一种测定多花梾木耐涝能力的方法
阅读说明：本技术 一种测定多花梾木耐涝能力的方法 (method for measuring waterlogging tolerance of cornus floribunda ) 是由 张文煊 周余华 王莹 孙杰 周雨 王红梅 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定多花梾木耐涝能力的方法,试验经过淹水延续天数的变化,记录以及测定多花梾木叶片颜色形态、色差、叶绿素、荧光参数,发掘多花梾木耐水湿能力的临界值,有利于充分了解淹水对多花梾木光合作用的影响过程和作用机理,并且该研究结果为多花梾木耐涝机理研究奠定了理论基础,对科学合理地制定苗期抗涝对策具有一定的现实意义,也为多花梾木实地推广应用提供理论依据。(The invention discloses a method for determining waterlogging tolerance of cornus floribunda, which is characterized in that the change of the number of days of the test after the waterlogging lasts, the color form, the color difference, the chlorophyll and the fluorescence parameters of leaves of the cornus floribunda are recorded and determined, the critical value of the water-moisture tolerance of the cornus floribunda is found, the influence process and the action mechanism of the waterlogging on the photosynthesis of the cornus floribunda are favorably and fully known, the research result lays a theoretical foundation for the waterlogging tolerance mechanism research of the cornus floribunda, a certain practical significance is realized for scientifically and reasonably formulating waterlogging tolerance strategies in the seedling stage, and a theoretical basis is provided for the field popularization and application of the cornus floribunda.)
技术领域
本发明涉及农业领域中的一种方法，具体涉及一种测定多花梾木耐涝能力的方法。
背景技术
梁太波等在《水分胁迫对烤烟生理特性和光谱特征的影响》中研究了烤烟水分胁迫和复水对生理特性和光谱特征的影响，调查了叶片叶绿素和可溶性蛋白质、光合速率和蒸腾速率、干物质积累量、叶片膜质过氧化程度、光谱反射率，将光谱特征作为诊断烤烟水分胁迫程度的重要手段。
朱向涛等在《淹水胁迫下江南牡丹生长及光合特性研究》中为建立牡丹的耐涝评价体系，采用模拟涝害的方式对其进行涝害胁迫，通过测定相对电导率、叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)和过氧化氢酶(POD)活性等指标的变化研究胁迫下牡丹生理生化变化情况，并以各项指标的耐涝系数为衡量指标进行主成分分析。
许楠等在《淹水胁迫对乡土风箱果和引种紫叶风箱果光合特性的影响》中对乡土风箱果和引种紫叶风箱果进行淹水胁迫，测定对叶片光合特性的影响，测定叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)、非光化学淬灭(NPQ)、过剩光能(1-qP)/NPQ。
王义强等在《淹水胁迫下银杏主要生化指标的变化》中指出3年生的银杏幼树经过淹水处理后，测定不同时间银杏叶片内主要生化指标——丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(PRO)、可溶性糖以及超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化。
所以，目前的现有技术含有很多缺点：1.不能即刻从植物形态上马上判定植物的受淹程度；2.测定效率不高；3.程序较复杂；4.测定成本很高；5.测定时有些药剂有剧毒，属于控制药剂，测定时难以获取。
发明内容
发明目的：本发明的目的是公开了一种测定多花梾木耐涝能力的方法，可以快速测定多花梾木的受淹情况，发掘多花梾木耐水湿能力的临界值。
