阅读说明：本技术 一种增强等离子体生物效应的方法 (Method for enhancing plasma biological effect ) 是由 许德晖 王帅 许宇静 崔庆杰 孔刚玉 于 2019-08-19 设计创作，主要内容包括：一种增强等离子体生物效应的方法,向包含癌细胞培养液的24孔板里中加入含有NO<Sub>2</Sub><Sup>-</Sup>或NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>的盐类进行预处理,用大气冷等离子体射流24孔板,距离24孔板底部距离1.5cm,处理24孔板中的癌细胞30s～90s,大气冷等离子体会和NO<Sub>2</Sub><Sup>-</Sup>或NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>协同作用,产生更多的ONOO<Sup>-</Sup>,从而达到增强大气冷等离子体的生物效应；本发明在不改变一般等离子体放电参数的情况下,利用NO<Sub>2</Sub><Sup>-</Sup>或NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>增强大气压冷等离子体生物效应,不会产生副作用,并且有很好的实际效果。(A method for enhancing plasma biological effect comprises adding NO to 24-well plate containing cancer cell culture solution 2 ‑ Or NO 3 ‑ Pretreating salt by using an atmospheric cold plasma jet 24-hole plate with the distance of 1.5cm from the bottom of the 24-hole plate to treat cancer cells in the 24-hole plate for 30-90 s, wherein the atmospheric cold plasma and NO are generated 2 ‑ Or NO 3 ‑ Synergistic effect to produce more ONOO ‑ Thereby achieving the biological effect of enhancing the atmospheric cold plasma; the invention utilizes NO without changing the discharge parameters of the general plasma 2 ‑ Or NO 3 ‑ The biological effect of the atmospheric pressure cold plasma is enhanced, no side effect is generated, and the actual effect is good.)

一种增强等离子体生物效应的方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及一种增强等离子体生物效应的方法。

背景技术

在物理学上，等离子体被定义为除固体、液体、气体外，物质存在的第四态，等离子态。根据等离子体的宏观温度，可将等离子体分为高温等离子体(10⁹K)和低温等离子体(<10³K)。低温等离子体中的非热平衡等离子体宏观温度接近于室温，且在大气压下就能产生，这类等离子体叫大气压冷等离子体。

大气压冷等离子体因其只需在大气压下就能产生，且气体温度低，粒子活性高，对人体没有伤害，近年来在学术界引起了广泛的关注，尤其是在生物医学领域上的应用越来越多。大气压冷等离子体的一系列的优点使得其在灭菌消毒、止血消炎、伤口愈合、皮肤病治疗以及肿瘤治疗等方面得到广泛应用并取得非常好的研究结果。

通常癌细胞增殖快，易转移，临床上常用外科手术、药物治疗和放疗等不同的治疗方法，病人病情复发以及对药物治疗产生抗药性是常见的问题，所以癌症成为一个致命的且难以治愈的疾病。研究发现，大气冷等离子体因为其含有丰富的活性粒子，可以选择性杀灭癌细胞，且不伤害正常细胞、增加肿瘤细胞药物敏感性、抑制肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的侵袭与迁移等，所以把等离子体作为一种新的手段应用到癌症的治疗上成为了一种热潮。等离子体产生的活性粒子主要是ROS，会进入细胞内引起一系列的反应，包括促使癌细胞DNA损伤，细胞周期的阻滞以及其它的氧化还原介导的应激，来诱导癌细胞的凋亡和抑制其增殖。但，等离子体作用于癌细胞的生物效应不高一直是一个问题。为了增强气体等离子体的生物效应，改变放电参数是最常用的方法，但增加放电功率将导致更高的损坏周围组织的可能性。所以需要寻求一种安全，且能增强大气压冷等离子体作用于癌细胞的生物效应的手段。

发明内容

为了克服上述现有的各种技术的不足,本发明提供一种增强等离子体生物效应的方法，在不改变一般等离子体放电参数的情况下，利用NO₂ ^-或NO₃ ^-增强大气压冷等离子体生物效应，不会产生副作用，并且有很好的实际效果。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种增强等离子体生物效应的方法，包括以下步骤：

步骤一、向包含癌细胞培养液的24孔板里中加入含有NO₂ ^-或NO₃ ^-的盐类进行预处理，加入量为10～1000μM，所述的盐类包括NaNO₂、NaNO₃、KNO₂或KNO₃；所述的培养液为RPMI-1640培养基，24孔板的每个孔含2*10⁵个癌细胞，每个孔有300ul培养液；

步骤二、用大气冷等离子体射流24孔板，距离24孔板底部1.5cm，处理步骤一24孔板中的癌细胞30s～90s，大气冷等离子体和NO₂ ^-或NO₃ ^-协同作用，产生更多的ONOO^-，从而达到增强大气冷等离子体的生物效应。

在步骤二中，采用氦气作为工作气体，气体流速为2slm，在10kHz/8kV的高压下产生氦等离子体。

本发明的优势在于，提供了一种新的策略，通过在不改变一般等离子体放电参数的情况下，在大气压冷等离子在处理癌细胞之前，加入含有NO₂ ^-，NO₃ ^-的盐类，例如NaNO₂和NaNO₃，来增强等离子体的生物效应。该发明，不会产生副作用，并且有很好的实际效果。

