阅读说明：本技术 口腔磷状细胞癌标志物及其应用 (oral cavity phosphorus cell cancer marker and application thereof ) 是由 不公告发明人 于 2018-06-06 设计创作，主要内容包括：本申请提出了口腔磷状细胞癌标志物及其应用,更具体地,本申请提出了检测唾液外泌体中标志物试剂的试剂盒,检测口腔外泌体标志物的试剂在制备试剂盒中的用途以及检测分析系统。该试剂盒用于下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案,并且,所述试剂盒包括：检测唾液外泌体中标志物的试剂,所述标志物包括POSTN。POSTN蛋白可作为磷状细胞癌的生物标志物。(The application provides an oral cavity phosphorus cell cancer marker and application thereof, and more particularly provides a kit for detecting a marker reagent in a saliva exosome, application of the reagent for detecting the oral cavity exosome marker in preparation of the kit and a detection analysis system. The kit is for use in at least one of: detecting squamous cell carcinoma; determining the stage of squamous cell carcinoma in the subject; determining the efficacy of treatment of a patient with squamous cell carcinoma; and determining a treatment regimen for squamous cell carcinoma, and wherein the kit comprises: a reagent for detecting a marker in a saliva exosome, the marker comprising POSTN. The POSTN protein can be used as a biomarker of phosphorus cell cancer.)

口腔磷状细胞癌标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及口腔磷状细胞癌标志物及其应用，更具体地，本发明涉及包括检测唾液外泌体中标志物试剂的试剂盒，检测口腔外泌体标志物的试剂在制备试剂盒中的用途以及检测分析系统。

背景技术

口腔磷状细胞癌(OSCC)是一种普遍的口腔和上颌组织恶性肿瘤。口腔磷状细胞癌易于***转移。

外泌体是人体体液中的小泡。外泌体的直径大小为30～120nm，功能为长距离运输各种物质。

然而，如何快速筛查出口腔磷状细胞癌患者，如何筛查出口腔磷状细胞癌易转移患者，是对口腔磷状细胞癌进行积极预防、治疗，以及确认适合治疗方案的关键问题所在。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：

发明人对20位口腔磷状细胞瘤患者的唾液外泌体进行了蛋白筛查，这20位口腔磷状细胞瘤患者中有10位是转移型口腔磷状细胞癌，10位是非转移型磷状细胞癌，另外，发明人征集了10位没有口腔磷状细胞癌的健康患者作为对照，这30位受试者在年龄、性别上相仿。发明人意外地发现，在口腔磷状细胞癌患者的唾液外泌体中高表达POSTN，而在健康人的唾液外泌体中基本没有POSTN的表达；另外发明人发现，在转移型磷状细胞癌患者中POSTN的表达量显著高于非转移型磷状细胞癌患者。同时，发明人进行了唾液外泌体中蛋白表达谱分析，发现，另外两种蛋白TNC和TGFBI在患者与健康者中具有与POSTN相似的表达差异。

基于上述发现，在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案，并且，所述试剂盒包括：检测唾液外泌体中标志物的试剂，所述标志物包括POSTN。如前所述，POSTN蛋白可作为磷状细胞癌的生物标志物。如前所述，发明人发现，唾液外泌体中POSTN的表达量在健康者和磷状细胞癌患者中有显著差异，非转移型磷状细胞癌患者和转移型鳞状细胞癌患者中的唾液外泌体中POSTN的表达量也具有显著差异，因此利用根据本发明实施例的试剂盒检测唾液外泌体中POSTN的表达量，可有效、准确地检测鳞状细胞癌、确定受试者鳞状细胞癌的阶段；如果鳞状细胞癌患者接受某种治疗，那么利用根据本发明实施例的试剂盒，也可确定鳞状细胞癌患者的治疗效果以及确定鳞状细胞癌的最佳治疗方案。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述鳞状细胞癌为口腔鳞状细胞癌，并且所述试剂盒进一步包括用于分离唾液外泌体的试剂。根据本发明的具体实施例，所述试剂为10％聚乙二醇溶液。利用根据本发明实施例的试剂盒，可高效分离唾液外泌体，获得的外泌体纯度高而不破坏外泌体中有效成分，进而进一步检测唾液外泌体中POSTN的表达量，POSTN的定量的准确度进一步提高，对口腔鳞状细胞癌的检测准确性也进一步提高。

