阅读说明：本技术 提高豆科植物脂肪酸含量在促进其根瘤形成中的应用 (Application of increasing content of fatty acid in leguminous plants in promoting root nodule formation ) 是由 胡赞民 范成明 陈宇红 郭雪洁 郭徐鹏 赵敬会 陆明洋 傅永福 王晓波 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了提高豆科植物脂肪酸含量在促进其根瘤形成中的应用。本发明将来源于椭圆小球藻的CeDGAT1和CectGPDH2基因利用遗传转化的方法获得大豆转基因材料,研究发现所获得的转基因大豆在表型上未出现不良的农艺性状；同时发现CeDGAT1和CectGPDH2的转基因株系,其百粒重和种子中的总脂肪酸均提高；并且根瘤数提高40％以上；氮利用率显著提高。说明提高大豆脂肪酸含量,能够促进豆科植物的根瘤形成,进而提高豆科植物的氮利用率,实现豆科植物的增产,本发明这一发现可用于豆科植物的增产增收。因此我们的发明结果可用于通过基因工程或非基因工程提高豆科植物脂肪酸含量来促进豆科植物根瘤形成。(The invention provides an application of increasing the content of fatty acid in leguminous plants in promoting the formation of nodules of the leguminous plants. The invention obtains soybean transgenic material by utilizing a genetic transformation method for CeDGAT1 and CectGPDH2 genes derived from Chlorella ellipsoidea, and researches show that the obtained transgenic soybean does not have undesirable agronomic characters on phenotype; meanwhile, transgenic lines of CeDGAT1 and CectGPDH2 are found, and the hundred grain weight and the total fatty acid in seeds are increased; the number of the root nodules is increased by more than 40 percent; the nitrogen utilization rate is obviously improved. The invention shows that the soybean fatty acid content is increased, the nodule formation of leguminous plants can be promoted, the nitrogen utilization rate of the leguminous plants is further increased, and the yield of the leguminous plants is increased. Therefore, the invention result can be used for promoting the root nodule formation of the leguminous plants by increasing the fatty acid content of the leguminous plants through genetic engineering or non-genetic engineering.)

提高豆科植物脂肪酸含量在促进其根瘤形成中的应用

技术领域

本发明涉及豆科植物种质资源改良技术领域，具体地，涉及提高豆科植物脂肪酸含量在促进其根瘤形成中的应用。

背景技术

根瘤是根瘤菌与豆科植物互作诱发根系皮层细胞增生形成具有固氮作用的共生组织。根瘤组织可以将大气氮还原为氨并提供给其宿主植物，这是豆科植物加强氮利用的重要策略。由于根瘤可以提高豆科植物利用氮的效率，因此关于根瘤的形成机制是当今豆科植物的研究热点。目前认为根瘤的形成主要通过自控调节每个根上的根瘤数目、发育及功能，它依赖于硝酸盐诱导的长距离系统的信号调控途径。NIN-LIKE PROTEIN转录因子的发现为该途径提供了重要支持。KLV负调百脉根(Lotus japonicus)的根瘤形成。过表达GmINS1可以显著提高大豆根瘤的数目、大小。而对于植物的次生代谢与根瘤形成的关系未见相关报道。

二酰甘油O-酰基转移酶(DGAT，Diacylglycerol O-Acyltransferase)通过将一个酰基引入到二酰甘油(DAG)碳骨架上的最后一个碳位从而产生三酰甘油(TAG)，该酶为TAG组装的限速酶。它们的活性直接影响种子中油脂的合成及积累。由于对植物油脂需求日益增加，不同物种DGAT基因功能的研究相继开展。DGAT被认为是在TAG合成过程中起主要作用的酶，普遍存在于真核生物中。目前DGAT被分为四种类型：DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞质内DGAT3(CytoDGAT)，其中DGAT1是TAG合成的关键DGAT。不同物种的DGAT1同源基因相继被研究报道。在植物中异源或过表达DGAT1或其突变体，可以使植物种子中油脂积累提高11％-50％。

