阅读说明：本技术 检测脂***甘露聚糖的组分及其试剂盒 (Component for detecting lipoarabinomannan and kit thereof ) 是由 盛盼龙 朱绍荣 于 2019-08-06 设计创作，主要内容包括：一种检测脂阿拉伯甘露聚糖的组分,其为SEQ ID No 1所示的多肽,或SEQ ID No2所示的多肽和SEQ ID No 3所示的多肽分别与SEQ ID No 1所示的多肽形成组合物,再与结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原共包被,实现结核分枝杆菌的检测。本发明采用脂阿拉伯甘露聚糖抗原和多肽(或组合物)共包被的方式,实现了对结核杆菌抗体的特异性检测,并具有较高的灵敏度,适合于体外检测。(A component for detecting the lipoarabinomannan is a polypeptide shown in SEQ ID No. 1, or a polypeptide shown in SEQ ID No2 and a polypeptide shown in SEQ ID No3 respectively form a composition with a polypeptide shown in SEQ ID No. 1, and then are coated with a lipoarabinomannan antigen of mycobacterium tuberculosis to realize the detection of the mycobacterium tuberculosis. The invention adopts the mode of coating the lipoarabinomannan antigen and the polypeptide (or the composition) together, realizes the specificity detection of the tubercle bacillus antibody, has higher sensitivity and is suitable for in vitro detection.)

检测脂***甘露聚糖的组分及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种多肽助剂，尤其涉及一种提高检测灵敏度和特异性的增敏剂，用于脂***甘露聚糖的检测，以及检测组合物和检测试剂盒。

背景技术

结核病是一种数千年来一直困扰人类的传染病，并且估计十九世纪欧洲1/4的成年人口死于结核病。由于二十世纪生活标准的改善以及抗生素的发现，到二十世纪五十年代，工业化国家已经几乎根除了结核病。然而，作为复发的传染病，结核病仍然是猖獗的。在当下，估计在世界人口中三个人中有一个感染结核杆菌(tubercle bacillus)(潜伏的结核病)。据说世界上新发作的结核病患者的总数有九百四十万，并且估计其中有两百万名患者死于该病。目前，大约95％的活动性结核病(active tuberculosis)患者生活在发展中国家，99％的死于结核病的人集中在发展中国家。

LAM抗原结核杆菌通过独特的细胞壁结构在属主体内生存、繁殖。其结核杆菌细胞壁含有多种成分，如：孔蛋白(Porin)，多糖，脂类(Lipids)，霉菌酸(mycolic acid),磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannosides，PIM)，脂甘露聚糖(lipomannans，LM)，脂***甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)。其中，LAM是分枝杆菌细胞壁的主要成分，达15毫克/g 细菌总重量。LAM广泛影响受感染的宿主的免疫系统。据报道，从结核分枝杆菌和麻风杆菌分离出的LAM能引起T细胞增殖抑制，干扰与干扰素介导的巨噬细胞激活，清除有毒的游离氧自由基，抑制蛋白激酶活性及基因编码介素(IL)-2和IL-5和粒细胞合成/巨噬细胞集落刺激人类T细胞因子，诱导巨噬细胞即刻早期基因表达，促进单核细胞肿瘤坏死因子的生成增强及补体活化。研究结果表明，作为属特异性抗原LAM，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，参与了结核杆菌感染的许多过程，有助于及时检测结核病发病(肺结核)以及其他分枝杆菌感染。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，通过酶联免疫检测仪对其吸光度进行检测，该方法既可以定性，也可以定量测定各种病原体的抗原、抗体，该技术在医学检验、科研、环境监测和食品安全等有着广泛的应用。

该类试剂常常以完整的试剂盒的方式提供，并且配套专门的酶联免疫检测仪，根据检测的吸光度值对结果进行判断，试剂中的所用的酶一般为辣根过氧化酶(HorseradishPeroxidase， HRP)，该酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP可用作过氧化物酶的底物，通过H₂O₂和鲁米诺系统，在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下，发出荧光来。因此在临床诊断上应用最广泛。

该类试剂盒的性能指标通常包括：分析灵敏度、临床灵敏度、特异性、精密性、准确度、线性范围和稳定性等。只有同时满足上述指标的综合要求，才能通过注册上市申请，取得上市销售许可证。

