阅读说明：本技术 一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法 (Preparation method of tissue regeneration guiding membrane for tooth restoration ) 是由 奚桢浩 韩宇晴 宋超波 张嘉鹏 岑莲 陆尔奕 崔立宇 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法,包括如下步骤：(1)将合成高分子材料溶解于有机溶剂中,分散均匀,将溶液浇注于培养皿内,然后进行冷冻；得到第一层结构；(2)将天然高分子材料溶解于有机溶剂中,加入无机生物活性颗粒,分散均匀后,将上述混合溶液浇铸于所述第一层结构上,然后进行冷冻；得到复合层结构；(3)将步骤(2)得到的复合层结构进行冷冻干燥。本发明采用合成高分子和天然高分子复合材料,提高了复合膜机械性能的同时,提高其生物相容性；配合采用梯度温度冷冻的方式,调控复合膜纵向结构上孔结构的分布,形成了具有梯度结构的孔结构,更有利于细胞的粘附和生长,取得了显著的效果。(the invention discloses a preparation method of a tissue regeneration guiding membrane for tooth restoration, which comprises the following steps: (1) dissolving a synthetic high polymer material in an organic solvent, uniformly dispersing, pouring the solution into a culture dish, and freezing; obtaining a first layer structure; (2) dissolving a natural high polymer material in an organic solvent, adding inorganic bioactive particles, uniformly dispersing, casting the mixed solution on the first layer structure, and freezing; obtaining a composite layer structure; (3) and (3) freeze-drying the composite layer structure obtained in the step (2). The invention adopts the composite material of synthetic polymer and natural polymer, improves the mechanical property of the composite membrane and improves the biocompatibility of the composite membrane; the mode of gradient temperature refrigeration is adopted in a matching manner, the distribution of the pore structure on the longitudinal structure of the composite membrane is regulated and controlled, the pore structure with the gradient structure is formed, the adhesion and the growth of cells are facilitated, and the remarkable effect is obtained.)

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法。

背景技术

牙周病是人类常见的口腔疾病之一，在病发初期，牙周支持组织的结构被破坏，随着病情加重，牙周结构逐渐丧失，造成牙齿脱落。针对该疾病，出现了引导组织再生术。引导组织再生术(Guided Tissue Regeneration，GTR)是用外科的方法放置一个物理屏障来选择性地分隔不同的牙周组织，阻止牙龈上皮和牙龈***向根面生长，造成空间，诱导具有牙周组织再生潜力的牙周膜细胞冠向移动并生长分化，实现牙周膜、牙槽骨、牙骨质再生，形成牙周新附着的技术。自Nyman S将引导组织再生(Guided tissue regenerationGTR)原理应用于牙周新附着的生理性再生，越来越多学者致力于将GTR原理应用于临床实践。但是由于病例的选择，手术的方法，所应用的屏障膜的性能的不同，往往各研究报道创口愈合，组织再生程度存在一定的差异。Cortellini P通过研究总结包括651例垂直型骨缺损的17项GTR临床研究报道指出：在651例垂直型骨缺损的病例中，GTR术后一年发生附着丧失的病例约占2.7％，临床附着获得量少于2mm者为11％，附着获得在2-3mm之间的为24.8％，附着获得超过6mm者为21.2％；一些报道显示根分歧病变在GTR术后一年的组织再生程度也存在同样的差异。目前，研究显示，影响其临床效果的因素主要包括适应症的选择、手术方法的确定、膜的选择与使用等几个方面。其中，引导组织再生膜(膜材料)是在引导再生技术中起关键作用的高技术产品，也是GTR的核心材料，在国民健康医疗领域日益重要。

现有技术中，引导组织再生膜主要分为可降解与不可降解两类。不可降解膜具有机械性能优异、屏障作用明显的特点，根据应用环境的不用，可应用多种不同的制备工艺。常用的非降解膜有高密度Cytoplast、微孔型Milipore、延展型Gore-Tex、用于牙槽扩大的GTAM等e-PTFE膜，中邦的纯钛膜及三维钛网，也有将e-PTFE与钛支网进行复合的CytoplastTi-250。可降解膜具有屏障、维护再生空间及促进缺损修复、组织再生的作用；例如猪皮胶原制备的Bio-Gide膜，牛肌腱制备的BioMend Extend膜，牛皮制备的海奥口腔修复膜等。

