阅读说明：本技术 一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺及其抗氧化活性 (Ultrasonic optimized extraction process of peach blossom general flavone and antioxidant activity thereof ) 是由 李锟 *** 杨冬瑞 杨留长 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺,在单因素实验基础上,采用正交实验法优化了超声波辅助提取产于河南桃花总黄酮工艺条件。确定最佳提取工艺为料液比70∶1(mL/g),乙醇体积分数80％,超声时间20min,水浴温度60℃,超声功率350W,得率为7.59％,且该桃花总黄酮具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。(The invention discloses an ultrasonic optimized extraction process of peach blossom general flavone, which optimizes the process conditions of ultrasonic-assisted extraction of peach blossom general flavone produced in Henan province by adopting an orthogonal experimental method on the basis of a single-factor experiment. The optimal extraction process is determined as material-liquid ratio 70:1(mL/g), ethanol volume fraction 80%, ultrasonic time 20min, water bath temperature 60 deg.C, ultrasonic power 350W, yield 7.59%, and the flos persicae total flavone has the ability of scavenging DPPH and ABTS free radicals.)

一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺及其抗氧化活性

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺及其抗氧化活性。

背景技术

桃花为蔷薇科桃属植物桃Amygdalus persica L.或山桃A.davidiana的花，其味苦，性平，归心、肝、大肠经，有利水通便、活血化瘀、消食顺气、祛风镇静、美容润肤、艳颜美容等功效，既是良药，又是天然美容品，还可烹调，具有广泛的用途。查阅文献发现，目前关于桃花的研究对象多是蔷薇科李属桃树Prunus persica Batsch花的研究，发现其含有多糖、黄酮和多酚，显示出抗氧化活性，并对总黄酮的提取工艺进行了研究，如梁永锋采用超声波辅助提取桃花中的总黄酮，考查超声功率、料液比、乙醇体积分数、超声波时间等因素的影响；刘杰超等考查了乙醇浓度、提取时间、温度、提取次数等因素的影响；曾臻等优化了大孔树脂DM-28纯化桃花总黄酮的工艺参数。但目前未见同时考察料液比、乙醇体积分数、温度、超声功率对桃花总黄酮的影响，及此优化提取条件下桃花总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除能力。

本发明采用超声波辅助提取桃花中的黄酮，在单因素基础上对其提取工艺进行优化，进一步研究其抗氧化活性，可为桃花的进一步开发利用提供参考。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺，并进一步研究其抗氧化活性。

本发明的技术方案如下：

一种桃花总黄酮超声波的优化提取工艺，包括以下步骤：准确称取桃花，乙醇为溶剂，以一定的乙醇浓度、液料比、超声温度和超声功率下提取总黄酮，提取2次，趁热减压抽滤，合并滤液，即得桃花总黄酮溶液。

桃花总黄酮溶液进一步喷雾干燥可得到桃花总黄酮干粉。

优选的，最佳料液比为70∶1(mL/g)。

优选的，最佳乙醇体积分数为80％。

优选的，最佳超声时间为20min，超声功率为350W。

优选的，最佳水浴温度为60℃。

该桃花总黄酮具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。

本发明的有益之处在于：本发明在单因素实验基础上，采用正交实验法优化了超声波辅助提取产于河南桃花总黄酮工艺条件。确定最佳提取工艺为料液比70∶1(mL/g)，乙醇体积分数80％，超声时间20min，水浴温度60℃，超声功率350W，得率为7.59％，且该桃花总黄酮具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。

附图说明

图1：料液比对总黄酮提取率的影响图；

图2：乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响图；

图3：超声时间对总黄酮提取率的影响图；

图4：温度对黄酮提取率的影响图；

图5：超声功率对黄酮提取率的影响图；

图6：桃花总黄酮质量浓度与DPPH和ABTS自由基清除率关系图。

具体实施方式

实施例

1材料与方法

1.1材料与主要仪器

桃花，购自河南省郑州市药材市场，经本校药学教研室曹伶俐副教授鉴定为蔷薇科桃属桃Amygdalus persica L.的花；芦丁(标准品，纯度98％)由中国药品生物制品检定所提供；石油醚、无水乙醇购买于天津市津东天正精细化学试剂厂；亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯；超纯水(实验室自制)。

TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；移液枪等。

1.2试验方法

1.2.1超声波辅助提取桃花总黄酮的工艺

准确称取1.000g桃花，乙醇为溶剂，以一定的乙醇浓度、液料比、超声温度和超声功率下提取总黄酮，提取2次，趁热减压抽滤，合并滤液，即得桃花总黄酮溶液。

1.2.2总黄酮含量的测定

参考文献刘爱朋,焦倩,等.皂角刺总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化活性[J].中成药,2018,40(3):722-725.的方法，以AlCl₃代替Al(NO₃)₃,改变AlCl₃、NaOH和NaNO₂的浓度及体积，于510nm波长下测定吸光度，以吸光度对终浓度作图，建立标准曲线的回归方程，y＝15.12x+0.019(r＝0.9989)，芦丁质量在0.00125～0.015mg的范围内呈良好线性关系。