甘油-3-磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)催化合成的甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate，G3P)是合成三酰甘油(TAG)的重要原料，该酶参与了线粒体G3P穿梭，为呼吸链提供电子，是G3P合成的关键酶，也是连接糖代谢和脂代谢的关键酶之一，对植物体内油脂合成和能量代谢有重要作用。根据其亚细胞定位的不同，GPDH有三种类型胞质型(ctGPDH)，叶绿体型(cpGPDH)和线粒体型(mtGPDH)。将酵母ctGPDH转入油菜，转基因株系甘油含量是野生型的4倍，种子总脂肪酸含量提高40％，达到81.4±10mg/g鲜重，脂肪酸组成没有明显变化，并且成熟种子中蔗糖含量下降，但蛋白质含量并没有明显变化。

在过去人们认为植物提供给共生菌的为碳水化合物，以满足共生菌生长发育的需求。但在2017年，植物与共生菌的互作关系被改写，脂肪酸是植物提供给共生菌的有机碳源，以供真菌合成油脂所需。因此提高植物的脂肪酸含量利于共生菌的定植。根瘤菌作为豆科植物的共生菌，与其互作形成根瘤，而脂肪酸对根瘤菌的定植及根瘤的形成是否也具有重要的影响？TAG的积累是否对根瘤的形成有重要的作用呢？这些问题还不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供豆科植物脂肪酸在促进其根瘤形成中的应用。

本发明的另一目的是提供来自椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)的CeDGAT1或CectGPDH2基因的新用途。

本发明将来源于椭圆小球藻的CeDGAT1和CectGPDH2基因利用遗传转化的方法获得大豆转基因材料，研究发现所获得的转基因大豆在表型上未出现不良的农艺性状；同时发现CeDGAT1和CectGPDH2的转基因株系，其百粒重和种子中的总脂肪酸均提高；并且根瘤数提高40％以上；氮利用率显著提高。说明提高大豆脂肪酸含量，能够促进豆科植物的根瘤形成，进而提高豆科植物的氮利用率，实现豆科植物的增产。

具体地，本发明提供了脂肪酸在促进豆科植物根瘤形成或增加根瘤数中的应用。

所述脂肪酸包括总脂肪酸、C14:0、C16:0、C18:2和/或C18:3。

本发明提供了提高豆科植物脂肪酸含量在促进豆科植物根瘤形成或增加根瘤数中的应用。

本发明进一步提供了提高豆科植物脂肪酸含量在促进豆科植物氮利用率中的应用。

本发明进一步提供了提高豆科植物脂肪酸含量在提高豆科植物产量中的应用。

本领域技术人员可以采用任何方法提高豆科植物脂肪酸含量，优选利用基因工程的方法提高豆科植物脂肪酸含量。

在本发明的实施例中，是将来源于椭圆小球藻的CeDGAT1或CectGPDH2基因利用遗传转化的方法获得豆科植物转基因材料，

所述CeDGAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；

所述CectGPDH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明提供了能够提高豆科植物脂肪酸含量的基因的以下任一种应用，

(1)在促进豆科植物根瘤形成或增加根瘤数中的应用；

(2)在促进豆科植物氮利用率中的应用；

(3)在增加豆科植物百粒重中的应用；

(4)在提高豆科植物产量中的应用。

本领域技术人员可用现有的植物表达载体构建含有能够提高豆科植物脂肪酸含量的基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用能够提高豆科植物脂肪酸含量的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用上述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以开花时间为表型筛选转化植株。

在本发明的实施例中，选用了来源于椭圆小球藻的CeDGAT1和CectGPDH2基因作为能够提高豆科植物脂肪酸含量的基因。

所述CeDGAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；

所述CectGPDH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明提供了含有CeDGAT1或CectGPDH2基因的生物材料的以下任一种应用：

