分子印迹荧光光纤传感器及其构建方法、荧光检测方法
阅读说明：本技术 分子印迹荧光光纤传感器及其构建方法、荧光检测方法 (molecular imprinting fluorescence optical fiber sensor, construction method thereof and fluorescence detection method ) 是由 黄庆达 赖家平 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种分子印迹荧光光纤传感器及其构建方法、荧光检测方法,所述传感器包括激光光源、Y型光纤、石英光纤、法兰适配器和光纤光谱仪,激光光源、Y型光纤和光纤光谱仪依次相连,石英光纤修饰含有分子印迹微球的凝胶膜,所述Y型光纤与石英光纤之间通过法兰适配器相连接；激光光源发射出的激光通过Y型光纤传递到石英光纤上的凝胶膜,凝胶膜的荧光信号反射回Y型光纤,由Y型光纤传递到光纤光谱仪。本发明的传感器为可拆卸式的传感器,使得光纤探头可以替换,以便在现场分别进行多目标的快速检测,能够运用于环境水体中抗生素的现场快速监测,并且在使用结束后可以轻松破坏光纤探头修饰的传感膜,光纤探头得以回收,减少不必要的资源浪费。(The invention discloses a molecularly imprinted fluorescent optical fiber sensor, a construction method thereof and a fluorescence detection method, wherein the sensor comprises a laser light source, a Y-shaped optical fiber, a quartz optical fiber, a flange adapter and an optical fiber spectrometer, the laser light source, the Y-shaped optical fiber and the optical fiber spectrometer are sequentially connected, the quartz optical fiber modifies a gel film containing molecularly imprinted microspheres, and the Y-shaped optical fiber and the quartz optical fiber are connected through the flange adapter; laser emitted by the laser source is transmitted to the gel film on the quartz optical fiber through the Y-shaped optical fiber, and a fluorescence signal of the gel film is reflected back to the Y-shaped optical fiber and is transmitted to the optical fiber spectrometer through the Y-shaped optical fiber. The sensor is detachable, so that the optical fiber probe can be replaced, multi-target rapid detection can be respectively carried out on site, the sensor can be applied to on-site rapid monitoring of antibiotics in environmental water, and the sensing film modified by the optical fiber probe can be easily damaged after the use is finished, so that the optical fiber probe can be recycled, and unnecessary resource waste is reduced.)
技术领域
本发明涉及一种分子印迹荧光光纤传感器及其构建方法、荧光检测方法，属于水体环境中抗生素的检测领域。