因此，从效果方面来说，选择可降解膜更好，然而，现有的可降解膜制备周期较长、效率低、成本较高；而且，现有的可降解膜的机械性能差，在实际应用中经常出现结构坍塌而导致细胞无法粘附和生长的问题。

因此，开发一种新的引导组织再生膜及其制备方法，使引导组织再生膜不仅具有良好的机械性能，且可以促进细胞的粘附和生长，加速术后愈合，显然具有积极的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案是：一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)将合成高分子材料溶解于有机溶剂中，分散均匀，将溶液浇注于培养皿内，然后进行冷冻；得到第一层结构；

所述冷冻步骤在梯度温度下进行，将所述溶液置于上下冷冻温度不同的冷冻室内，控制上下接触冷冻板温度在-200～0℃之间，且上下接触冷冻板的温度差至少为40℃；上接触冷冻板的温度低于下接触冷冻板的温度；

(2)将天然高分子材料溶解于有机溶剂中，加入无机生物活性颗粒，分散均匀后，将上述混合溶液浇铸于所述第一层结构上，然后进行冷冻；得到复合层结构；

所述天然高分子材料选自胶原蛋白、丝素蛋白、琼脂、果胶中的一种或几种；

所述无机生物活性颗粒为羟基磷灰石、生物玻璃、磷酸三钙、二氧化硅或碳酸钙；

所述冷冻步骤在梯度温度下进行，将其置于上下冷冻温度不同的冷冻室内，控制上下接触冷冻板温度在-200～0℃之间，且上下接触冷冻板的温度差至少为40℃；上接触冷冻板的温度低于下接触冷冻板的温度；

(3)将步骤(2)得到的复合层结构进行冷冻干燥，即可得到用于牙齿修复的引导组织再生膜。

上文中，所述无机生物活性颗粒优选为纳米级颗粒。以所述天然高分子材料为100质量份计算，加入的无机生物活性颗粒的质量分数优选为0.1％～10％；更优选为1％～6％，更优选为3％～5％。

上文中，所述天然高分子材料优选胶原蛋白和/或丝素蛋白。

上述步骤(1)和(2)中的冷冻温度相同或不同，分别选自-200～0℃区间内任意一段区间温度，该区间温度本发明不做具体限定，典型但非限制性的可以是-200～-40℃、-60～-20℃、-120～0℃、-150～-30℃、-200～-30℃等等。

上述技术方案中，所述步骤(1)中的合成高分子材料选自聚乳酸、聚乳酸衍生物、聚乙交酯、聚乙交酯衍生物、聚丙交酯乙交酯、聚丙交酯乙交酯衍生物、聚己内酯、聚己内酯衍生物、聚丁二酸丁二醇酯中的一种或几种。

上述步骤(1)中，所述合成高分子材料优选为聚丙交酯乙交酯或聚丙交酯乙交酯衍生物；且其中聚丙交酯与聚乙交酯单体比例1:9～9:1，优选为7:3～5:5。

上述技术方案中，所述步骤(1)中的上下接触冷冻板的温度差为40～60℃。优选为45～55℃。更优选为50～52℃。

上述技术方案中，所述步骤(2)中的上下接触冷冻板的温度差为30～50℃。优选为40～45℃。更优选为46～48℃。

上述技术方案中，所述步骤(1)和(2)中的有机溶剂相同或不同，分别选自氯仿、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚、三乙醇胺、乙酸、乙酸乙酯、盐酸中的一种或几种。

上述技术方案中，所述步骤(1)和(2)中的分散采用超声分散，分散时间为10～120min。对于上述超声分散时间，本发明不做具体限定，典型但非限制性的可以是10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min等。

上述技术方案中，所述引导组织再生膜包括上下2层结构，其中，与所述步骤(1)的第一层结构对应的一层的孔径分布为20～300微米、连通率大于等于90％；另一层的孔径分布为1～20微米、连通率大于等于50％。

上述技术方案中，所述步骤(1)中的高分子材料的数均分子量为5～30万道尔顿。优选10～20万道尔顿。更优选12～18万道尔顿。更优选15～17万道尔顿。

本发明同时请求保护一种由上述的制备方法制备得到的用于牙齿修复的引导组织再生膜。

上述技术方案中，所述引导组织再生膜的厚度为20～500微米；其包括上下2层结构，第一层的孔径分布为20～300微米、连通率大于等于90％；另一层的孔径分布为1～20微米、连通率大于等于50％。