(1)在促进豆科植物根瘤形成或增加根瘤数中的应用；

(2)在促进豆科植物氮利用率中的应用；

(3)在增加豆科植物百粒重中的应用；

(4)在提高豆科植物产量中的应用；

所述CeDGAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；

所述CectGPDH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；

所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

本发明将来源于椭圆小球藻的CeDGAT1和CectGPDH2基因利用遗传转化的方法获得大豆转基因材料，研究发现所获得的转基因大豆在表型上未出现不良的农艺性状；同时发现CeDGAT1和CectGPDH2的转基因株系，百粒重分别提高12.24％-25.13％(参见图6的A)和8.10％-17.03％(参见图7的A)；种子中的总脂肪酸分别提高5.43％-20.97％(参见图6的B)和6.52％-15.01％(参见图7的B)；根瘤数分别提高44.12％-60.66％和40.69％-44.85％(参见图8的A)；氮利用率分别提高1.94-6.48％和4.48％-5.86％(参见图8的B)。CeDGAT1和CectGPDH2的都不会改变脂肪酸的组份，但都可显著提高C14:0、C18:2和C18:3含量(参见图6的C和图7的C)。说明提高大豆脂肪酸含量，能够促进豆科植物的根瘤形成，进而提高豆科植物的氮利用率，实现豆科植物的增产，本发明这一发现可用于豆科植物的增产增收。因此我们的发明结果可用于通过基因工程或非基因工程提高豆科植物脂肪酸含量来促进豆科植物根瘤形成。

附图说明

图1为CeDGAT1的入门载体。

图2为CectGPDH2的入门载体。

图3为pHZM06载体图谱。

图4为CeDGAT1的表达载体。

图5为CectGPDH2的表达载体。

图6为异源表达Ce DGAT1对大豆的影响，A为百粒重的变化，B为总体脂肪酸的变化，C为脂肪酸组份。*，在p<0.05水平上与野生型相比差异显著。**，在p<0.01水平上与野生型相比差异显著。

图7为异源表达CectGPDH2对大豆的影响，A为百粒重的变化，B为总体脂肪酸的变化，C为脂肪酸组份。*，在p<0.05水平上与野生型相比差异显著。**，在p<0.01水平上与野生型相比差异显著。

图8为异源表达CeDGAT1和CectGPDH2对大豆根瘤形成及固氮率的影响。A，对根瘤的数量的影响；B，大豆地上部的总含氮量。*，在p<0.05水平上与野生型相比差异显著。**，在p<0.01水平上与野生型相比差异显著。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例所用的生化试剂、材料均为市售。以下实施例中的实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1椭圆小球藻总RNA的提取

收集足量的椭圆小球藻细胞，迅速加入液氮，用研钵充分研磨后，取50-100mg的粉末，加入1mLTrizol(英潍捷基(上海)贸易有限公司)提取缓冲液，充分混匀后，静止10min；加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入一半体积的异丙醇，室温静止30-50min，13,500rpm离心10min，弃上清。加入75％的乙醇，悬浮沉淀，10,000rpm离心5min，弃上清；加入100％的乙醇，悬浮沉淀，10000rpm离心5min，弃上清；在超净工作台中吹干(大于3-5min)；加50μLDEPC水溶解。-80℃保存待用

实施例2 cDNA的合成

利用全式金公司的去DNA反转录试剂盒利用mRNA生产cDNA。其体系为5μg totalRNA，50mMOligo(dT18)，10μL 2×TS Reaction mix，1μL TransScript RT/RI Enzyme Mix，1μL gDNA Redmover，用RNase-free水补至20μL。轻轻混匀后，42℃孵育40-50min，85℃失活5min。-20℃保存待用。

实施例3 CeDGAT1和CectGPDH2基因的获得及表达载体的构建

根据转录组中cDNA序列，预测其完整的CDS，并翻译为氨基酸序列后，通过在NCBI蛋白数据库中比对，进一步确定CeDGAT1和CectGPDH2基因的完整性。以cDNA作为模板，设计上下游扩增引物(DGAT1F：5-agcaggctttgacttATGCCAGATGATGCCAGCATG-3,DGAT1R：5-tgggtctagagactttccGCTGCCATTTGCGAG-3；GPDH2F：5-agcaggctttgacttATGCGCTGGTCCAAGGTG-3,GPDH2R：5-tgggtctagagacttCCTCTCTTCTATTTGAGGCAGATTCATGA-3)，用高保真Taq酶(北京百灵克生物科技有限责任公司)分别扩增CeDGAT1和CectGPDH2基因。扩增程序为2min 98℃预变性，30s98℃，30s 60℃，2min 72℃，共35个循环。PCR产物纯化后，待用。