酶联免疫试剂盒通常包含以下部件：酶联免疫发光板、包被抗原(抗体)、酶标抗体和发光底物。其制备过程包括以下流程：将包被抗原(抗体)包被到酶联免疫检测板上；所用发光酶标记到抗体上。

在试剂盒的制备过程中，抗原或抗体包被到酶联免疫发光板上的操作步骤对试剂盒的灵敏度有重要影响，通常要增加试纸盒的灵敏度，工程师会选择两种主要解决方案，一种是增加包被浓度，另一种是增加标记物浓度。在大部分情况下，这两种解决方案可以有效提高试纸条的灵敏度。但是在某些情况下，通过这两种技术方案难以实现提高灵敏度的目标。为满足试剂盒的性能指标要求，必须采取其他的技术手段实现提高灵敏度，才能实现开发目标。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测增敏剂。

本发明的另一个目的在于提供一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测组合物。

本发明的再一个目的在于提供一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测试剂盒。

本发明的又一个目的在于提供一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测预处理方法，通过样本预处理，脂***甘露聚糖抗原与多肽组合物联合包被，用于对结核分枝杆菌检测的高灵敏度和高特异性。

在本发明中，术语“脂***甘露聚糖”、“脂***甘露聚糖抗原”或“本发明抗原”可互换使用，指来源于结核分枝杆菌的、构成细胞壁的聚糖。脂***甘露聚糖抗原可用常规方法进行制备、分离和纯化，分子量通常大于37KD。

一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测组分，其为SEQ ID No 1所示的多肽，多肽与脂***甘露聚糖抗原共同包被，用于提高脂***甘露聚糖抗体检测的灵敏度和特异性。

本发明的结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测组分，还加入SEQ ID No 2所示的多肽和SEQ ID No 3所示的多肽，与SEQ ID No 1所示的多肽形成组合物，SEQ ID No 1所示的多肽、SEQ ID No 2所示的多肽和SEQ ID No 3所示的多肽按摩尔比3:2～5:3。

在检测反应板上，结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗原的包被量为0.5μg/孔～2μg/ 孔，更佳的如：1μg/孔。

在检测反应板上，多肽的包被量为0.5μg/孔～1μg/孔。如：SEQ ID No 1所示的多肽的包被量为0.5μg/孔～1μg/孔，另如：SEQ ID No 1所示的多肽与SEQ ID No 2所示的多肽的包被量为0.5μg/孔～1μg/孔；再如：SEQ ID No 1所示的多肽与SEQ ID No 3 所示的多肽的包被量为0.5μg/孔～1μg/孔

一种待测样本预处理的方法，样本处理液为酸性溶液，如：高氯酸、盐酸、稀硝酸、稀硫酸和三氟醋酸等，对待测样本进行处理，并控制待测样本的最终pH值为 6.0～8.0。

一种结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗体检测试剂盒，包括样本处理液、结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗原、组分和样本稀释液，结核分枝杆菌脂***甘露聚糖抗原和组分共包被于检测板上。

样本稀释液中加入阻断剂，如：购自菲鹏生物股份有限公司型号为HIER-E-014、HIER-R-001、HIER-M-004、HIER-M-005和HIER-E-001等，浓度10μg/ml～100μg/ml 为宜，优先选择HIER-E-001。

本发明的试剂盒，还包括包被板、酶结合物工作液，底物显色液A、底物显色液 B、洗涤液、阴阳性对照和终止液。

酶结合物工作液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、辣根过氧化物酶保护剂2.0g/L、小牛血清500ml/L、山羊血清500ml/L、硫柳汞1g/L和抗 -TB-HRP适量。

阳性对照：Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、乙二醇150ml/L、阴性血清250ml/L、硫柳汞1g/L和阳性血清。

阴性对照：Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、乙二醇150ml/L；硫柳汞1g/L和阴性血清250ml/L。

洗涤液：NaCl 160g/L；Na₂HPO₄.12H₂O 58g/L；KCl 4g/L；KH₂PO₄ 4g/L和Tween-2010ml/L。

底物显色液A：柠檬酸8g/L、8-羟基喹啉0.004g/L、冰醋酸2.4ml/L和过氧化尿素0.7g/L。

底物显色液B：柠檬酸2.1g/L、乙二胺四乙酸二钠0.38g/L和TMB 0.4g/L。

终止液：浓硫酸110ml/L。

样本稀释液：Tris Base 2.4g/L、NaCl 17.8g/L、酪蛋白钠5g/L、牛血清白蛋白2g/L、吐温-20 1ml/L、曲拉通X-100 2ml/L、山羊血清50ml/L、硫柳汞0.4g/L和阻断剂。

