阅读说明：本技术 尿液中低级别胶质瘤的蛋白标志物及其在早期诊断中的用途 (Protein marker of urine low-grade glioma and application of protein marker in early diagnosis ) 是由 季楠 张力伟 张扬 王燚 李春朝 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本申请涉及尿液中低级别胶质瘤的蛋白标志物及其在早期诊断中的用途。具体而言,本申请涉及选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于低级别胶质瘤早期诊断的试剂中的用途：胞外基质蛋白4(Matrilin-4)、透明质酸酶1(Hyaluronidase-1)及其组合。这两种蛋白对于低级别胶质瘤(少枝,星形)的早期诊断具有较好的临床应用前景。(The present application relates to protein markers of low-grade glioma in urine and their use in early diagnosis. In particular, the present application relates to the use of an agent for identifying a protein selected from the group consisting of: extracellular matrix protein 4(Matrilin-4), Hyaluronidase 1(Hyaluronidase-1), and combinations thereof. The two proteins have good clinical application prospect for early diagnosis of low-grade glioma (oligodendron and asteroid).)

尿液中低级别胶质瘤的蛋白标志物及其在早期诊断中的用途

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及尿液中低级别胶质瘤(少枝，星形)的蛋白标志物及其在早期诊断中的用途。

背景技术

***2013年最新年鉴表明，我国每年有超过30万患者死于脑部肿瘤。胶质瘤作为脑部最常见的原发性恶性肿瘤，占所有原发性脑恶性肿瘤的81％(2018年美国脑肿瘤登记中心报告，CBTRUS)[1]。

胶质瘤的恶性程度高，治疗效果差。经过标准的手术、放疗及化疗之后，胶质母细胞瘤患者中位生存期仅为14.6个月[2]。这不仅给患者身体造成巨大痛苦，而且给患者及其家属带来心理上的沉重负担。此外，胶质瘤本身对脑功能造成的损害以及手术治疗所导致的致残率也很高。因此该疾病给国家医疗资源以及社会保障体系带来很大的负担。

按肿瘤细胞的形态学划分，脑胶质瘤根据其肿瘤细胞形态学进行如下主要分类：星形细胞瘤、少枝细胞瘤、室管膜瘤、混合胶质瘤(例如少枝—星形细胞瘤)。按肿瘤细胞的恶性程度划分(例如，世界卫生组织WHO制定的分级系统)，将脑胶质瘤分为1级(恶性程度最低、预后最好)到4级(恶性程度最高、预后最差)：低级别胶质瘤(WHO 1-2级)；高级别胶质瘤(WHO 3-4级)。按肿瘤所处的位置划分，脑胶质瘤也分为：幕上胶质瘤、幕下胶质瘤、桥脑胶质瘤。

早期发现胶质瘤并及时手术治疗，能延长恶性胶质瘤患者生存预后，甚至能治愈部分患者，故胶质瘤早期诊断具有至关重要的作用。然而，胶质瘤起病隐匿，缺乏特异性早期症状，这导致发现时往往已是肿瘤病程后期，此时肿瘤较大，侵袭性强，手术治疗效果往往不佳。

利用各种组学方法在体液中筛选并鉴定胶质瘤早期诊断标志物是目前胶质瘤早诊研究常规策略[3]。

CN101298629A公开了LRRC4基因启动子区甲基化检测在脑胶质瘤诊断中的应用及其检测系统，脑组织特异性表达基因LRRC4是脑胶质瘤特异性甲基化异化基因，因此提示LRRC4基因启动子区甲基化检测可应用于胶质瘤的早期诊断。

CN101298629A所制备的试剂盒允许检测血浆LRRC4启动子区甲基化状态，对脑胶质瘤患者做出早期诊断。

CN103966337A公开血清外泌体来源的长链非编码RNAPRKAG2-AS1用于胶质瘤高危人群的筛查和早期诊断。PRKAG2-AS1表达水平下降，对胶质瘤早期诊断的特异性高。

CN107664696A公开了血清CCKBR作为神经胶质瘤诊断标志物方面的应用，尤其是对于神经胶质瘤的早期预警和早期诊断。

CN107664696A建立了一种基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断试剂盒，可以快速准确地进行CCKBR的检测。

CN104076151A涉及一种可用于胶质瘤早期诊断的试剂盒，该试剂盒包括鼠抗人B7-H4生物素标记单抗，对采集的脑脊液样本进行检测，通过检测脑脊液中的B7-H4的蛋白表达量，从而预测胶质瘤的患病风险，早期诊断胶质瘤患者。