根据本发明的实施例，所述标志物进一步包括选自TNC和TGFBI的至少一种。如上所述，发明人发现，外泌体中TNC、TGFBI和POSTN在正常人体内和癌症患者体内的表达量变化趋势具有一致性，因此利用本发明实施例的试剂盒进一步检测TNC和TGFBI的至少一种，可进一步提高检测磷状细胞癌的灵敏度和准确度。

根据本发明的实施例，所述检测标志物的试剂适于通过蛋白质印迹法、酶联免疫法、飞行时间质谱法的至少之一检测所述标志物。利用根据本发明实施例的上述方法可有效定量或半定量所述标志物的表达量或相对表达量，进而利用本发明实施例的试剂盒检测磷状细胞癌的准确度和灵敏度进一步提高。

在本发明的第二方面，本方明提出了检测口腔外泌体标志物的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述口腔外泌体标志物包括POSTN，所述试剂盒用于下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的患病阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案。需要说明的是，本申请所述的检测磷状细胞癌既可以指检测到实际正在患有磷状细胞癌，也可指检测健康人是否有口腔鳞状细胞癌的发生风险，又可指其它治疗方案实施后，有无复发磷状细胞癌的风险。根据本发明的实施例，利用检测口腔外泌体标志物POSTN的试剂检测POSTN的表达水平，进而根据标志物是否表达或表达的高低，确定患者是否患有磷状细胞癌、是否有患有磷状细胞癌的风险、是否有复发磷状细胞癌的风险、确定磷状细胞癌的患病阶段、确定磷状细胞癌的治疗效果以及确定磷状细胞癌的治疗方案。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测分析系统。根据本发明的实施例，所述系统用于选自下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案，并且，所述检测分析系统包括：检测装置，所述检测装置用于确定受试者唾液外泌体中标志物的含量，所述标志物包括选自POSTN、TNC和TGFBI的至少一种，可选地所述受试者经历过治疗或者候选治疗方案处理；分析装置，所述分析装置与所述检测装置相连，并且适于基于所述标志物的含量确定：所述受试者是否罹患鳞状细胞癌；所述受试者鳞状细胞癌的患病阶段；所述鳞状细胞癌患者的治疗效果；所述鳞状细胞癌的治疗方案。利用根据本发明实施例的检测分析系统，可有效检测磷状细胞癌，包括检测受试者是否患有鳞状细胞癌、是否处于鳞状细胞癌转移阶段、处于第几转移阶段，如果接受了治疗，治疗效果如何以及治疗方案是否有效。根据本发明实施例的检测鳞状细胞癌的检测分析系统的检测准确度高且灵敏度高。

根据本发明的实施例，上述检测分析系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述检测分析系统进一步包括唾液外泌体分离装置，用于从所述受试者的唾液分离外泌体。进而检测装置利用唾液外泌体分离装置分离的外泌体，确定唾液外泌体中标志物的含量。

根据本发明的实施例，所述检测装置进一步包括下列单元的至少之一：蛋白质印迹单元；酶联免疫分析单元；以及飞行时间质谱分析单元。利用上述单元的至少之一，可实现标志物含量的定量或半定量，进而对标志物的定量更加准确，可信度更高。