本发明的工作原理是：一方面，本发明采用双层骨架结构的复合膜，第一层的合成高分子材料起到力学支撑的作用，增强复合膜的机械性能，第二层的天然高分子材料及无机生物活性颗粒增强复合膜的生物相容性，有利于细胞的粘附、增殖及分化；另一方面，本发明采用梯度冷冻的方式，通过控制上下接触冷冻板温度，溶液快速冷冻时形成较小的冰晶、缓慢冷冻时形成较大的冰晶，因此在温度较低冷冻板附近形成较小冰晶温度较高冷冻板附近形成较大冰晶，通过冷冻干燥进而在复合膜内部形成不同大小的孔道，实现了材料中梯度孔结构的分布结构，同时在合成高分子材料层中形成孔径较小的致密结构，在天然高分子材料层中形成孔径较大的梯度孔结构；使用时，致密结构的一侧贴合于牙周软组织一侧，能够防止修复过程中***的渗入，而天然高分子材料层贴合于牙周骨缺损一侧，梯度孔结构可以促进细胞的分化，为骨细胞长入提供空间。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1)本发明采用合成高分子和天然高分子复合材料，提高了复合膜机械性能的同时，提高其生物相容性；同时，配合采用梯度温度冷冻的方式，调控复合膜纵向结构上孔结构的分布，形成了具有梯度结构的孔结构，实验证明：相比于现有的均一孔结构，本发明更有利于细胞的粘附和生长，取得了显著的效果；

2)本发明可以通过调配天然高分子材料的浓度及无机生物活性颗粒的添加量，可控的制备孔结构多层次分布的膜材料，制备得到了孔径不同的上下2层结构的医用生物可降解复合膜，可以很好的引导缺损区域的组织再生并阻止软组织侵入，满足引导再生的要求，达到组织修复的目的；

3)本发明创造性的引入了天然高分子材料，配合无机生物活性颗粒，可以有利于细胞的粘附和生长，为术后恢复提供了优异的条件，具有积极的现实意义。

附图说明

图1是本发明实施例1的复合膜结构的示意图。

图2、5、6、7是本发明实施例1的产品界面SEM图。

图3是本发明实施例2的产品界面SEM图。

图4是本发明实施例3的产品界面SEM图。

具体实施方式

结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA，其GA/LA摩尔比为7:3)溶解于氯仿中，超声分散20min，将溶液浇注于培养皿内，-80～-60℃梯度冷冻；

(2)将天然高分子材料胶原蛋白溶解于1％的乙酸溶液中，同时加入0.5wt％的纳米羟基磷灰石，超声分散30min，随后将溶液浇注于含有PLGA溶液的培养皿内，-80～-40℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间24h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构，其平均孔径40微米，孔隙率为75％，连通率89％。上层膜为大孔层，其孔径分布为30～60微米、连通率高于85％；下层膜为小孔层，其孔径分布为5～16微米，连通率高于50％。

实施例2

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚己内酯(PCL，分子量为10万)溶解于二氯甲烷，超声分散30min，将溶液浇注于培养皿内，-60～-40℃梯度冷冻；

(2)将天然高分子丝素蛋白，溶解于水中，同时加入2wt％的磷酸三钙，超声分散60min，随后将溶液浇注于含有PCL溶液的培养皿内，-60～-20℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间36h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构，其平均孔径100微米，孔隙率85％，连通率为90％。上层膜为大孔层，其孔径分布为130-180微米，连通率高于94％；下层膜为小孔层，其孔径分布为8～14微米，连通率高于53％。

实施例3

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚己内酯(PCL，分子量10万)溶解于二氯甲烷，超声分散30min，将溶液浇注于培养皿内，-60～-40℃梯度冷冻；

(2)将胶原蛋白(提取自猪皮I型胶原蛋白)溶解于1％乙酸中，加入4％活性生物玻璃，超声分散30min，随后将溶液浇注于含有PCL溶液的培养皿内，-60～-20℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间24h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构，其平均孔径110微米，孔隙率87％，连通率为93％。上层膜为大孔层，其孔径分布为120-180微米，连通率高于92％；下层膜为小孔层，其孔径分布为13～22微米，连通率高于64％。

实施例4

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚乳酸(PDLLA,分子量5万)溶解于二氯甲烷，超声分散30min，将溶液浇注于培养皿内，-40～-20℃梯度冷冻；