技术方案：本发明提供了一种测定多花梾木耐涝能力的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对多花梾木进行淹水处理，水位超出土壤表面5cm，持续至植株叶片掉光；
(2)肉眼观察叶片颜色、使用分光测色仪测定多花梾木的叶片色差、光谱分析仪测定多花梾木的叶绿素含量或荧光仪测定多花梾木的叶绿素荧光；
(3)根据多花梾木的叶片颜色、叶片色差、叶绿素含量和叶绿素荧光4个指标进行定级分级以及得分：
(4)计算4个指标的总得分，按照分值判断多花梾木受淹程度，进而判断多花梾木耐涝能力。
使用分光测色仪测定叶片色差包括以下步骤：
(1)获取新鲜的叶片样品；
(2)使用分光测色仪测定植株中部固定叶片的叶色，第一次测出的数据作为标准色，之后的数据则为对比色，比较出每次试验叶片的色差值，研究叶色的变化。
使用光谱分析仪测定叶绿素含量包括以下步骤：
(1)获取新鲜的叶片样品；
(2)选取叶片中部，使用光谱分析仪检测叶绿素含量从而计算光合速率。
使用荧光仪测定叶绿素荧光包括以下步骤：
(1)获取新鲜的叶片样品；
(2)采用荧光仪测定叶片的叶绿素，先用叶夹夹在待测叶片进行暗处理，然后进行测定。
步骤(3)中指标定级分级以及得分标准如下：
(Ⅰ)叶片颜色
A级：正常生长的绿色或墨绿色叶片，得0分；
B级：叶片边缘稍稍发红，得1分；
C级：叶片橘黄色，得2分；
D级：叶片红褐色，得3分；
E级：叶片枯黄凋落，得4分；
(Ⅱ)叶片色差
A级：总色差△Eab＝0，得0分；
B级：0＜总色差△Eab≤5，得1分；
C级：22＜总色差△Eab≤25或5＜总色差△Eab≤15，得2分；
D级：15＜总色差△Eab≤20，得3分；
E级：20＜总色差△Eab≤22，得4分；
(Ⅲ)叶绿素含量
A级：5.9≤R800/R700≤6.2或2.7≤R800/R640≤2.8，得0分；
B级：5.6≤R800/R700＜5.9或2.8＜R800/R640≤3.0，得1分；
C级：4.9≤R800/R700＜5.6或2.6≤R800/R640＜2.7，得2分；
D级：3.7≤R800/R700＜4.9或2.1≤R800/R640＜2.6，得3分；
E级：1.0≤R800/R700＜3.7或1.0≤R800/R640＜2.1，得4分；
(Ⅳ)叶绿素荧光
A级：0.7≤Fv/Fm≤0.8，得0分；
B级：0.6≤Fv/Fm＜0.7，得1分；
C级：0.5≤Fv/Fm＜0.6，得2分；
D级：0.3≤Fv/Fm＜0.5，得3分；
E级：0.2≤Fv/Fm＜0.3，得4分；
计算(Ⅰ)-(Ⅳ)的总得分，总得分13-16为严重淹水程度，耐涝性差；9-12为中度淹水程度，耐涝性中等；1-8为轻微淹水程度，耐涝性较好；0为未淹水，耐涝性良好。
有益效果：本发明所述的方法与现有方法相比具有如下优点：1.能从植物形态上马上判定植物的受淹程度；2.测定效率高；3.程序简单；4.测定成本降低；5.可以测定含有有毒药剂的叶片。
附图说明
图1是淹水下叶片颜色的变化图；
图2是淹水下叶片色差变化图(△L是黑白色差：△L为正，说明测试样比标准样浅(偏白)△L为负，说明测试样比标准样深(偏黑)、△a是红绿色差：△a为正，说明测试样比标准样红(偏红)△a为负，说明测试样比标准样绿(偏绿)、△b是黄蓝色差：△b为正，说明测试样比标准样黄(偏黄)△b为负，说明测试样比标准样蓝(偏蓝)、△Eab是总色差)；
图3是淹水下光谱测定的叶绿素含量变化图(R800/R700、R800/R640是与叶绿素含量呈正相关的参数)；
图4是淹水下的叶绿素荧光变化图(F0是初始荧光、Fm是最大荧光、Fv是可变荧光)；
图5是淹水下的叶绿素荧光变化图(Fo/Fm是PSI的潜在活性、Fv/Fm是暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学效率、Fv/Fo是PSⅡ的潜在活性)。
具体实施方式
实施例1
1材料与方法
1.1材料
准备植株生长旺盛、高度长势一致的二年生多花梾木(Cornus florida L.)实生苗60株作为试验材料，每株4-5个分枝，20株为一组，共3个重复，移至带托盘的花盆中(花盆直径22cm、高19cm)进行淹水试验。在第一次处理前，需要维持多花梾木的正常生长。试验区位于通风、透光的开阔场地，设置雨棚，防止雨水对试验造成影响
1.2处理方法
从2018年10月2日开始进行淹水试验，在空盆底用塑料袋兜住，将盆栽苗置于空花盆里，向塑料袋里灌水并使水位超出盆栽苗面5cm，并定期续水，保证5cm的淹水深度。从每组中固定5盆用于指标测定，选取生长点下第3～5片叶进行相关指标的测定，做标记，且每次均对测定叶片进行拍照来录叶片形态颜色。采用单因子完全随机设计方法对多花梾木叶片进行采样，采样时选用植株中部叶片，将采集的叶片快速放置于有冰块的保鲜箱内，并迅速送到超低温冰箱内保存，用于测定渗透调节物质和丙二醛的含量，样品袋上需做好相应的标记。从处理开始后起，测定时间定在中午12点，每隔5d一次，直到植株叶片掉光无法采样为止，当天测定的数据及时保存在电脑中，及时导出，并做好备份工作。
1.3淹水对叶片颜色的影响
多花梾木在淹水条件下，随着试验次数的增加，植株叶片的色彩表现为由绿色变成红褐色直至枯萎凋零。