根据本发明的实施例，所述分析装置包括：比较单元，所述比较单元用于将所述受试者的所述标志物的含量与下列的至少之一进行比较：第一预定阈值，所述第一预定阈值是基于已知未罹患鳞状细胞癌个体的唾液外泌体中标志物含量确定的；第二预定阈值，所述第二预定阈值是基于已知鳞状细胞癌处于转移阶段个体的唾液外泌体中标志物含量确定的；所述治疗前的所述患者的唾液外泌体中标志物含量；未经历所述治疗方案的对照的唾液外泌体中标志物含量；确定单元，所述确定单元与所述比较单元相连用于基于所述比较单元确定下列的至少之一：所述受试者是否罹患鳞状细胞癌，其中，所述受试者的所述标志物的含量高于所述第一阈值，是所述受试者罹患鳞状细胞癌的指示；所述受试者鳞状细胞癌的患病阶段，其中，所述受试者的所述标志物的含量高于所述第二阈值，是鳞状细胞癌处于转移阶段的指示；所述鳞状细胞癌患者的治疗效果，其中，所述受试者的所述标志物的含量不高于所述治疗前的所述患者的唾液外泌体中标志物含量，是所述治疗有效的指示；所述鳞状细胞癌的治疗方案，其中，选择具有改变所述受试者所述标志物含量能力的候选治疗方案作为最终方案。利用根据本发明实施例的上述分析装置，可有效确定受试者是否罹患鳞状细胞癌、受试者鳞状细胞癌的患病阶段、鳞状细胞癌患者的治疗效果或鳞状细胞癌的治疗方案。

附图说明

图1是根据本发明实施例的检测分析系统的结构示意图；

图2是根据本发明实施例的检测分析系统的结构示意图；

图3是根据本发明实施例的分析装置的结构示意图；

图4是根据本发明实施例的转移型口腔鳞状细胞癌患者、非转移型口腔鳞状细胞癌患者和健康对照组唾液外泌体的图片以及提取到外泌体的实验验证结果；

图5是根据本发明实施例的转移型口腔鳞状细胞癌患者与非转移型口腔鳞状细胞癌患者唾液外泌体蛋白比较结果图；以及

图6是根据本发明实施例的利用Western印迹法检测POSTN、TNC和TGFBI在健康对照组、非转移型口腔鳞状细胞癌患者、转移型口腔鳞状细胞癌患者表达量的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

试剂盒

在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒用于下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案，并且，所述试剂盒包括：检测唾液外泌体中标志物的试剂，所述标志物包括POSTN。发明人在实验中意外地发现，POSTN蛋白在磷状细胞癌患者的唾液外泌体中高水平表达，但在健康人的唾液外泌体中不表达，并且转移型磷状细胞癌患者的唾液外泌体中POSTN蛋白的表达高于非转移型磷状细胞癌患者。因此，POSTN蛋白可作为磷状细胞癌的生物标志物和确定磷状细胞癌是否转移的指示。利用根据本发明实施例的试剂盒检测唾液外泌体中POSTN的表达量，可有效、准确地检测鳞状细胞癌、确定受试者鳞状细胞癌的阶段、确定鳞状细胞癌患者的治疗效果以及确定鳞状细胞癌的治疗方案。

根据本发明的具体实施例，所述鳞状细胞癌为口腔鳞状细胞癌，并且所述试剂盒进一步包括用于分离唾液外泌体的试剂，具体地，所述试剂为10％聚乙二醇溶液。利用根据本发明实施例的试剂盒，可高效分离唾液外泌体，进而进一步检测唾液外泌体中POSTN的表达量。利用根据本发明实施例的试剂盒对口腔磷状细胞癌进行检测，准确度进一步提高。

根据本发明的再一具体实施例，所述标志物进一步包括选自TNC和TGFBI的至少一种。发明人通过蛋白质谱分析发现，外泌体中TNC、TGFBI在正常人体内和癌症患者体内的表达量变化趋势与POSTN是一致的，利用本发明的试剂盒进一步检测TNC和TGFBI的至少一种，可进一步提高检测磷状细胞癌的灵敏度和准确度。

所述检测标志物的试剂适于的检测手段不受特别限制，只要能够定量或半定量标志物的表达量或相对表达量。根据本发明的具体实施例，所述检测标志物的试剂适于通过蛋白质印迹法、酶联免疫法、飞行时间质谱法的至少之一检测所述标志物。利用根据本发明实施例的上述方法可有效定量或半定量所述标志物的表达量或相对表达量，进而利用本发明实施例的试剂盒检测磷状细胞癌的准确度和灵敏度进一步提高。