利用无缝克隆试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司)，将PCR产物连接到入门载体pGWCm(Chen et al.,2006,Journal/Analytical biochemistry,358:120-125)上，形成EN-CeDGAT1(参见图1)和EN-CectGPDH2(参见图2)，具体如下：1μL酶切后的pGWCm(100ng/μL，用AhdI酶切)，1μL PCR产物(80ng/μL)，2μL无缝克隆Mix，50℃50-60min；转大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定筛选阳性克隆，经测序确定CeDGAT1和CectGPDH2的序列分别为SEQ IDNO.1-2所示。进一步的，通过gateway体系(英潍捷基(上海)贸易有限公司)，将其构建到植物表达载体pHZM06(本实验室构建，该载体结构见图3)上，命名为06-CeDGAT1(参见图4)和06-CectGPDH2(参见图5)。将重组质粒转化于农杆菌GV3101中，经PCR鉴定后，待用。

实施例4 CeDGAT1和CectGPDH2基因的遗传转化及阳性转基因株系的筛选

大豆(天隆1号)的遗传转化采用农杆菌介导的子叶节法进行。步骤如下：将大豆种子用次氯酸钠消毒后，置于发芽培养基(Gamborg B5基本盐，20mg/L蔗糖，pH＝5.8，加入适量植物凝胶)上萌发；同时用YEP(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH＝7.0)将带有CeDGAT1和CectGPDH2质粒的农杆菌活化，并用共培养液体培养基[1/10Gamborg B5基本盐，加B5维生素，MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidhydrate)缓冲剂3.9g/L，激素及其他添加剂(6-苄氨基嘌呤1.6mg/L，赤霉素0.25ml/L，乙酰丁香酮0.04g/L，二硫苏糖醇150mg/L，L-半胱氨酸400mg/L)蔗糖浓度为30g/L，pH＝5.4)]重悬液稀释至OD600＝0.6；将大豆子叶切下放置于重悬液中，侵染30min，晾干后，放置于共培养固态培养基上；之后分别放在大豆诱导培养基(Gamborg B5基本盐，6-苄氨基嘌呤1.6mg/L加入20g/L蔗糖溶液和3m M MES，适量植物凝胶，pH＝5.6。加入150mg/L头孢噻肟，50mg/L特美汀进行抑菌处理)、大豆伸长培养基[加入适量的MS基本盐和B5维生素预混液，3mMMES，其他激素和添加剂(1ml/L天冬氨酸、1ml/L谷氨酸、300μg/L IAA、1mg/L玉米素核苷、500μg/L赤霉素)，加入蔗糖20mg/L，加入适量植物凝胶pH＝5.6，加入150mg/L头孢噻肟，50mg/L特美汀进行抑菌处理]和大豆根系再生培养基(加入适量的MS基本盐和Gamborg B5维生素，加入3m M MES及1ml/L天冬氨酸和1ml/L谷氨酸加入适量琼脂调节pH＝5.6，加入150mg/L头孢噻肟，50mg/L特美汀进行抑菌处理)上培养，并将其在含有Bastar抗性培养基上诱导成苗。并通过PCR鉴定后(PCR反应条件)，将T0代阳性苗移植于营养钵中培养，待成熟后收种子；之后将通过喷施浓度(0.3％)的Bastar(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)对转基因株系进行筛选纯合，至T3代。备用于后续实验分析。

实施例5转CeDGAT1和CectGPDH2基因的种子中脂肪酸成份分析

收集转基因大豆的种子，37℃将其烘干后充分研磨，称取0.05g，加入3mL 7.5％KOH-CH3OH(已加入C17:0标准品作为内参)，70℃水浴3-5h，中间颠倒混匀几次。加入2mLHCl-CH3OH(V/V，1:1)溶液，2mL 14％BF3-CH3OH溶液，70℃水浴1.5h。加入1mL0.9％NaCl和4mL正己烷，充分振荡混匀，4,000rpm离心8min，将上层有机相转移至一新管中。氮气吹干，300μL乙酸乙酯溶解。该实验每次每个样品平行做两份，共重复3次。

严格按照TurboMass(PerkinElmer公司)操作规程，开启GC/MS仪器设备。GC参数设置如下：色谱柱为BPX-70，30m×0.25mm×0.25μm；柱箱温度设置为梯度升温(100℃，保持1min；15℃/min升至190℃，保持1min；10℃/min，升至220℃，保持4min)。载气是氦气，流量为1mL/min。取1μL样品进行GC-MS检测，根据气相色谱分析结果，不同脂肪酸所对应的峰面积与C17:0内标峰面积作比较来计算出各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量。

从实验结果来看，转CeDGAT1和CectGPDH2大豆的种子中的脂肪酸组成没有发生变化，但总含量发生了显著的变化，与野生型相比，转基因种子中的总脂肪酸分别提高5.43％-20.97％(参见图6的B)和6.52％-15.01％(参见图7的B)。转CeDGAT1大豆中，C14:0、C16:0、C18:2和C18:3脂肪酸含量显著提高(参见图6的C)。转CectGPDH2大豆中，C14:0、C16:0、C18:2和C18:3脂肪酸含量显著提高(参见图7的C)。

实施例6转CeDGAT1和CectGPDH2基因的种子千粒重分析

收集大豆种子，37℃将其烘干后，统计100粒种子的质量，每个株系重复3次。

从实验结果来看，转CeDGAT1和CectGPDH2基因可以使大豆的百粒重显著增加，比野生型分别增加12.24％-25.13％(参见图6的A)和8.10％-17.03％(参见图7的A)。

实施例7转CeDGAT1和CectGPDH2基因对根瘤的影响

将种子萌发4-5天后，种植于温室(16小时光照，8小时黑暗)中；将根瘤菌HH103用TY培养基(5g/L胰蛋白胨,3g酵母提取物，1.3g CaC1₂.2H₂O)培养至OD600＝1.0；与B&D培养液(1000μM CaCl₂·2H₂0，500μM KH₂P0₄，10μM Fe-Citrate，250μM MgSO₄·7H₂0，1500μMK₂SO₄，500μM，1μM MnSO₄·H₂0，2μM H₃BO₄，0.5μM ZnSO₄·7H₂0，0.2μM CuSO₄·5H₂0，0.1μMCoSO₄·7H₂0，0.1μM Na₂MoO₄·2H₂0，)混合，浇入大豆的根中，待15天后观察统计。发现转CeDGAT1和CectGPDH2基因大豆的根瘤数目比野生型分别提高44.12％-60.66％和40.69％-44.85％(参见图8的A)。

实施例8转CeDGAT1和CectGPDH2基因对植物体内氮含量的影响

每个转基因株系取10株，通过105℃杀青30min，80℃烘干至恒重。将样品分别粉碎混匀后，利用凯氏定氮法测定全氮含量(Kjeldahl,1883,Journal/Zeitschrift füranalytische Chemie,22:366-383)，3次重复。通过测定植物体内的全氮，发现转CeDGAT1和CectGPDH2基因株系体内的氮含量分别比野生型提高1.94％-6.48％和4.48％-5.86％(参见图8的B)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 提高豆科植物脂肪酸含量在促进其根瘤形成中的应用

<130> KHP191113763.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccagatg atgccagcat gagccagcga gtcgagtatg agggggaggc ccagcctgac 60

cggacgcatg tggcaaaatg cggctatctc ttcaaatacc gcccctacaa gttcaccaag 120

acgtgggacc tgcgctactt tgagctcaag ggcaaagtac tggagtacta tttgtcgcag 180

aagcaggggg caaaccaccc caggggtctg gtcaaaatag agggttgcgt ggtggaaatc 240

gaaggccgca aaaagagtcg gttctgggtg ttcagcgtgg tggacccgtc aggcctcaat 300

ctgctgcgca tgtcttctga aagcgaaaag gaggtggaga catgggttca ggccttagta 360

gaggcgggat gtacaaagcg ctaccttaag gagtgcttta gggcacgctc ccctctgcgc 420

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cagtctgtgc tggatcaccg gtgggctggc tcagaggagt ccgcagtgac tgggctggag 540