背景技术
近年来，随着光线技术的迅猛发展，各种光线传感器(fiber-optic sensors，FOS)也应运而生。这是因为FOS具有如下几大优点：首先，FOS具有微型化的特点。其传感部分柔韧，轻便，空间适应性和生物兼容性都很好，适合临床医学、生物体及各种环境水体的实时、在线监测；其次FOS具有监测对象广，灵活性大的优点。尤其是传感膜技术如分子印迹膜、高分子膜以及Sol-gel膜等相关膜技术的发展，为光纤传感膜的制备提供了更多可行的方法。第三，FOS具有抗电磁干扰、传输信息量大、光能传输损耗小和环境适应能力强等多个特点；第四，FOS能够实现自身参比，相较于电化学传感器需要额外的参比电极。利用自身参比可以使FOS获得比较稳定的光学信息，避免了传感探头的不稳定性。
分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique，MIT)是指制备对某一特定的目标分子(模板分子)具有特异选择性的聚合物的过程，所制备的聚合物称为分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，MIP)。分子印迹聚合物是为目标分子“量身定做”的“人工抗体”，以其选择性高、抗恶劣环境等特点著称，已广泛用于固相萃取、仿生传感器及酶模拟催化等诸多领域，并在环境检测中也有非常广泛的应用。
分子印迹光纤传感器(OFS-MIPs)将MIPs作为敏感材料应用到光纤传感器中。一般将MIPs作为光纤传感器的传感层，光纤传感器将光源发出的光经光纤送入MIPs传感层，MIPs传感层与外界被测物质相互作用，使光信号的光学特征发生变化，将生物化学信号转变为光信号，再经光纤进入信号解调器对被测物质进行定性/定量分析。目前分子印迹与光纤传感器的耦合具体有：原位聚合、胶黏剂表面涂覆、表面修饰、毛细管耦合等方法。OFS-MIPs具有MIPs特异性识别功能，同时兼具光纤传感器稳定性好、灵敏度高、制造简单、成本低、轻便、低耗传输、抗电磁干扰、安全等优点，利用现代通讯技术可以实现实时和远程监测，具有巨大的发展潜力。目前，分子印迹光纤传感技术已被应用于临床分析、食品、环境等众多领域。
发明内容
本发明的第一个目的是为了解决现有大部分光纤传感器不可替换，不能进行现场多目标监测，且光纤探头修饰传感膜后无法洗脱回收的问题，提供了一种分子印迹荧光光纤传感器，该传感器为可拆卸式的传感器，使得光纤探头可以替换，以便在现场分别进行多目标的快速检测，能够运用于环境水体中抗生素的现场快速监测，并且在使用结束后可以轻松破坏光纤探头修饰的传感膜，光纤探头得以回收，减少不必要的资源浪费。
本发明的第二个目的在于提供一种上述分子印迹荧光光纤传感器的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供一种上述分子印迹荧光光纤传感器的荧光检测方法。
本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种分子印迹荧光光纤传感器，包括激光光源、Y型光纤、石英光纤、法兰适配器和光纤光谱仪，所述激光光源、Y型光纤和光纤光谱仪依次相连，所述石英光纤修饰含有分子印迹微球的凝胶膜，所述Y型光纤与石英光纤之间通过法兰适配器可拆卸连接；
所述激光光源发射出的激光通过Y型光纤传递到石英光纤上的凝胶膜，凝胶膜的荧光信号反射回Y型光纤，由Y型光纤传递到光纤光谱仪。
进一步的，还包括暗箱，所述Y型光纤与石英光纤的连接的一端、石英光纤和法兰适配器均设置在暗箱内。
进一步的，还包括计算机，所述光纤光谱仪与计算机连接。
进一步的，还包括滤光片，所述滤光片设置在Y型光纤与光纤光谱仪之间，所述Y型光纤通过滤光片与光纤光谱仪相连。
本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种上述分子印迹荧光光纤传感器的构建方法，所述方法包括：
合成分子印迹聚合物纳米微球；
取部分合成的分子印迹聚合物纳米微球，分散于水中，配置分子印迹微球水分散液；
移取部分配置好的分散液于小锥形瓶中，并加入聚乙二醇二丙烯酸甲酯、2-羟基-2-甲基苯丙酮，磁力搅拌一段时间，进行脱气操作，得到半透明状的凝胶膜预聚液；
将石英光纤***空心玻璃管中，往空心玻璃管底端注入一部分凝胶膜预聚液，在紫外灯下光聚合一段时间后，取出石英光纤，得到修饰含有分子印迹微球的凝胶膜的石英光纤；
将激光光源、Y型光纤和光纤光谱仪依次相连，并通过法兰适配器将修饰含有分子印迹微球的凝胶膜的石英光纤与Y型光纤相连接。
进一步的，所述合成分子印迹聚合物纳米微球，具体包括：
将模板分子粉末装入圆底烧瓶中，加入乙腈溶液超声充分溶解，再加入甲基丙烯酸、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈，超声至全部溶解后，通氮气一段时间，利用胶带密封圆底烧瓶；
将圆底烧瓶置于恒温水浴锅中进行反应，得到白色沉淀聚合物，即分子印迹聚合物纳米微球；
离心去除圆底烧瓶中的溶剂后，洗涤除去未反应的有机溶剂，并洗脱分子印迹聚合物纳米微球上的模板分子；
将分子印迹聚合物纳米微球置于真空干燥箱中过夜，得到代用的分子印迹聚合物。
进一步的，所述洗涤除去未反应的有机溶剂，并洗脱分子印迹聚合物纳米微球上的模板分子，具体包括：
用甲醇与水的混合溶液反复洗涤除去未反应的有机溶剂；
用甲醇与乙酸的混合洗脱溶液在摇床上洗脱分子印迹聚合物纳米微球上的模板分子，直至在紫外光分光光度计上检测不到洗脱液上清液的模板分子后，用甲醇洗去乙酸。
进一步的，所述甲醇与水的混合溶液中，甲醇：水＝1：1。
进一步的，所述甲醇与乙酸的洗脱溶液中，甲醇：乙醇＝8：2。
进一步的，所述将模板分子粉末装入圆底烧瓶中，具体为：称取41mg～42mg的模板分子粉末，并装入圆底烧瓶中。
进一步的，所述加入甲基丙烯酸、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈，具体为：加入85μl～87μl的甲基丙烯酸、371μl～372μl的二乙烯基苯和14mg～15mg的偶氮二异丁腈。
进一步的，所述取部分合成的分子印迹聚合物纳米微球，具体为：称取2mg～3mg的分子印迹聚合物纳米微球。
进一步的，所述移取部分配置好的分散液于小锥形瓶中，具体为：移取2ml～4ml配置好的分散液于小锥形瓶中。
进一步的，所述加入聚乙二醇二丙烯酸甲酯、2-羟基-2-甲基苯丙酮，具体为：加入1.6ml～20ml平均分子量为700的聚乙二醇二丙烯酸甲酯、22μl～24μl的2-羟基-2-甲基苯丙酮。
进一步的，所述将石英光纤***空心玻璃管中，具体为：
将石英光纤套入圆锥形塑料模具中，并将圆锥形塑料模具***空心玻璃管中，使石英光纤固定在空心玻璃管的中心。
进一步的，所述往空心玻璃管底端注入一部分凝胶膜预聚液之后，调整石英光纤与空心玻璃管底端距离为0.2cm～0.3cm。
进一步的，所述往空心玻璃管底端注入一部分凝胶膜预聚液，具体为：往空心玻璃管底端10注入18μl～22μl步骤二配置的凝胶膜预聚液。
本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种基于上述分子印迹荧光光纤传感器的荧光检测方法，所述方法包括：
吸取检测溶液于离心管中，并将石英光纤放入离心管中浸泡，超声一段时间进行吸附；
当吸附结束后，取出石英光纤，将石英光纤放入去离子水中浸泡，将未吸附的残余吸附液洗去；
将处理后的石英光纤通过法兰适配器接入整体仪器，激光光源发射出的激光通过Y型光纤传递到石英光纤上的凝胶膜，凝胶膜的荧光信号反射回Y型光纤，由Y型光纤传递到光纤光谱仪，以实现荧光检测。
进一步的，所述吸取检测溶液于离心管中，具体为：吸取0.8ml～1.2ml检测溶液于离心管中。
本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：
1、本发明的传感器将分子印迹技术与光纤传感技术相结合，不仅具有分子印迹聚合物的高选择性和光纤传感技术的微型化等优点，并且相较于大型光学传感器具有轻便、快速、操作简便、成本低等优点；与现有的光纤传感器不同，设计中涂覆的分子印迹材料能在检测结束后通过改变条件而快速洗去，即被修饰的光纤探头可回收重复使用，耗材成本较低；在保持通光效率的同时，整个仪器具有可拆卸、可替换的优点，即可实现快速、多目标物的现场监测，对于环境水体中抗生素的现场快速检测具有一定的研究意义，能够运用于环境水体中抗生素的现场快速监测，解决了现有抗生素现场监测方法稳定性和重现性差、分析成本高，难以提供环境水体中抗生素的实时污染数据的问题。
2、本发明的传感器可以在Y型光纤与光纤光谱仪之间设置滤光片，Y型光纤通过滤光片与光纤光谱仪相连，通过滤光片可以过滤多余反射的激发光，以减小检测误差。
3、本发明在光纤探头的修饰过程中，配置凝胶膜预聚液时会加入聚乙二醇二丙烯酸甲酯，聚乙二醇二丙烯酸甲酯可在光照下由光引发剂引发自由基聚合，形成网状结构，把分子印迹微球包裹在凝胶膜里，保持荧光效率。
4、本发明在光纤探头的修饰过程中，将石英光纤套入圆锥形塑料模具中，并将圆锥形塑料模具***空心玻璃管中，使石英光纤固定在空心玻璃管的中心，以减小检测误差；并在注入凝胶膜预聚液后，调整石英光纤距离空心玻璃管底端0.2cm～0.3cm，以减小不同组分之间的检测误差。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例的分子印迹荧光光纤传感器结构图。
图2为本发明实施例的光纤探头修饰凝胶膜的示意图。
图3为本发明实施例的合成被修饰凝胶膜的石英光纤示意图。
图4为本发明实施例的测试吸附前后平行试验误差效果图。
图5为本发明实施例的测试吸附荧光效果增强图。
图6为本发明实施例的优化吸附效果时间图。
图7为本发明实施例的对吸附物质的选择性效果图。
其中，1-激光光源，2-Y型光纤，3-石英光纤，4-法兰适配器，5-光纤光谱仪，6-暗箱，7-计算机，8-滤光片，9-圆锥形塑料模具，10-空心玻璃管，11-紫外灯。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
如图1所示，本实施例提供了一种分子印迹荧光光纤传感器，该传感器包括激光光源1、Y型光纤2、石英光纤3、法兰适配器4和光纤光谱仪5，激光光源1、Y型光纤2和光纤光谱仪5依次相连，石英光纤3为光纤探头，其修饰含有分子印迹微球的凝胶膜，即凝胶膜即为传感膜，Y型光纤2与石英光纤3之间通过法兰适配器4可拆卸连接，即石英光纤3是可替换的，有助于多目标的监测。
进一步地，为了提高监测效果，本实施例的分子印迹荧光光纤传感器还包括暗箱6，Y型光纤3与石英光纤3的连接的一端、石英光纤3和法兰适配器4均设置在暗箱6内。
进一步地，本实施例的分子印迹荧光光纤传感器还包括计算机7，光纤光谱仪5与计算机7连接，通过计算机7对光纤光谱仪5接收的信号进行采集与分析。
进一步地，本实施例的分子印迹荧光光纤传感器还包括滤光片8，滤光片8设置在Y型光纤2与光纤光谱仪5之间，Y型光纤2通过滤光片8与光纤光谱仪5相连，滤光片3的作用是过滤多余反射的激发光，以减小检测误差。
具体地，本实施例的激光光源1采用固定波长激光器，其功率为100W，激发波长为405nm；Y型光纤2的内径为600μm，其分叉的两端中，一端连接激光光源1，另一端连接滤光片8，未分叉的一端连接法兰适配器4，并置于暗箱6内；滤光片8的波长为420nm，其通过600nm的单根光纤连接光纤光谱仪5；光纤光谱仪5采用蔚蓝光学公司maya2000pro的光纤光谱仪，所有光纤连接接口都是SMA905接口，光纤光谱仪5连接计算机7后，主要参数设置为：积分时间为20，平均次数为10，平均宽度为4，检测波段为415-650，间隔为0，波长修正为0；石英光纤3的内径为1000μm，长度为5cm，其连接法兰适配器4，并置于暗箱6内。
本实施例的分子印迹荧光光纤传感器的监测原理为：激光光源1发射出固定波长的激光，通过Y型光纤2到达暗箱内的石英光纤3，即激光传递到石英光纤3上的凝胶膜，石英光纤3上传感膜的荧光信号反射回Y型光纤2，再通过滤光片8传递到光纤光谱仪5，最后在计算机7上进行信号采集与分析。
本实施例还提供了一种上述分子印迹荧光光纤传感器的构建方法，该方法包括以下步骤：
(1)合成分子印迹聚合物纳米微球
a、以环丙沙星为模板分子，称取41.4mg的环丙沙星，将环丙沙星粉末装入圆底烧瓶中，加入乙腈溶液超声充分溶解，再加入86μl的甲基丙烯酸(功能单体)、371.5μl的二乙烯基苯和偶氮二异丁腈(交联剂)，超声10分钟至全部溶解后，通氮气10分钟，利用胶带密封圆底烧瓶。
b、将圆底烧瓶置于60℃恒温水浴锅中反应24小时，得到白色沉淀聚合物，即直径在200nm左右的分子印迹聚合物纳米微球。
c、离心去除溶剂后用甲醇：水＝1:1(V/V)的混合溶液反复洗涤除去未反应的有机溶剂，再用甲醇：乙酸＝8:2(V/V)的混合洗脱溶液在摇床上洗脱模板分子，直至在紫外光分光光度计上检测不到洗脱液上清液的模板分子，证明模板分子已经洗脱完全，最后用甲醇洗去乙酸，置于60℃真空干燥箱中过夜，即可得到代用的分子印迹聚合物。
其中，合成的分子印迹聚合物微球粒径大致在200nm左右且分散均匀，洗脱模板分子后的分子印迹聚合物微球也会包埋有微少的环丙沙星分子，也会含有微弱荧光信号，模板分子与分子印迹聚合物微球之间靠氢键作用，所以用甲醇和乙酸的混合洗脱溶液破坏其氢键，对模板分子进行完全洗脱。
(2)配置凝胶膜预聚液
a、称取2.5mg干燥后的分子印迹聚合物微球，分散于10ml水中，配置分子印迹微球水分散液。
b、移取3ml配置好的分散液于10ml小锥形瓶中，并加入1.8ml平均分子量为700的聚乙二醇二丙烯酸甲酯、23μl的2-羟基-2-甲基苯丙酮(光引发剂)，磁力搅拌5min并进行脱气操作，即可得到半透明状的凝胶膜预聚液。
其中，聚乙二醇二丙烯酸甲酯可在光照下由光引发剂引发自由基聚合，形成网状结构，将分子印迹聚合物微球包裹在凝胶膜里，保持荧光效率。
(3)修饰光纤探头
光纤探头的修饰依照图2进行，具体包括：
a、将石英光纤3套入圆锥形塑料模具9中，并将圆锥形塑料模具9***内径为2mm、长度为2cm的空心玻璃管10中，使石英光纤3***空心玻璃管10的一端距离空心玻璃管10底端距离为0.25cm。
b、往空心玻璃管底端注入20μl步骤(2)配置的凝胶膜预聚液，在紫外灯11下光聚合10分钟后，取出石英光纤，得到修饰含有分子印迹微球的凝胶膜的石英光纤，如图3所示。
其中，圆锥形塑料磨具10作用为将石英光纤8固定于空心玻璃管11的中心，以减小检测误差；在注入20μl凝胶膜预聚液后，调整石英光纤距离空心玻璃管10底端0.25cm，以减小不同组分之间的检测误差，凝胶膜中的分子印迹聚合物微球分散均匀，整齐排列。
(4)搭建传感器的仪器
将激光光源1、Y型光纤2、滤光片8、光纤光谱仪5和计算机7依次相连，通过法兰适配器4将修饰含有分子印迹微球的凝胶膜的石英光纤3与Y型光纤2相连接，使Y型光纤3与石英光纤3的连接的一端、石英光纤3和法兰适配器4置于暗箱6内。
本实施例还提供了一种基于上述分子印迹荧光光纤传感器的荧光检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)将修饰好的小段石英光纤3，用去离子水超声三次，每次10min，为了洗去没有反应的杂质，并使其达到凝胶膜溶胀平衡。
(2)将环丙沙星溶液作为检测溶液，吸取1ml环丙沙星溶液于10ml离心管中，并将石英光纤3放入离心管中浸泡，超声30min进行吸附。
(3)当吸附结束后，取出石英光纤3，将石英光纤3放入去离子水中浸泡10min，以去除凝胶膜本身非特异性吸附抗生素的干扰。
(4)将处理后的石英光纤3通过法兰适配器4接入整体仪器，激光光源1发射出固定波长的激光，通过Y型光纤2到达暗箱内的石英光纤3，即激光传递到石英光纤3上的凝胶膜，石英光纤3上传感膜的荧光信号反射回Y型光纤2，再通过滤光片8传递到光纤光谱仪5，以实现荧光检测，最后在计算机7上进行信号采集与分析。
本实施例的检测效果如下：
A、图4为平行测试10根修饰光纤的起始波长和在超声20min条件下吸附5×10-4mol/l环丙沙星溶液1ml吸附前和吸附后的荧光强度对比(注：环丙沙星在405nm波长下最佳发射波长为468nm所以采集数据为波长为468nm的荧光强度)，可以看到吸附后荧光强度有增强，且平行样品误差在可接受范围内；图5为峰值增强后的前后对比图，可以看到最佳发射峰在468nm，且吸附前后峰型没变化，发射峰没有明显的红移与蓝移。
B、图6为测试吸附时间效果图。测试吸附超声时间的长短判断最佳吸附时间，判断是否符合快速监测的条件。实验发现，在30min分钟荧光增强达到最大值，所以吸附最优时间在30min可吸附完全，符合现场快速监测在30分钟内的条件。
C、图7为测试本实施例的传感器的选择性。选择与环丙沙星不同相似结构的抗生素进行吸附，吸附后传感器在468nm的波长判断其选择性好坏。由图7可知，传感器对环丙沙星具有较好的选择性，荧光增强率(计算方法为F/F0-1，F为吸附后波长为468nm处的荧光强度，F0为吸附前波长为468nm处的荧光强度)达到类似结构抗生素的两倍以上，符合特异性识别检测的条件。
综上所述，本发明的传感器将分子印迹技术与光纤传感技术相结合，不仅具有分子印迹聚合物的高选择性和光纤传感技术的微型化等优点，并且相较于大型光学传感器具有轻便、快速、操作简便、成本低等优点；与现有的光纤传感器不同，设计中涂覆的分子印迹材料能在检测结束后通过改变条件而快速洗去，即被修饰的光纤探头可回收重复使用，耗材成本较低；在保持通光效率的同时，整个仪器具有可拆卸、可替换的优点，即可实现快速、多目标物的现场监测，对于环境水体中抗生素的现场快速检测具有一定的研究意义，能够运用于环境水体中抗生素的现场快速监测，解决了现有抗生素现场监测方法稳定性和重现性差、分析成本高，难以提供环境水体中抗生素的实时污染数据的问题。
以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。