经验证，本发明的方案，通过脂***甘露聚糖抗原是结核杆菌特异性的且经预处理后适合酶联免疫法的抗原。

本发明的方案，采用脂***甘露聚糖抗原和多肽(或组合物)共包被的方式，实现了对结核杆菌抗体的特异性检测，并具有较高的灵敏度，适合于体外检测。

本发明的方案，还将血清样本的预处理方法，应用于脂***甘露聚糖抗原和多肽(或组合物)联合包被的酶联免疫法检测结核分枝杆菌的方法中，巧妙地利用了LAM 抗原的脂多糖化学特征，通过对血清样本预处理和多肽(或组合物)的使用，成功地检测出样本中脂***甘露聚糖抗原的抗体。与现有的结核分枝杆菌检测方法相比，本发明的方案，在简便性、快速性、灵敏度和/或特异性等方面均有显著提高。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1预处理样本

取1ml阳性样本，分装与10个离心管中，每管100ul，在每个离心管中加入适量上述样本处理液，使其pH为1～2。由于蛋白质的变性，产生的混合物呈乳白色。使变性的蛋白质在高速离心机中13,000转离心5分钟，弃去上层75μl的澄清液体，用2M 的碳酸钾溶液调整pH至6.0～8.0。将样品冷却至4℃，冷却30分钟，增加析出率，待分析前将溶液放回室温(25℃)，备用。

实施例2脂***甘露聚糖的制备

脂***甘露聚糖可通过商业化途径够得(如：杭州华葵金配生物科技有限公司)，或自行制取(参见：CN2010105436856)。

实施例3制备包被反应板

配制包被液：取200mL试剂瓶，加入羧甲基纤维素钠母液0.5mL，加入Tris-HCL 母液10mL，加入海藻糖母液10mL，补加纯水至100g。

取15mL离心管，用上述包被稀释液根据适合的浓度对脂***甘露聚糖抗原和多肽(SEQ ID No 1所示的多肽，或SEQ ID No 1所示的多肽、SEQ ID No 2所示的多肽和 SEQID No 3所示的多肽按摩尔比为3:2～5:3组合物)进行稀释，配制为合适浓度的包被混合液，取酶联免疫发光板，每孔125μl，2℃～8℃过夜；用洗涤液洗涤2次；用5％BSA 封闭液封闭酶标板，每孔220μl，2℃～8℃过夜；吸干反应孔内封闭液，真空干燥3小时，备用。

实施例4检测

将处理过的样本用样本稀释液(含阻断剂)进行稀释，制备为检测液，在检测反应板加样孔中分别加入100μl检测液，阳性对照品和阴性对照品，设置空白孔，加入 100μl样本稀释液，等待30分钟后，用洗涤液洗涤5次，加入酶标抗体150μl，反应30分钟，洗涤5次，加入发光底物各50μl，用酶联免疫发光仪进行测定，读数，记录检测结果。其中，

Cutoff值计算：COV＝阴性对照平均值+0.12。

标本OD值≥COV为阳性，标本OD值＜COV为阴性。

阴性对照OD值低于0.06作0.06计算，高于0.06按实际OD值计算。

同一检测对象的样品，还用常规的斑点渗滤法进行对照测试，结果详见表1。

表1

表中，N.A.表示该项数据未能取得。

通过结果表明，本实施例的方案与常见的斑点渗滤法相比，对痰检阳性的结核病人具有更高的阳性检出率。同时对健康成人的血清进行检测，具有更低的假阳性结果出现。同时对丙肝阳性病人、乙肝阳性病人、梅毒阳性病人的血清样本进行检测表明，本实施例的方案与常见的斑点渗滤法相比特异性更高。

因此，采用本实施例提供的方案对结核分枝杆菌的检测具有更高的灵敏度和更高的特异性。

序列表

<110> 上海荣盛生物药业有限公司

<120> 检测脂***甘露聚糖检测的组分及其试剂盒

<141> 2019-08-06

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg His Trp Arg Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Trp Gly Trp Ser Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Trp His Trp Arg Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly