阅读说明：本技术 一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用 (drug screening model, drug screening method and application thereof ) 是由 王鹍 魏天资 杨选军 仲寒冰 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用,所述药物筛选模型为dhx33基因缺陷型斑马鱼。本发明采用dhx33基因缺陷型斑马鱼作为药物筛选模型,dhx33基因不能正常表达,而p53基因及其下游p21和caspase8基因均表达升高,凋亡细胞的数量明显增加,头部和眼睛表型较野生型斑马鱼胚胎的头部和眼睛表型明显变小,表型的改变可以通过p53抑制剂的处理而恢复,dhx33基因缺陷型斑马鱼具有作为p53抑制剂的药物筛选模型的潜能。(the invention provides a drug screening model, a drug screening method and application thereof, wherein the drug screening model is dhx33 gene defective zebra fish. The invention adopts dhx33 gene defective zebra fish as a drug screening model, the dhx33 gene can not normally express, the p53 gene and the downstream p21 and caspase8 genes thereof are both expressed and increased, the number of apoptotic cells is obviously increased, the head and eye phenotypes are obviously reduced compared with the head and eye phenotypes of wild zebra fish embryos, the phenotype change can be recovered by the treatment of a p53 inhibitor, and the dhx33 gene defective zebra fish has the potential of the drug screening model as the p53 inhibitor.)

一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用，尤其涉及一种p53抑制剂筛选模型、筛选方法及其应用。

背景技术

p53是最重要的抑癌基因之一，临床上的多种抗肿瘤药物均以p53作为靶点，通过激活p53的活性抑制肿瘤形成。然而，近期研究表明，在肿瘤治疗的过程中，p53在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤淋巴、造血、肠上皮细胞等增生活跃的细胞，产生副效应，因此在正常细胞中需要降低p53的活性。由于目前p53抑制剂的种类较少，需要通过药物筛选的方式寻找更多的p53抑制剂。

目前常用的药物筛选方法主要包括虚拟筛选、分子水平筛选和细胞水平筛选。其中，虚拟筛选是指在已知靶点和药物结构的情况下，通过计算机模拟二者之间的相互作用，从而筛选出可能有效的药物，具有成本低、速度快的优点，但是存在筛选得到的药物没有效果或效果甚微的问题，需要进一步通过生物实验进行验证；分子水平筛选是指将目的蛋白与候选药物混合，通过酶连免疫、荧光显色、核磁共振等方法检测蛋白与药物之间的相互作用，筛选得到的药物与目的蛋白结合力强，但是在细胞环境中却可能无法发挥作用；细胞水平筛选是指用候选药物处理靶细胞，再通过生化实验检验药物对靶细胞的作用，筛选得到的药物虽然能够有效地作用于靶细胞，但是实验流程复杂，且无法评估药物对整体生物是否有毒副作用。采用上述三种方法筛选得到的药物存在着不同的问题，限制了其在临床上的应用。

CN106699897A公开了一种用于筛选MdmX抑制剂或测试MdmX抑制剂的抑制活性的融合蛋白，包括测试序列、结合序列和连接臂序列；其中测试序列为MdmX序列或包含MdmX序列中的p53结合结构域的MdmX片段；结合序列为p53序列或包含p53序列中的MdmX结合结构域的p53片段；连接臂序列为一个肽段，其上下游分别与所述测试序列和所述结合序列之一连接，其氨基酸序列不参与融合蛋白的二级结构的形成，其长度和柔性足以使所述测试序列的空间结构的任一表面部分与所述结合序列的空间结构的任一表面部分在空间上有机会相接触；所述融合蛋白采用荧光光谱分析其抑制作用，但是在细胞环境中却可能无法发挥作用。

CN106701996A公开了一种筛选p53与MDM2蛋白相互作用的抑制剂的方法，包括以下步骤：1)构建p53与MDM2蛋白相互作用的表面等离子体激元共振传感芯片；2)利用该芯片筛选抑制剂；所述方法具有简单快速、免标记、特异性高、实时在线等优点，是一种分子水平筛选方法，筛选得到的药物同样存在在细胞环境中无法发挥作用的问题。

因此，建立一种新型的药物筛选模型，用于高通量快速筛选p53抑制剂，具有重要的临床意义和广泛的应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用，利用敲除dhx33基因的生物体作为p53抑制剂的筛选模型，能够评估候选药物对完整生物个体的生长发育和存活的影响，提高了候选药物在临床治疗中的应用潜能，并使药物筛选过程简单快速。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种药物筛选模型，所述药物筛选模型为dhx33基因缺陷型斑马鱼。

本发明中，申请人利用基因敲除技术构建的dhx33基因缺陷型斑马鱼具有p53基因高表达的特性，表型较野生型斑马鱼发生明显变化，可以用于快速判断小分子药物是否能够通过抑制p53活性来恢复突变表型，从而筛选得到对整体生物有效果的p53抑制剂。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的p53基因过表达。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的p21基因过表达。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的caspase8基因过表达。

本发明中，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼胚胎中细胞凋亡处于高水平，凋亡细胞的数量较野生型斑马鱼胚胎明显增加。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼发生表型变化。

优选地，所述表型变化包括斑马鱼头部和/或眼睛的尺寸发生改变。

本发明中，dhx33基因缺陷型斑马鱼胚胎的头部和眼睛较野生型胚胎的头部和眼睛明显变小，很可能是由于p53活性升高导致细胞凋亡引起的。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼通过基因敲除方法敲除野生型斑马鱼的dhx33基因而得到。

优选地，所述基因敲除方法包括同源重组、ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9中的任意一种或至少两种的组合，优选为CRISPR-Cas9。

第二方面，本发明提供了一种dhx33基因缺陷型斑马鱼在制备药物筛选模型中的应用。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的p53基因过表达。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的p21基因过表达。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼的caspase8基因过表达。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼发生表型变化。

优选地，所述表型变化包括斑马鱼头部和/或眼睛的尺寸发生改变。

优选地，所述dhx33基因缺陷型斑马鱼通过基因敲除方法敲除野生型斑马鱼的dhx33基因而得到。

优选地，所述基因敲除方法包括ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9中的任意一种或至少两种的组合，优选为CRISPR-Cas9。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的药物筛选模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)CRISPR-Cas9靶位点设计：

以dhx33基因的第3个外显子上的20bp序列作为靶位点，设计gRNA；

(2)RNA导入：

将gRNA和Cas9 mRNA导入斑马鱼单细胞胚胎中；

(3)突变体鉴定：

将步骤(2)获得的斑马鱼胚胎培养至成鱼，挑选出dhx33基因缺陷型突变体。

优选地，步骤(1)所述gRNA中的靶位点的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

SEQ ID NO:1：

GGCCGCGCAGCGCAGACGCT。

优选地，步骤(2)所述gRNA和所述Cas9 mRNA的比例为1:(2～3)。

优选地，步骤(3)所述挑选的方式为基因型鉴定。

优选地，步骤(3)所述突变体的dhx33蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

SEQ ID NO:2：

MPHEPDPPPAKRFKPGSPFFRLDKKPGMLLPRAGHAAAGVEAQRRHLPIYQSRTQVISQLRQLHSAVFIGETGSGKTTQIPQYLYEAGIGRQGIIAITQPRRVAAISLAGRVAEEKKVQLGKLVGYTVRFEDVTSPETKLKFMTDGMLLREAIGDPLLLRYTVVILDEAHERTVHTDVLFGVVKAALGAE。

本发明中，斑马鱼突变体在dhx33基因的靶位点处缺失11个碱基，在dhx33基因的第3个外显子上形成了翻译提前终止的密码子，在该突变体中，dhx33蛋白仅有从N端开始的190个氨基酸(野生型全长为680个氨基酸)，因此认为成功实现dhx33的基因敲除。

第四方面，本发明提供了一种药物筛选组合物，所述药物筛选组合物包括如第一方面所述的药物筛选模型。

优选地，所述药物筛选组合物还包括斑马鱼胚胎培养液。

第五方面，本发明提供了一种药物筛选方法，所述方法包括：

向如第一方面所述的药物筛选模型和/或如第四方面所述的药物筛选组合物中加入候选药物，培养后观察斑马鱼的表型变化。

本发明中，突变型斑马鱼胚胎的变小的头部和眼睛经p53抑制剂处理后恢复，因此所述dhx33基因缺陷型斑马鱼是一种有效的p53抑制剂筛选模型。

优选地，所述候选药物的浓度为1～5μM，例如可以是1μM、2μM、3μM、4μM或5μM。

优选地，所述培养的温度为27～29℃，例如可以是27℃、28℃、28.5℃或29℃，优选为28～28.5℃。

优选地，所述培养的时间为24～48h，例如可以是24h、27h、30h、33h、36h、39h、42h、45h或48h。

第六方面，本发明提供了一种p53抑制剂，所述p53抑制剂采用如第一方面所述的药物筛选模型和/或如第四方面所述的药物筛选组合物筛选得到。

优选地，所述p53抑制剂包括PFTα、PFTβ或PFTμ中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第六方面所述的p53抑制剂。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了一种如第一方面所述的药物筛选模型和/或如第四方面所述的药物筛选组合物在筛选p53抑制剂中的应用。

第九方面，本发明提供了一种如第六方面所述的p53抑制剂和/或如第七方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤治疗副作用药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用dhx33基因缺陷型斑马鱼作为药物筛选模型，在所述dhx33基因缺陷型斑马鱼中dhx33基因不能正常表达，而p53基因及其下游p21和caspase8基因均表达升高，凋亡细胞的数量明显增加；

(2)本发明的dhx33基因缺陷型斑马鱼胚胎的头部和眼睛表型较野生型斑马鱼胚胎的头部和眼睛表型明显变小，且表型的改变可以通过p53抑制剂的处理而恢复，突变型斑马鱼具有作为p53抑制剂的药物筛选模型的潜能；

(3)本发明的药物筛选模型具有筛选速度快、通量高的优点，筛选得到的药物在确保其生物整体有效性的基础上，还能大体评估药物对生长发育的毒副作用，提高了候选药物应用于临床治疗的可能性。

附图说明

图1(A)为整体原位杂交技术检测斑马鱼突变体中p53基因的表达，图1(B)为qPCR检测斑马鱼突变体中p53基因及其下游基因p21和caspase8的表达，图1(C)为细胞凋亡染色检测斑马鱼突变体中的凋亡细胞；

图2为斑马鱼野生型胚胎、突变体胚胎和PFTα处理后的突变体胚胎的表型变化。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 dhx33基因缺陷型斑马鱼突变体的构建

(1)CRISPR-Cas9靶位点设计

为了达到敲除基因的效果，将CRISPR-Cas9靶位点设计在dhx33基因的第3个外显子上，其序列如SEQ ID NO:1所示，根据靶位点序列合成向导RNA(gRNA)；

(2)RNA导入

收集单细胞时期的斑马鱼胚胎，采用Warner PLI-100A显微注射仪将gRNA和Cas9mRNA导入单细胞胚胎中，其比例为1:2，具体剂量为gRNA 150～300pg，Cas9 mRNA 300～600pg；

(3)突变体鉴定

将注射后胚胎培养至成鱼，并继续繁育F1代，对F1代成鱼进行基因型鉴定，寻找靶位点发生突变的个体，最终挑选出一种突变体，靶位点处缺失11个碱基AGCGCAGACGC(SEQID NO:3)，在dhx33的第3个外显子上形成了翻译提前终止的密码子，在该突变体中，dhx33蛋白仅有从N端开始的190个氨基酸(野生型全长为680个氨基酸)SEQ ID NO:2，因此认为成功实现dhx33的基因敲除。

实施例2 dhx33基因缺陷型斑马鱼突变体的表征

(1)整体原位杂交

采用地高辛标记的RNA探针对野生型斑马鱼胚胎和突变体斑马鱼胚胎进行整体原位杂交，并采用Leica DMi8显微镜和Leica DFC450 C数字照相机进行成像。

结果如图1(A)所示，黑色部分为原位杂交染色信号，颜色越深表明p53的表达量越高，可以看出突变体胚胎中p53基因的表达在受精后24小时和48小时都明显升高。

(2)qPCR

采用RNA提取试剂盒提取斑马鱼突变体的总RNA，反转录为cDNA后进行qPCR检测，实验过程中采用的引物由Life Technologies合成；p53、p21和caspase8基因的表达量采用ΔΔC_T法进行计算，内参基因为GAPDH。

结果如图1(B)所示，与野生型胚胎相比，突变体胚胎的p53基因、以及下游的p21和caspase8基因的表达均有上调。

(3)细胞凋亡分析

采用Roche凋亡试剂盒对野生型斑马鱼胚胎和突变体斑马鱼胚胎进行细胞凋亡分析。

结果如图1(C)所示，dhx33突变体胚胎中凋亡细胞的数量较野生型胚胎中凋亡细胞的数量明显增加。

实施例3 PFTα对dhx33基因缺陷型斑马鱼突变体的作用

在突变体斑马鱼胚胎发育至受精后12h的时候，向培养液中加入PFTα，终浓度为5μM，28.5℃下培养48h，显微镜下观察斑马鱼的表型变化。

结果如图2所示，突变体胚胎的头部和眼睛较野生型胚胎的头部和眼睛明显变小，当突变体胚胎进行PFTα处理后，头部和眼睛恢复正常，由此说明突变体胚胎的头部和眼睛变小很可能是由于p53活性升高导致细胞凋亡引起的。

综上所述，本发明采用dhx33基因缺陷型斑马鱼作为药物筛选模型，在所述dhx33基因缺陷型斑马鱼中dhx33基因不能正常表达，而p53基因及其下游p21和caspase8基因均表达升高，凋亡细胞的数量明显增加；所述dhx33基因缺陷型斑马鱼胚胎的头部和眼睛表型较野生型斑马鱼胚胎的头部和眼睛表型明显变小，且表型的改变可以通过p53抑制剂的处理而恢复；突变型斑马鱼作为药物筛选模型具有筛选速度快、通量高的优点，筛选得到的药物在确保其生物整体有效性的基础上，还能大体评估药物对生长发育的毒副作用，提高了候选药物应用于临床治疗的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方科技大学

<120> 一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用

<130> 20190916

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggccgcgcag cgcagacgct 20

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Pro His Glu Pro Asp Pro Pro Pro Ala Lys Arg Phe Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ser Pro Phe Phe Arg Leu Asp Lys Lys Pro Gly Met Leu Leu Pro Arg

20 25 30

Ala Gly His Ala Ala Ala Gly Val Glu Ala Gln Arg Arg His Leu Pro

35 40 45

Ile Tyr Gln Ser Arg Thr Gln Val Ile Ser Gln Leu Arg Gln Leu His

50 55 60

Ser Ala Val Phe Ile Gly Glu Thr Gly Ser Gly Lys Thr Thr Gln Ile

65 70 75 80

Pro Gln Tyr Leu Tyr Glu Ala Gly Ile Gly Arg Gln Gly Ile Ile Ala

85 90 95

Ile Thr Gln Pro Arg Arg Val Ala Ala Ile Ser Leu Ala Gly Arg Val

100 105 110

Ala Glu Glu Lys Lys Val Gln Leu Gly Lys Leu Val Gly Tyr Thr Val

115 120 125

Arg Phe Glu Asp Val Thr Ser Pro Glu Thr Lys Leu Lys Phe Met Thr

130 135 140

Asp Gly Met Leu Leu Arg Glu Ala Ile Gly Asp Pro Leu Leu Leu Arg

145 150 155 160

Tyr Thr Val Val Ile Leu Asp Glu Ala His Glu Arg Thr Val His Thr

165 170 175

Asp Val Leu Phe Gly Val Val Lys Ala Ala Leu Gly Ala Glu

180 185 190

<210> 3

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcgcagacg c 11