根据优化工艺提取多糖，按回归方程计算含量，桃花总黄酮得率的测定：

总黄酮得率(％)＝(A×V2)/(V1×M)×100％

式中，A标准曲线计算的被测液中总黄酮质量(mg)；M供试品质量(mg)；V1测定总体积(mL)；V2供试品定容总体积(mL)。

1.2.3桃花总黄酮提取单因素试验设计

采用“1.2.1”项下方法提取桃花总黄酮，固定乙醇体积分数70％，超声时间30min，温度50℃，超声功率为300W的条件下，研究料液比50:1、60:1、70:1、80:1、90:1(mL/g)对桃花总黄酮提取率的影响；固定料液比70:1(mL/g)，超声时间30min，水浴温度50℃，超声功率为300W的条件下，研究乙醇体积分数为50％、60％、70％、80％、90％对桃花总黄酮提取率的影响；固定料液比70:1(mL/g)，乙醇体积分数80％，温度50℃，超声功率300W的条件下，研究超声时间10、20、30、40、50min对桃花总黄酮提取率的影响；固定液比70:1(mL/g)，乙醇体积分数80％，，超声功率300W的条件下超声20min，研究温度40、50、60、70、80℃对桃花总黄酮得率的影响，每组实验平行操作3次。

1.2.4桃花总黄酮提取正交实验

采用SPSS 19.0软件，在单因素试验基础上，依据单因素试验结果设置水平，优化超声波提取桃花总黄酮的工艺参数，以总黄酮提取率为考察指标，选择料液比(A)、乙醇体积分数(B)、温度(C)、超声功率(D)为考察因素，进行L9(34)设计正交试验。正交试验因素与水平见表1，通过直观分析法得到影响多糖得率因素的主次顺序和最佳提取工艺参数，并用方差分析分析其结果。

表1正交试验因素水平表

1.2.5抗氧化活性测定

1.2.5.1清除DPPH自由基能力的测定参考文献Kang W Y,Li C F,Liu YX.Antioxidant phenolic compounds and flavonoids of Mitragyna rotundifolia(Roxb)Kuntze in vitro[J].Medicinal Chemistry Research，2010,19(9):1222-1232.的方法，测定桃花总黄酮对清除DPPH自由基的清除率，按公式(1)计算DPPH自由基清除率每份样品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol为DPPH本身在测定波长的吸收度，Asample为样品对DPPH作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。

1.2.5.2清除ABTS自由基能力的测定参考文献卢引,李光勇,魏金凤,等.清除ABTS自由基微量模型的建立[J].天然产物研究与开发,2013,25(11):1533-1535.的方法，测定桃花总黄酮对清除ABTS自由基的清除率，按公式(2)计算ABTS自由基清除率。每份样品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol为ABTS自由基本身在测定波长的吸收度，Asample为样品对ABTS自由基作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。

2结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1料液比对桃花总黄酮得率的影响料液比对桃花总黄酮得率的影响，结果见图1。从图1可以得出，桃花总黄酮提取率随料液比的增加呈先增加再减少趋势。随着料液比的增大，桃花总黄酮的得率不断的升高，当料液比为70:1(mL/g)时，总黄酮类提取率达到最大值，之后随着料液比的继续增加，桃花总黄酮的得率缓慢下降。料液比影响提取率主要是由于溶剂量的增大可以降低溶剂中有效成分的浓度，加大与细胞内有效成分的浓度差，促进细胞内有效成分的扩散。因此，最佳料液比为70:1，选择超声波功率70:1、80:1和90:1三个水平做正交实验。

2.1.2乙醇体积分数对桃花总黄酮得率的影响乙醇体积分数对桃花总黄酮得率的影响如图2。从图2可以得出，在乙醇体积分数相对较低时，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率逐渐增加，当乙醇体积分数达到80％时，总黄酮提取率最高。当乙醇体积分数大于80％时，总黄酮提取率随乙醇浓度的增加而逐渐降低。这可能是因为乙醇体积分数不同导致极性有所差异，当乙醇体积分数逐渐增加时，总黄酮与蛋白质等物质之间形成的氢键遭到破坏，疏水相互作用力变强，增加了黄酮类化合物的溶出，得率变大；而乙醇体积分数过高，增加了桃花总黄酮与试剂间的极性差异，使得黄酮类物质溶出减少。因此，初步确定最佳乙醇体积分数为80％，因此，选择超声波功率70、80和90％三个水平做正交实验。

2.1.3超声时间对桃花总黄酮得率的影响超声时间对桃花总黄酮得率的影响如图3。由图3可以看出，总黄酮类提取率随着超声时间的增加呈先增加后减少再增加的趋势。当超声时间为20min时，总黄酮类提取率最大；当时间大于20min后，黄酮类物质提取率显著降低。这可能是因为超声时间小于20min时，超声波的空化作用加速了细胞内有效物质的释放；当超声达到一定时间后，时间越长，总黄酮得率反而下降，原因可能是超声提取时间过长会对总黄酮的结构造成破坏,故提取率下降。因此，最适超声时间为20min。

2.1.4温度对桃花总黄酮得率的影响温度对桃花总黄酮得率的影响如图4。从图4可知，桃花总黄酮的得率随着温度的增大呈先增加后减少的趋势，在70℃时，总黄酮得率最大。其原因是由于升高温度有利于提取液中粘度的降低，从而可以提高总黄酮的提取率。当温度大于70℃，温度过高不仅增加了非目标物质的溶出，也不利于桃花黄酮的稳定性，使总黄酮分子结构异构化，且容易被氧化，导致总黄酮提取率显著降低。综合考虑，最佳提取温度为70℃，因此，选择超声时间50、60和70℃三个水平做正交实验。

2.1.5超声功率对桃花总黄酮得率的影响超声功率对桃花总黄酮得率的影响如图5。从图5可知，总黄酮提取率随着超声波功率的增加呈先增长后下降的趋势。当超声功率达到300W时，总黄酮提取率最大，黄酮类化合物含量较高。随着超声功率的增大，总黄酮提取率开始下降，含量逐渐下降。这可能是由于随着超声功率的增大，其对植物细胞的破碎作用增强，加速有效成分的溶解，提高提取量，但当超声功率达到一定程度时，其他成分如叶绿素、果胶的溶出量可能会增加，影响总黄酮的提取率。因此，最佳超声功率为300W，选择温度300、350和400W三个水平做正交实验。

2.2正交试验在单因素试验基础上，选择料液比(A)、乙醇体积分数(B)、温度(C)、超声功率(D)为考察因素，进行L9(34)设计正交试验，优化超声波辅助提取桃花总黄酮的工艺，正交试验因素表见表1，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2正交试验结果

从表2的极差分析可知，影响桃花总黄酮得率的因素主次顺序为：料液比(A)>乙醇体积分数(B)>超声功率(D)>温度(C)，由直观分析可知，最优的参数组合，即A1B2C2D2。由表3方差分析可知，在超声波辅提取桃花总黄酮工艺正交实验所选择的因素和水平范围内，料液比、乙醇体积分数和超声功率对黄酮得率影响极显著，温度的影响非常显著，与直观分析结果基本上一致。因此，正交实验验证实验结果显示，桃花总黄酮最优工艺为料液比70∶1(mL/g)，乙醇体积分数80％，超声时间20min，水浴温度60℃，超声功率350W。得率为7.59％，而在不进行超声的条件下，进行总黄酮提取，得率为6.44％。可见，超声波辅助提取可使桃花总黄酮得率显著提高。

表3方差分析

注:***p<0.001为影响极显著；**p<0.01为影响非常显著。

2.3抗氧化活性

桃花总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除能力见表4。由表4可以看出，在初始浓度分别为55.56和95.24μg/mL下，桃花总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除率分别96.96％和74.60％，均大于50％，为了进一步研究浓度与清除率的关系，对总黄酮进一步的稀释，测定半数抑制率，结果如图6。图6显示，在实验浓度范围内，桃花总黄酮对DPPH自由基清除率与浓度呈正量效关系，总黄酮浓度(x)与清除率(y)的回归线性方程为y＝1.738x+3.413，相关系数(r)为0.9945，即随着浓度增加，其对ABTS自由基清除率也随之增大，IC50为24.05μg/mL，接近于阳性对照BHT(IC50为23.00μg/mL)。

在低浓度时，桃花总黄酮对ABTS自由基清除率与浓度呈正量效关系，总黄酮浓度(x)与清除率(y)的回归线性方程为y＝1.825x+6.261，相关系数(r)为0.9685，但是当浓度大于13.89μg/mL时，在继续增大浓度，对ABTS自由基的清除率变化较缓，IC50为35.10μg/mL，弱于阳性对照BHT(IC50为8.81μg/mL)。

表4桃花总黄酮对DPPH和ABTS自由基清除活性

注：BHT为阳性对照

参阅文献发现，梁永锋采用超声波辅助提取产于宁夏桃花中总黄酮，最佳工艺条件:超声功率为80W，料液比为1g∶20mL，乙醇体积分数为60％，超声波时间为75min，桃花中黄酮含量为5.24％，超声时间明显延长，且黄酮含量反而没有增加，而与本文的研究对比发现，加热提取可以缩短提取的时间。魏山山等采用60％乙醇溶液60℃水浴加热2h提取产于肥城、新泰、泰安桃花峪3种不同产地桃花中黄酮，含量分别为52.91±0.65、43.78±0.59、85.38±0.79mg/g，且3种不同产地桃花黄酮对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力不同。可见，桃花中黄酮的含量具有地域性差异，而且与乙醇浸提法相比，采用超声波辅助提取可明显的缩短提取时间，提高提取效率。

3结论

本发明在单因素实验基础上，采用正交实验法优化了超声波辅助提取产于河南桃花总黄酮工艺条件。确定最佳提取工艺为料液比70∶1(mL/g)，乙醇体积分数80％，超声时间20min，水浴温度60℃，超声功率350W，得率为7.59％，且该桃花总黄酮具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。