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ggccccatgc ctcgtagcat gaccaagcgc cacagcgaca tgcgcggcag cacccagcta 720

tacactgaga gccgccctag catcctctcc acagagcgat tcgccttcac acagcactca 780

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ctgggcattg agaagctggg cgccaaacgg ctggccctgg agcgcaaggc cagcatggcg 1020

aagcgcaagc gggacatgcg gccggtggag gcgcggcgca aggccgccca gatggcagcc 1080

cgaagcgagt gcctgctgct cagcctgcac ctggccaacc tgtccgccgt gctggtgctg 1140

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aaggtggact acccggacaa cctgacgctg cgcaacctgg cacacttcct ggtggtgccg 1440

gccctggtgt accagaccac cttccccacc agcaagagat tccgagggcg ctacatcata 1500

tggaatgtgg tgcaccttct ggttgccatg ggggtgctga tgatcatcac ggagcagtac 1560

atggccccca ccatcaagac cagcgtggcc cccctgcgcg agctccaggt ggcgggcatt 1620

gtggagcgct tgttgaagct ggccgttcct actttgtacg gctggctcat catcttctac 1680

gccctgttcc acgtgtggct caacatcctg gccgagatca cgtacttcgg ggaccgcgag 1740

ttctacaagg actggtggaa tgccgcgacg attggggact actggcggct gtggaatgtg 1800

ccggtccaca agtggctgct gcggcatgtg tactacccct gcatacgcag gagggttccg 1860

aagacggttg cggcagtggc ggtgttcttc gtgagtgccg tgttccacga gatgctggtg 1920

ggagtgccgc tgcacatggt gcgcttctgg gcattctggg gcctcatgtt ccaggtgcct 1980

ctgctgttct tgactgacta catcaagaag cgagccaata gcaaccagat aggcaactac 2040

gtgttttggt ttacgtttgt catctttggt cagccgatgg caatcatgct gtactatcat 2100

gactggaaga agatgcatcc tgggctcgca aatggcagct ag 2142

<210> 2

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgctggt ccaaggtgtt caagaagaac ggggagaggg ggacctccgc gctggaccgc 60

gcgcagaagg tggtggtgtt tggcgggggg tccttcggga ctgccatggg ggttgctctg 120

gctcgccaga aggccgatct gcagatcacc ctgctgctga gggaccctta cgtctgcaac 180

gacattaaca cccgtcacgt caacacgcgc tacatgaagg attatgtgct gccgagcaac 240

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gccaaggagg tcatggagaa gcagcccacc ggctttgtgg cagcctctaa ggatgcaggg 540

ctggccaggg agatgcagga gctgtttgcc agcccctaca tgcgcatcaa caacacctcc 600

gacgtcacgg gcgtggagat ctgtggggcc ctgaagaacg tgctggcaat agcagccggc 660

atcgtggagg gactcaatct ggggaacaac gccatggcgg cactcgtcac ccagggctgt 720

gcagagatcc ggtggctggc agagaagatg ggggcgaagt cggccacggt ggcaggcctg 780

tccggtctgg gcgacatcat gctcacctgc tatggcagcc tgtccaggaa caggtctgtg 840

ggggtgcggc tgggccaggg tgagcagctg cacacaattt tggcaagcag caagcaagtg 900

gccgagggcg tgagcacggc aggcgtggtc gtcagtctgg ccagaaagta tcgagtgaag 960

ttgcctgttc tgactgccgt cgcacacatc ctggactcca acctttcgcc caggcatgct 1020

gttgcggaaa tcatgaatct gcctcaaata gaagagaggt ga 1062

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaggcttt gacttatgcc agatgatgcc agcatg 36

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggtctaga gactttccgc tgccatttgc gag 33

<210> 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaggcttt gacttatgcg ctggtccaag gtg 33

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggtctaga gacttcctct cttctatttg aggcagattc atga 44