基消毒灭菌，使用无菌空气保持压 力在0.05MPa上下，然后将培养好的摇瓶种子液接入一级种子罐培养，培养过程： 装液量10L/25；接种量60ml；培养温度35.5±0.5℃；通气比为1：1；搅拌转 速：0-30h 200rpm、30-48h为400rpm，罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h；

二级种子培养条件为：在30L种子罐中按照二级种子培养基成分进行配比， 先将二级种子培养基消毒灭菌、冷却，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下， 然后将一级种子培养得到5L移入二级种子罐进行培养，装液量5L/20L。培养温 度35.5±0.5℃；通气比为1：1；搅拌转速：0-10h 300rpm、10-20h为400rpm、 20-30h为450rpm，罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h。

50L发酵罐培养条件为：在50L种子罐中按照发酵基础培养基配比投料(计 料20kg)。培养基灭菌、冷却后将二级种子液10kg移入发酵罐中进行培养。培养 温度全程35.5±0.5℃，通气比为1：1；搅拌转速调节根据溶氧不低于30％，罐压： 0.03～0.05MPa；培养周期：96h。

本发明通过控制补料速率实现调节菌体代谢活力，达到控制OUR的目的。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、和常规多次顿补料方式相比较，本发明在于通过连续补料实现过程OUR 从初始培养利用后达到高峰下降不同的OUR后开始连续补料，维持菌体代谢活性， 在中后期进入次级代谢产抗阶段后，营养不断补充，产物合成稳定，效价持续增加， 持续产抗维持非常好。采用自动化控制后，采用连续补料维持OUR便于在工业生 产规模控制。

2、本发明在连续补料控制不同OUR可实现组分比例进行调整，有利于产品 质量控制。尤其根据实际工业化生产需求，可实现控制不同阶段的OUR实现不同 组分比例，在较低OUR条件下，C1a含量明显提高，可以从庆大霉素产品中提取 部分C1a，如维持适当OUR如在22-23左右可实现C1达到25％以上。本发明具 备良好的可操作性，产品质量可满足药典对庆大霉素组分之要求或根据工业化生产 实际对组分需求进行改进组分比例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例所用的菌种为棘孢小单胞菌，是一种成熟的商业用菌。

整个发酵工艺路线为：摇瓶种子→一级种子培养→二级种子培养→发酵培养。

培养基组成：

一级种子培养基(g/L)：葡萄糖1.4、玉米淀粉15、玉米粉20、安琪蛋白胨 2.6、低温豆粉为20、硫酸铵2.5、硝酸钾0.054、碳酸钙6.2、泡敌0.03、硅 油0.05pH 7.2。

二级种子培养基(g/L)：玉米淀粉23、玉米粉30、安琪蛋白胨13、豆饼粉为 13、硫酸铵5、硫酸镁7.1、硝酸钾0.5、碳酸钙7、氧化钴0.002、泡敌0.05 和有机硅油0.03，pH 7.8

发酵基础培养基(g/L)：玉米淀粉50、玉米粉20、中温豆粉25、安琪蛋 白胨23、硫酸铵5、硫酸镁7.1、硝酸钾0.5、碳酸钙7、氧化钴0.002、泡敌 0.05和有机硅油0.03，pH 9.0

补料氮培养基(g/L)组成：蚕蛹粉22、玉米浆30、高温豆粉120(100目)、 柠檬酸20、硫酸铵0.76、硝酸钾3.8氯化钴0.004、泡敌0.04和有机硅油0.04； 灭菌前使用氢氧化钠调节pH至9.0。

补料糖组成：葡萄糖浓度为500g/L。

发酵过程培养条件：

一级种子培养：在15L种子罐中按照一级种子培养基成分进行配比。先将一 级种子培养基消毒灭菌，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后将培养好 的摇瓶种子液接入一级种子罐培养，培养过程:装液量10L/25；接种量60ml； 培养温度35.5±0.5℃；通气比为1：1；搅拌转速：0-30h 200rpm、30-48h为400rpm， 罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h。

二级种子培养：在30L种子罐中按照二级种子培养基成分进行配比。先将二 级种子培养基消毒灭菌、冷却，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后将 一级种子培养得到5L移入二级种子罐进行培养，装液量5L/20L。培养温度35.5 ±0.5℃；通气比为1：1；搅拌转速：0-10h 300rpm、10-20h为400rpm、20-30h 为450rpm,罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h。

50L发酵罐培养：在50L种子罐中按照发酵基础培养基配比投料(计料20kg)。 培养基灭菌、冷却后将二级种子液10kg移入发酵罐中进行培养。培养温度全程 35.5±0.5℃，通气比为1：1；搅拌转速调节根据溶氧不低于30％，罐压：0.03～ 0.05MPa；培养周期：96h。

补料控制策略：根据OUR发酵前期OUR下降至32mmol/kg/h时开始补糖和 补氮，维持OUR在发酵过程中在28-30范围内。根据发酵罐称重控制体积在 30-35kg，当达到35kg左右放料5kg。

以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果发酵效 价为2884ug/ml。

实施例2

一级种子培养和二级种子培养与实施例1相同，所用一级种子培养基、二级 种子培养基和发酵培养过程所用发酵基础培养基与实施例1也相同，但连续补料 控制的OUR不同。补料控制策略：根据OUR发酵前期OUR下降至22mmol/kg/h 左右时开始补糖和补氮，维持OUR在发酵过程中在18-20范围内。根据发酵罐称 重控制体积在30-35kg，当达到35kg左右放料5kg。

实施例3

一级种子培养和二级种子培养与实施例1相同，所用一级种子培养基、二级 种子培养基和发酵培养过程所用发酵基础培养基与实施例1也相同，但连续补料 控制的OUR不同。补料控制策略：根据OUR发酵前期OUR下降至28mmol/kg/h 左右时开始补糖和补氮，维持OUR在发酵过程中在22-25范围内。根据发酵罐称 重控制体积在30-35kg，当达到35kg左右放料5kg。

实施例4

一级种子培养和二级种子培养与实施例1相同，所用一级种子培养基、二级 种子培养基和发酵培养过程所用发酵基础培养基与实施例1也相同，但连续补料 控制的OUR不同。补料控制策略：根据OUR发酵前期OUR下降至32mmol/kg/h 左右时开始补糖和补氮，OUR在14h～48hOUR维持在30-28，48～72h维持在 28-25，72～放罐维持OUR在20-25。根据发酵罐称重控制体积在30-35kg，当达 到35kg左右放料5kg。

综合分析比较4个实施例结果见下表，并对照中国药典及英国药典对庆大霉素 各组分的比例规定要求(中国药典C1:25％～50％，C1a 15％～40％，C2+C2a 20％～50％；英国药典:C1:25～50％，C1a 10％～35％，C2+C2a 25％～55％)， 可知本发明在实施例1中发酵过程维持高OUR最终产物浓度达到了2884ug/ml， 达到了65％的带放量，单罐产能最大，唯一的缺陷组分比例中C1未能达标。实施 例2中，维持过程较低OUR明显看到C1a组分提高幅度较大，可以通过此工艺控 制实现提取部分C1a满足市场需求。实施例3中维持居中的OUR水平可实现发酵 过程发酵较高发酵单位，同时组分比例较为合适。实施例4中采用分阶段的OUR 控制策略，可以兼顾发酵单位和组分比例调整具备实现高产和改善组分的效果，为 最优控制方案。

表1四个实施例的结果

本说明书中各个实施案例采用的是递进的方式描述，每个实施案例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施案例之间相同相似部分互相参见即可。

本发明不局限于给出四个实施例，如采用本发明专利类似工艺策略进行组分改善或发酵效价提高均属于本发明专利保护范围内。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。