(2)将丝素蛋白溶解于去离子水中，加入2wt％活性生物玻璃，超声分散40min，随后将溶液浇注于含有PDLLA溶液的培养皿内，-20～0℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间24h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构，其平均孔径56微米，孔隙率78％，连通率为90％。上层膜为大孔层，其孔径分布为60-70微米，连通率高于91％；下层膜为小孔层，其孔径分布为10～14微米，连通率高于60％。

对比例1

采用猪皮为原料，采用冷冻干燥的方法进行制备，其方法大致如下：将猪皮切碎，使用水溶性有机溶剂从猪皮中除去水，并使得溶剂挥发；用液体烃溶剂将干燥的猪皮脱脂，除去液体烃溶剂，使干燥的猪皮快吸水。水化的猪皮块用1N氢氧化钠处理，然后使用0.04N盐酸处理猪皮块并在此洗涤，这样处理的材料用胶体研磨机研磨至约含1.5％胶原的均一浆料；将浆液平铺于培养皿内，在-20℃条件下冷冻24h，并冷冻干燥72小时。

对比例2

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA，其GA/LA摩尔比为7:3)溶解于氯仿中，超声分散20min，将溶液浇注于培养皿内，-80～-60℃梯度冷冻；

(2)将天然高分子材料明胶溶解于1％的乙酸溶液中，同时加入0.5wt％的纳米羟基磷灰石，超声分散30min，随后将溶液浇注于含有PLGA溶液的培养皿内，-80～-40℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间24h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构；上层膜为大孔层，其孔径分布为30～60微米、连通率高于85％；下层膜的孔径分布为30～50微米，连通率高于80％。

对比例3

与对比例2的内容相同，唯一不同之处在于：步骤(2)中的天然高分子材料为甲壳素。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构；上层膜为大孔层，其孔径分布为30～60微米、连通率高于85％；下层膜为小孔层，其孔径分布为1微米以下，连通率低于10％。

对比例4

与对比例2的内容相同，唯一不同之处在于：步骤(2)中的天然高分子材料为壳聚糖。

上述方法得到的引导组织再生膜出现了坍塌现象，只有合成高分子材料聚丙交酯乙交酯共聚物所在的层形成了膜结构，壳聚糖所在的层未形成膜。

由上述实施例1和对比例2-4对比可知，在选用天然高分子材料时，并不是所有的天然高分子材料都可以采用，选用不当时，会出现坍塌现象从而导致无法形成复合膜结构，而有的材料，即使是形成了复合膜结构，也无法形成本发明的具有梯度结构的孔结构。

对比例5

一种用于牙齿修复的引导组织再生膜的制备方法，由下列步骤组成：

(1)将聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA，其GA/LA摩尔比为7:3)溶解于氯仿中，超声分散20min，将溶液浇注于培养皿内，-80～-60℃梯度冷冻；

(2)将合成高分子材料聚乳酸溶解于氯仿中，超声分散30min，随后将溶液浇注于含有PLGA溶液的培养皿内，-80～-60℃梯度冷冻；

(3)将培养皿放入冷冻干燥器，冷冻干燥时间24h，得到引导组织再生膜。

上述引导组织再生膜为上下两层的复合膜结构；上层膜的孔径分布为30～60微米、连通率高于85％；下层膜的孔径分布为40～80微米，连通率高于92％。

由上述实施例1和对比例5对比可知，当不选用天然高分子材料时，虽然也可以形成梯度结构的孔结构，但由于合成高分子材料的局限性，其生物相容性必然是比较差的。

然后将实施例和对比例进行性能测试，结果如下：

从上表可以看出：使用本发明的方法制备的多层孔结构的复合梯度膜材料，孔结构可控(孔径：40-110微米；孔隙率：75-87％；连通性：89-93％)，具有优良的机械性能(为对照组的10-20倍)；优异的生物特性(高于90％细胞存活率)，因此具有很好的生物医用潜力。

图1是本发明实施例的上下两层的复合膜结构的示意图，图2、5、6、7是实施例1的产品界面SEM图；其中，图5是大孔面的图，图6是小孔面的图。平均孔径60微米，孔隙率64％，连通率100％(其中大孔层的孔径分布为70-150微米，连通率100％，小孔层孔径分布2-10微米，连通率100％)；图3是实施例2的产品界面SEM图；图4是实施例3的产品界面SEM图。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现，因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。