图1表现出，随着多花梾木淹水的延长，叶片的颜色呈现出明显的色彩变化。由图可以看出在10月2日到10月7日期间叶色变化不大，只是叶子边缘稍稍发红，在10月7日到10月29日期间变化明显，由最初的墨绿色变成橘黄色，而10月12日到10月17日则至红褐色，10月23日叶子枯黄凋落。
实施例2
叶片色差测定
使用分光测色仪(CM-700d/600d)测定植株中部固定叶片的叶色，第一次测出的数据作为标准色，之后的数据则为对比色，比较出每次试验叶片的色差值，通过△L、△a、△b、△Eab等指标来研究叶色的变化。
L、a、b色能够感知并测量任何颜色，亦可以利用△L、△a、△b和△Eab来对标准样与测试样的色差进行表示，△Eab代表的是总色差，可以作为一个指标用于色差的评定，它的值越大，说明叶片的色差越大，反之亦然，则表示叶片的色差越小。
图2表明：淹水对△a的影响很大，并且变化波动剧烈。△a的值始终大于0，表明随淹水天数的增加，多花梾木的叶片逐渐变红。10月12日时变化最为明显。在10月23日之前淹水条件对多花梾木的影响较大，在10月23日后，△a变化趋于平缓。淹水对△L、△b的作用较小，在10月23日之后变化幅度变弱，且值一直为负，这就表明叶片色彩偏黑和偏蓝。同时随淹水时间的延长，多花梾木叶片的总色差△Eab变化很显著，除在10月17日时下降，总体呈上升的趋势，至10月23日后△Eab趋于平稳，与第一次测定相比上升了6.3倍。于是说明，淹水对多花梾木叶片色彩影响十分明显。
实施例3
光谱测定
用光谱分析仪(Unispec-SC)测定植株中部叶片光合速率，同时采集新鲜叶片样品供各项生理指标测定。开机后在页面按1Preference，将Halogen source intensity调成100，在DISK里新建文件夹后选择Enable auto saving，移动光标点击OK，然后夹住白板按2Data scan，确认曲线最高值在4.5～6.5之间，按8将Shutter open变为Shutter closed，将白板取下，按4Dark scan进行暗反应，按8将Shutter closed变为Shutter open，夹白板按5Reference Scan，夹住叶片，光孔对着叶子表面按2Data scan后测出数据。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，所以植物叶片光合作用的强弱状态可以通过叶绿素含量的变化体现。
参数R800/R700、R800/R640的值与叶绿素含量呈正相关，如图3显示在整个试验过程中，叶绿素含量是呈下降趋势的。R800/R700与R800/R640现了明显下降的趋势，R800/R700最后一次相比较第一次下降了60％。而R800/R640变化幅度更大一点，总体下降了79％。说明伴随着淹水的加剧，叶片叶绿素的含量是在不断下降的，说明淹水在很大程度上降低了植物叶片光合作用强度。
实施例4
荧光参数测定
采用荧光仪(Handy PEA)测定叶片的叶绿素，先用叶夹夹在待测叶片进行20min暗处理，按Measure后按ok进行测定，再按ok进行保存数据。
叶绿素荧光参数是一组用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数值，通过研究叶绿素荧光，从而得到植物光合作用与环境的关系。
当PSⅡ反应中心在完全开放的状态下的荧光产量，称作为初始荧光Fo，亦称为基础荧光；而当PSⅡ反应中心在完全关闭的状态下的荧光产量，可以称为最大荧光Fm。
如图4显示，10月2日至10月7日，F0上升了1.9％，FV上升了8.8％，10月7日至10月17日,Fo下降了73.2％，Fv下降了88.3％，10月17日至10月23日，Fo上升了37.6％，Fv上升了119.8％，10月23日至10月29日期间再次下降，总体上Fo下降了73.2％，FV下降了74.5％。随着淹水时间的延长，Fv除10月12日时数据上升外总体呈下降趋势，27d下降了46.4％。随着天数的增加，供试叶片的Fo、Fm值呈现波动下降的趋势。
Fv/Fm是暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率[11]。如图5显示，10月2日时，为0.73。随着淹水时间延长，Fv/Fm值总体下降，趋于0，与第一次测定比降低了70.9％，Fo/Fm值总体呈上升趋势，升高了1.93倍。这些数据表明，在淹水情况下，PSⅡ反应中心受到了比较严重的破坏，且植株叶片光能转换效率以及光合性能受到了淹水的抑制，叶片逐渐失活。
综上所述，随着淹水的加剧，每次试验后叶片与第一次叶片颜色变化越来越大，由绿色变成红褐色直至枯萎凋零，得分从0升至4。用分光测色仪检测叶片色差，色差值也有明显的变化。叶片叶绿素呈现下降趋势，淹水降低了植物叶片光合作用强度。叶片的初始荧光和最大荧光值先上升后下降，Fv/Fm、Fv/Fo的值均呈降低的趋势，表明淹水的环境条件对植株影响显著，对光合作用过程有抑制作用，对多花梾木体内能量的积累也有影响。多花梾木在10天内耐涝性较好，总得分为8分，属于轻微淹水程度，随着实验时间的推移，受淹程度逐渐加剧。通过本方法，可以快速的检测确定多花梾木的受淹程度，对科学合理地制定苗期抗涝对策具有重要意义。