附图说明

图1是等离子体射流装置的结构示意图和氦等离子体的照片；

图2是不同浓度NaNO₂，NaNO₃对骨髓瘤LP-1细胞毒性检测折线示意图；

图3是不同浓度NaNO₂，NaNO₃对白血病Molm-13细胞毒性检测折线示意图；

图4是大气压冷等离子体和NaNO₂，NaNO₃对骨髓瘤LP-1细胞单独以及协同作用效果示意图；

图5是大气压冷等离子体和NaNO₂，NaNO₃对白血病Molm-13细胞单独以及协同作用效果示意图；

图6是大气压低温等离子体处理培养基，LP-1，Molm-13不同时间后ONOO^-浓度变化示意图；

图7是大气压冷等离子体和NaNO₂，NaNO₃对骨髓瘤LP-1细胞单独以及协同作用后ONOO^-浓度变化示意图；

图8是外源的ONOO-试剂剂量梯度对LP-1，Molm-13癌细胞活力的影响示意图；

图9是ONOO-抑制剂对等离子体灭活LP-1细胞的影响结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例一

参见图1，本实施例采用如图所示等离子体射流装置(该装置为现有技术)作为示范来产生大气压冷等离子体，采用氦气作为工作气体，气体流速为2slm，在10kHz/8kV的高压下产生氦等离子体。预处理好含LP-1细胞的四组24孔板，第一组作为对照，不加NaNO₂和等离子体不处理，第二组只加10μM剂量的NaNO₂，第三组只等离子体处理30s，第四组等离子体处理30s和加入10μM剂量的NaNO₂。比较四组最后的细胞活力以及其它数据结果，第四组10μM剂量的NaNO₂的加入增强了大气压冷等离子体对癌细胞的生物效应。

实施例二

参见图1，本实施例采用如图所示等离子体射流装置作为示范来产生大气压冷等离子体，采用氦气作为工作气体，气体流速为2slm，在10kHz/8kV的高压下产生氦等离子体。预处理好含LP-1细胞的四组24孔板，第一组作为对照不加NaNO₂和等离子体不处理，第二组只加50μM剂量的NaNO₂，第三组只等离子体处理30s，第四组等离子体处理30s和加入50μM剂量的NaNO₂。比较四组最后的细胞活力以及其它数据结果，50μM剂量的NaNO₂的加入增强了大气压冷等离子体对癌细胞的生物效应。

实施例三

参见图1，本实施例采用如图所示等离子体射流装置作为示范来产生大气压冷等离子体，采用氦气作为工作气体，气体流速为2slm，在10kHz/8kV的高压下产生氦等离子体。预处理好含Molm-13细胞的四组24孔板，第一组作为对照不加NaNO₃和等离子体不处理，第二组只加10μM剂量的NaNO₃，第三组只等离子体处理30s，第四组等离子体处理30s和加入10μM剂量的NaNO₃。比较四组最后的细胞活力以及其它数据结果，10μM剂量的NaNO₃的加入增强了大气压冷等离子体对癌细胞的生物效应。

本发明实施例一、二采用骨髓瘤LP-1，实施例三采用白血病Molm-13两癌细胞作为示范，作为实验的处理对象。图2，图3分别展示了不同浓度(0～1000μM浓度梯度)的NaNO₂，NaNO₃对这两种癌细胞的细胞毒性，细胞活力是在NaNO₂，NaNO₃作用24h和48h后检测的，由折线图可以看出，不同浓度的NaNO₂，NaNO₃对这两种癌细胞活力是没有影响的。

图4，图5分别展示了大气压冷等离子体和10μM，50μM NaNO₂，NaNO₃单独或者协同作用于两种癌细胞，细胞活力变化比较的柱状图。这里等离子体单独处理是30s，大气压冷等离子体和10μM，50μM NaNO₂，NaNO₃协同作用是在等离子体处理之前，向两种癌细胞分别加入10μM，50μM NaNO₂，NaNO₃检测结果。由图4可以得出，两种浓度的NO₂ ^-和NO₃ ^-都能够显著的增强氦等离子体降低骨髓瘤LP-1细胞活力的能力。图5的白血病Molm-13细胞有相似的结果。且可以得出50μM的NO2-，NO3-比10μM的NO2-，NO3-对氦等离子体降低癌细胞的活力有更大的增强效应。以上可以得出，提供更多的NO2-和NO3-可能与等离子体中的活性物质相互作用，诱导更多的细胞死亡。

因为ONOO-在等离子体诱导癌细胞凋亡中扮演重要的角色，该发明检测了大气压冷等离子体和NaNO₂，NaNO₃单独或者协同作用对其浓度的影响。图6展示了大气压低温等离子体以不同时间处理培养基，LP-1，Molm-13后6小时ONOO-浓度变化。可以看出，随着等离子体处理时间的延长，ONOO-水平均显著升高，然而10mM NAC能消除这个趋势。图7展示了大气压冷等离子体处理30s/60s和50μM的NaNO₂，NaNO₃对骨髓瘤LP-1细胞单独以及协同作用后ONOO-浓度变化。可以得出，无论是等离子体处理30s还是60s,大气压冷等离子体和NaNO₂，NaNO₃协同作用比等离子体单独作用产生更多的ONOO-。图8是外源的ONOO-试剂剂量梯度对LP-1，Molm-13癌细胞毒性的结果，ONOO-以剂量依赖性的方式降低细胞活力。图9是ONOO-抑制剂对等离子体灭活LP-1细胞的影响结果。结果显示等离子体处理30s和60s癌细胞活力明显下降，但加入ROS清除剂特别是ONOO-抑制剂时，癌细胞活力下降不明显。

综合以上，NO₂ ^-，NO₃ ^-能够增强大气压冷等离子体的生物效应，以达到更大程度的促使癌细胞凋亡或者抑制其增殖的目的。