用途

在本发明的第二方面，本方明提出了检测口腔外泌体标志物的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述口腔外泌体标志物包括POSTN，所述试剂盒用于下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的患病阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案。本申请所述的检测磷状细胞癌既可以指检测到实际正在患有磷状细胞癌，也可指检测健康人是否有口腔鳞状细胞癌的发生风险，又可指其它治疗方案实施后，有无复发磷状细胞癌的风险。根据本发明的实施例，利用检测口腔外泌体标志物POSTN的试剂，根据标志物的表达水平，检测患者是否患有磷状细胞癌、是否有患有磷状细胞癌的风险、是否有复发磷状细胞癌的风险、确定磷状细胞癌的患病阶段、确定磷状细胞癌的治疗效果以及确定磷状细胞癌的治疗方案。

如无特别说明，本申请所述的检测口腔外泌体标志物的试剂包括能够特异性识别口腔外泌体标志物的试剂，如抗体、探针等，所述试剂适用于蛋白质印迹法、酶联免疫法、飞行时间质谱法等，进而可有效探测到标志物的表达量或相对表达量。

检测系统

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测分析系统。根据本发明的实施例，所述系统用于选自下列的至少之一：检测鳞状细胞癌；确定受试者鳞状细胞癌的阶段；确定鳞状细胞癌患者的治疗效果；以及确定鳞状细胞癌的治疗方案，并且，所述检测分析系统包括，参考图1：检测装置100，所述检测装置100用于确定受试者唾液外泌体中标志物的含量，所述标志物包括选自POSTN、TNC和TGFBI的至少一种，可选地所述受试者经历过治疗或者候选治疗方案处理；分析装置200，所述分析装置200与所述检测装置100相连，并且适于基于所述标志物的含量确定：所述受试者是否罹患鳞状细胞癌；所述受试者鳞状细胞癌的患病阶段；所述鳞状细胞癌患者的治疗效果；所述鳞状细胞癌的治疗方案。利用根据本发明实施例的检测分析系统，可有效检测磷状细胞癌，检测准确度高且灵敏度高。

根据本发明的再一具体实施例，参考图2，所述检测分析系统进一步包括唾液外泌体分离装置300，用于从所述受试者的唾液分离外泌体。进而检测装置100利用唾液外泌体分离装置300分离的外泌体，确定唾液外泌体中标志物的含量。

根据本发明的再一具体实施例，所述检测装置100进一步包括下列单元的至少之一：蛋白质免疫共沉淀单元；蛋白质印迹单元；酶联免疫分析单元；飞行时间质谱分析单元；以及蛋白测序单元。利用上述单元的至少之一，可实现标志物含量的定量或半定量，进而对标志物的定量更加准确，可信度更高。

根据本发明的再一具体实施例，参考图3，所述分析装置200包括：比较单元210，所述比较单元210用于将所述受试者的所述标志物的含量与下列的至少之一进行比较：第一预定阈值，所述第一预定阈值是基于已知未罹患鳞状细胞癌个体的唾液外泌体中标志物含量确定的；第二预定阈值，所述第二预定阈值是基于已知鳞状细胞癌处于转移阶段个体的唾液外泌体中标志物含量确定的；所述治疗前的所述患者的唾液外泌体中标志物含量；未经历所述治疗方案的对照的唾液外泌体中标志物含量；确定单元220，所述确定单元220与所述比较单元210相连，用于基于所述比较单元210确定下列的至少之一：所述受试者是否罹患鳞状细胞癌，其中，所述受试者的所述标志物的含量高于所述第一阈值，是所述受试者罹患鳞状细胞癌的指示；所述受试者鳞状细胞癌的患病阶段，其中，所述受试者的所述标志物的含量高于所述第二阈值，是鳞状细胞癌处于转移阶段的指示；所述鳞状细胞癌患者的治疗效果，其中，所述受试者的所述标志物的含量不高于所述治疗前的所述患者的唾液外泌体中标志物含量，是所述治疗有效的指示；所述鳞状细胞癌的治疗方案，其中，选择具有改变所述受试者所述标志物含量能力的候选治疗方案作为最终方案。利用根据本发明实施例的上述分析装置，可有效确定受试者是否罹患鳞状细胞癌、受试者鳞状细胞癌的患病阶段、鳞状细胞癌患者的治疗效果或鳞状细胞癌的治疗方案。

检测鳞状细胞癌的方法

在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测鳞状细胞癌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)确定受试者唾液外泌体中标志物的含量，所述标志物包括POSTN；(2)基于步骤(1)中所述标志物的含量，确定所述受试者罹患鳞状细胞癌的风险。利用上述方法，可有效确定所述受试者罹患鳞状细胞癌的风险。

需要说明的是本申请所述的“含量”应做广义理解，既可指定量结果，也可指半定量结果，既可指绝对含量，也可指相对含量。另外，本申请所述的“确定所述受试者罹患鳞状细胞癌的风险”既可以包括已经患有癌症，也包括有可能已经患有癌症。

根据本发明的具体实施例，所述鳞状细胞癌为口腔鳞状细胞癌。

根据本发明的再一具体实施例，上述方法还可以进一步包括通过下列步骤分离所述受试者唾液外泌体：(1)冻存唾液样品放置在室温水浴至完全溶化，溶化后样品放置在4℃或者冰浴上保存；(2)样品2000g离心10分钟，取上清至2新管；(3)取1mL上清，加入0.5mL分离液A；(4)用旋涡振荡器混匀至成为均项；(5)4℃冰箱孵育1小时；(6)4℃离心，10000g，1小时；(7)吸走上清，保留底部沉淀物；(8)4℃离心，10000g，5分钟；(9)吸走上清，保留底部沉淀物；(10)加入100μL分离液B重悬沉淀，用旋涡振荡器或者用移液器混匀；(11)分装保存样本，4℃一周或者冰冻保存更长时间。发明人发现，分离液A10％聚乙二醇溶液为分离唾液外泌体的关键试剂，可高效分离唾液外泌体而不破坏外泌体中的活性成分，B是PBS。利用根据本发明实施例的上述方法，能够高效分离唾液外泌体，所得唾液外泌体的活性成分不损失，进而对唾液外泌体中标志物的含量的检测更加准确和可靠。

根据本发明的具体实施例，所述标志物进一步包括选自TNC和TGFBI的至少一种。发明人在实验中发现，TNC和TGFBI在口腔磷状细胞癌患者的唾液外泌体中高表达，且在转移磷状细胞癌患者唾液外泌体中的表达高于非转移磷状细胞癌。利用发明实施例的检测方法进一步检测TNC和TGFBI的含量的变化，基于POSTN、TNC和TGFBI的含量来确定受试者罹患鳞状细胞癌的风险的准确度会进一步提高。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，通过蛋白质印迹法、酶联免疫法、飞行时间质谱法的至少之一检测所述标志物。

根据本发明的具体实施例，所述蛋白质印迹法可通过如下方式实现对唾液外泌体标志物的检测：提取唾液外泌体总蛋白，总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之后，进一步从聚丙烯酰胺凝胶上转移到PVDF膜上。将转印有蛋白质的PVDF膜与标志物的特异性抗体(以下简称“一抗”)温育。标志物的量越多，与之结合的一抗也就越多。洗去游离的一抗，用带有可检测标记的二抗(以下简称“二抗”)，进一步与PVDF膜温育，使一抗与二抗结合。洗去游离二抗，通过检测与一抗结合的二抗的量，可定性判断标志物的量，即标志物量越多，检测到的二抗的信号越强。

根据本发明的具体实施例，所述酶联免疫法可通过如下方式实现对唾液外泌体标志物的检测：提取唾液外泌体总蛋白，通过温育的方法使标志物蛋白与固相载体结合(如40孔聚苯乙烯凹孔板)。进一步使用一抗温育，使标志物蛋白与一抗结合。洗去游离一抗。加入酶标记二抗，使一抗与酶标记二抗结合。洗去游离酶标记二抗。加入酶反应底物，适时终止反应。通过检测酶反应产物的量，可定性及定量判断标志物的量。即标志物量越多，检测到的酶反应产物的量越多。

根据本发明的具体实施例，所述飞行时间质谱法可通过如下方式实现对唾液外泌体标志物的检测：提取唾液外泌体总蛋白，制备样品。样品经飞行时间质谱仪分析，可获得谱图。通过分析谱图，可定性及定量分析标志物蛋白的含量。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，进一步包括：将所述受试者唾液外泌体中标志物的含量与预定阈值进行比较，其中，所述标志物的含量高于第一预定阈值，是所述受试者罹患鳞状细胞癌的指示。根据本发明的具体实施例，所述第一预定阈值是基于已知未罹患鳞状细胞癌个体的唾液外泌体中标志物含量确定的。根据本发明的再一具体实施例，所述第一预定阈值是基于多个已知未罹患鳞状细胞癌个体的唾液外泌体中标志物含量进行统计分析确定的。

其中，所述第一预定阈值是基于所采用的测定标志物含量的方法确定的。根据本发明的一具体实施例，在利用蛋白质印迹方法确定所述受试者唾液外泌体中标志物POSTN的含量时，由于未罹患鳞状细胞癌个体的唾液外泌体中标志物含量是零，所以只要检测到受试者唾液外泌体中标志物POSTN有表达，则是所述受试者罹患鳞状细胞癌的指示。

确定受试者鳞状细胞癌的患病阶段的方法

在本发明的第五方面，本发明提出了一种确定受试者鳞状细胞癌的患病阶段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)确定受试者唾液外泌体中标志物的含量，所述标志物包括POSTN；(2)基于步骤(1)中所述标志物的含量，确定所述受试者的患病阶段。

具体的，上述提出的确定受试者鳞状细胞癌的患病阶段的方法中，所述鳞状细胞癌为口腔鳞状细胞癌。可选地，所述标志物进一步包括选自TNC和TGFBI的至少一种。可选地，在步骤(2)中，通过蛋白质印迹法、酶联免疫法、飞行时间质谱法的至少之一检测所述标志物。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，进一步包括：将所述受试者唾液外泌体中标志物的含量与预定阈值进行比较，其中，所述标志物的含量高于所述第二预定阈值，是所述受试者鳞状细胞癌处于转移阶段的指示。根据本发明的具体实施例，所述预定阈值是基于已知罹患鳞状细胞癌处于转移阶段个体的唾液外泌体中标志物含量确定的或基于多个已知鳞状细胞癌处于转移阶段个体的唾液外泌体中标志物含量进行统计分析确定的。

确定鳞状细胞癌患者治疗效果的方法

在本发明的第六方面，本发明提出了一种确定鳞状细胞癌患者治疗效果的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对来自经历治疗的患者唾液外泌体中标志物的含量，以便获得第一标志物含量，所述标志物包括选自POSTN、TNC和TGFBI的至少一种；将所述第一标志物含量与来自所述治疗前患者的样品所获得的第二标志物含量进行比较；基于所述比较结果，确定所述治疗的效果，其中，所述第一标志物含量不高于所述第二标志物含量是所述治疗有效的指示。利用根据本发明实施例的方法，可有效确定鳞状细胞癌患者治疗效果，进而为选择是继续之前的治疗方式还是改进或改变之前的治疗方式提供了必要的评价依据。

确定鳞状细胞癌的治疗方案的方法

在本发明的第七方面，本发明提出了一种确定鳞状细胞癌的治疗方案的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(a)对鳞状细胞癌患者进行候选治疗方案处理，并对经历所述候选治疗方案处理的的鳞状细胞癌患者的唾液外泌体标志物含量进行检测，所述标志物包括选自POSTN、TNC和TGFBI的至少一种；(b)基于步骤(a)中所得到的检测结果，确定所述候选治疗方案是否具有改变所述标志物含量的能力；(c)基于步骤(b)的结果，选择最终治疗方案。利用根据本发明实施例的确定鳞状细胞癌的治疗方案的方法，为准确鳞状细胞癌的最佳治疗方案提供了必要的技术依据。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本申请所用实验试剂、材料及实验方法如下所述：

唾液样品收集与制备

20名患者于2013～2014年招募自北京大学口腔医学院，其中10名口腔鳞状细胞癌患者已发生癌细胞转移，另外10名患者未发生癌细胞转移。发明人招募了10名未患口腔鳞状细胞癌的健康人作为对照。被选中的患者都是未经过治疗的刚刚确诊为口腔鳞状细胞癌的患者，患者与健康人对照组年龄、性别和系统性疾病情况相仿。早晨8:00至10:00取标本。在标本收集前，所有志愿者先休息10分钟。接着，所有志愿者漱口、端坐，用舌尖抵住舌下腺。这样，唾液分泌约5分钟，发明人收集大约2mL自然分泌的唾液。在这个过程中，志愿者不能说话。收集完后，所有的唾液样品置于冰上，离心(10,000rpm,10min,4℃)去除杂质和细胞碎片。收集后样品储存于-80℃。

本研究经北京大学生物医学伦理委员会批准。所有参与者都提供了书面认可。志愿者信息见表1。

表1：

外泌体分离与透射电镜

外泌体提取根据Invitrogen的使用手册操作(Total Exosome Isolation,catalog number:4484453)。外泌体悬液储存于-20℃以备后续研究使用。发明人使用电子显微镜观察提取物的外形与尺寸，以确认该提取物是外泌体。提取完后，外泌体重悬于1×PBS中。接着，5μL的部分样品放入碳涂层网格(等离子清洗机预处理；Ted Pella Inc.,CA,USA)。30秒后，用滤纸吸掉过量样品。2％醋酸铀染色1分钟。用FEI T12电子显微镜以120kV电压观察网格。显微图片由Gatanultrascan 4K X 4K成像。

Western印迹法检测外泌体膜特异性蛋白和转移型口腔鳞状细胞癌患者外泌体中特异性蛋白

根据使用手册说明步骤，用Invitrogen试剂(Total Exosome RNA and ProteinsIsolation Kit)分解外泌体，获得外泌体蛋白。提取得到的蛋白储存于-80℃以备进一步分析。外泌体蛋白经10％SDS-PAGE电泳并转移至硝化纤维膜。硝化纤维膜先经封闭处理，然后加入一抗(anti-βactin，cat.no.ab6275；anti-CD63，cat.no.ab8219；anti-periostin，cat.no.ab170874。以上所有一抗购自Abcam Inc.)，稀释液(用溶有脱脂奶粉的TBST溶液以1:1000稀释)。一抗与硝化纤维膜温育过夜。然后，用TBST洗3次硝化纤维膜。接着，硝化纤维膜与anti-IgG荧光抗体(与TBST/脱脂奶粉溶液以1:15,000混合均匀)温育1小时，之后洗膜。最后，硝化纤维膜成像分析，检测目标蛋白条带。

鸟枪质谱分析

将取自10位转移型口腔鳞状细胞癌患者、10位未转移型口腔鳞状细胞癌患者以及10位健康人的外泌体蛋白，用于鸟枪质谱分析。外泌体蛋白经10％SDS-PAGE电泳，样品凝胶条带分割成5-6份。用甲醇溶解凝胶，在LTQ OrbitrapVelos装置上点样。蛋白ID和原始丰度值由LC-MS/MS质谱得知。

数据分析

发明人在Uniprot网站上根据LC-MS/MS分析查询了原始数据。同时，在DAVID网站进行了GO分析。利用built-in decoy option在SwissProt数据库上针对人类条目进行查找。

申请人进行了上述的相关实验，所得到的实验结论如下所述：

电镜图片与膜蛋白鉴定

图4A、B和C显示了转移型口腔鳞状细胞癌患者(OCM)、非转移型口腔鳞状细胞癌患者(OUCM)和健康对照组(HC)唾液外泌体的图片。比例尺为200nm。外泌体直径为30—120nm，大部分形状近球形。双层脂膜可见。外泌体大小和形状无明显差异。由此可确定外泌体存在于唾液样本中。利用蛋白免疫印迹法，外泌体特异性蛋白CD63和看家基因β-actin用于检测囊泡膜特异性蛋白(图4D)。尽管三组之间有表达差异，但是都检测到CD63和β-actin，证明已经提取到外泌体。

健康对照组与口腔鳞状细胞癌患者的唾液外泌体蛋白

唾液外泌体的蛋白表达在已发生转移和未转移的口腔鳞状细胞癌患者之间，以及唾液外泌体的蛋白表达在口腔鳞状细胞癌患者与健康人之间有差异。健康对照组中检测到1151种蛋白，口腔鳞状细胞癌患者(包括已转移和未转移)中检测到1580种蛋白。其中，819种蛋白在口腔鳞状细胞癌患者组和健康对照组中都有表达。原始数据肽匹配图谱由系统数据库自动生成，这是两组蛋白之间有用的比较数据，主要显示一些蛋白的丰度。蛋白筛选标准如下：1.PSM比率大于2或小于0.5；2.独特肽(Unique peptides)大于2，且值大于10。通过上述筛选，发明人确认了口腔鳞状细胞癌患者与健康对照组之间有差异的233种蛋白和其编码基因(如表2所示)。

表2：

用DAVID数据库以GO分析方法在生化过程、分子功能和细胞组分层面分析了这233个基因。大多数高丰度的GO号都与外泌体结构、免疫反应和炎症相关。

比较转移型口腔鳞状细胞癌患者与非转移型口腔鳞状细胞癌患者唾液外泌体蛋白

用鸟枪质谱分析转移型口腔鳞状细胞癌患者与非转移型口腔鳞状细胞癌患者唾液外泌体蛋白。未转移组显示有1170个蛋白，已转移组显示1211个蛋白(图5A)。与筛选口腔鳞状细胞癌患者组和健康对照组的蛋白方法相同，在转移型和非转移型口腔鳞状细胞癌之间表达差异明显的有143个蛋白(如表2所示)，同时也对它们做了GO分析(图5B)。经过GO分析，一些高丰度组分，如细胞附着和生物附着相关的，与外泌体形成和迁移有关系。依据发明人的预测，与这些功能相关的基因富集是合理的。不过，急性炎症反应组分的高丰度值提醒发明人这是肿瘤样本。这些高丰度表达的基因不仅仅在非转移型口腔鳞状细胞癌患者中表达低，而且在健康对照组中的表达也很少甚至不表达。因此，发明人挑选了与细胞附着相关的periostin(POSTN,NCBI GENE ID:10631)，tenascin C(TNC,NCBI GENE ID:3371)，和transforming growth factor-β-induced protein(TGFBI,NCBI GENE ID:7045)作为目标蛋白(图5C)。POSTN和TNC在转移型口腔鳞状细胞癌患者中的表达比在非转移型口腔鳞状细胞癌患者中高约10倍(参见表2)。POSTN、TNC和TGFBI与癌症转移有关系。事实上，TNC和POSTN可能特异性地与口腔癌症转移相关。因此，发明人重点研究这3个蛋白。

利用Western印迹法检测选中的特异性蛋白

通过Western印迹法，在个体样本中检测POSTN、TNC和TGFBI。Western印迹法显示结果见图6。结果显示，POSTN和TGFBI的水平在健康对照组和非转移型口腔鳞状细胞癌患者中明显较低，而在转移型口腔鳞状细胞癌患者中最高。由于囊泡蛋白量太少，而TNC分子量太大(241kDa)，对TNC的Western印迹检测难度大。因此，发明人合并了样本以提高TNC的浓度。

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