然而，本领域的上述方法需对患者进行介入性操作，比如抽取血液，有些甚至需要穿刺以获取脑脊液。鉴于此，本领域仍需要便于操作(例如能无创地收集患者样本)且较好区分正常人和胶质瘤患者的早期蛋白标志物。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，提供了蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断低级别胶质瘤的试剂中的用途，其中所述的蛋白选自以下任一项或其组合：胞外基质蛋白4(Matrilin-4)、透明质酸酶1(Hyaluronidase-1)。

在具体的实施方案中，所述诊断是指低级别胶质瘤的早期诊断。

在本申请中，所述低级别胶质瘤选自：星形细胞瘤、少枝细胞瘤、或其组合。

在一些实施方案中，胞外基质蛋白4和透明质酸酶1可以组合使用，也可以单独使用。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中胞外基质蛋白4的表达水平升高和/或透明质酸酶1的表达水平降低，指示所述受试者患有低级别胶质瘤。此处的“患有”应当做最广泛地理解，包括：已经患有；或者在设定的显著水平处，患有所述疾病的概率统计学上显著高于健康对照。

在本申请上下文中，健康对照是指未患有(临床上诊断未患有)低级别胶质瘤的个体。

适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂或者抗体(或其抗原结合片段的形式)。

在一个具体的实施方案中，当采用质谱鉴定试剂时，使用非数据依赖性的采集方法和平行反应监测。非数据依赖性的采集方法将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。非数据依赖性的采集方法就像地毯式轰炸，无遗漏地打击全部目标。平行反应监测是一种基于二级质谱信号的靶标质谱定量分析技术，相较于传统的选择反应监测技术，不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息，节约实验设计和操作时间；且选择性更高，灵敏度更佳，重现性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。其相较于免疫方法，不再受制于商业化抗体，克服了基于免疫方法对抗体特异性和滴度的限制。平行反应监测技术能够同时对多种蛋白质进行定性和定量分析。应当理解，尽管具体示例中采用了特定的鉴定方式，但是本申请技术效果的实现并不依赖于特定的鉴定方式(例如质谱操作步骤、质谱仪型号、质谱方法中设定的参数、质谱鉴定中所识别的特定肽段序列、色谱柱型号；抗体供应商、抗体所靶向的特定表位、抗体分型、免疫学操作步骤和参数)，这是因为本申请技术方案的核心在于发现了胞外基质蛋白4和透明质酸酶1在尿液中的存在量与疾病之间的关系，因此任何能够确定蛋白含量的手段都是可用的。

标签肽是指能够代表某一个蛋白的肽段，其特征在于存在且特异性仅存在于某蛋白质氨基酸序列中。在一些实施方案中，本申请的鉴定试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向到这样的标签肽(胞外基质蛋白4和/或透明质酸酶1中的序列)。在另一些实施方案中，本申请的鉴定试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向蛋白的表位(胞外基质蛋白4和/或透明质酸酶1中表位，线性或非线性表位均适用)。

应当理解，尽管具体示例中基于特定的某段序列(例如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)对蛋白进行了鉴定和定量，但是这不意味着胞外基质蛋白4和透明质酸酶1中其它位置的肽片段不能使用，只要这样的片段能将不同的蛋白彼此区分开，就适用于本申请。在本申请的教导下，技术人员根据常规技术结合所用鉴定方法的操作要求，便可确定片段的位置或长度。

在具体的实施方案中，表达水平选自蛋白质水平。

在具体的实施方案中，表达水平是蛋白在受试者的尿液样本中表达水平。

在具体的实施方案中，所述受试者是人。

本申请的另一方面，提供了一种用于早期诊断低级别胶质瘤的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂：胞外基质蛋白4的鉴定试剂、透明质酸酶1的鉴定试剂、及其组合。

在具体的实施方案中，所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂。

在具体的实施方案中，所述诊断是低级别胶质瘤的早期诊断。

本申请的另一方面提供了一种用于诊断受试者中低级别胶质瘤的方法，包括步骤：

1)获得受试者的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，

3)确定受试者尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：胞外基质蛋白4、透明质酸酶1、及其组合。

在具体的实施方案中，使用质谱方法确定表达水平。

当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方案中，用胰蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。

在具体的实施方案中，所述质谱方法是数据非依赖采集模式或平行反应监控采集模式。具体地，数据非依赖检测方法将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。平行反应监测技术通过蛋白质的标签肽段，采集标签肽段对应母离子的所有的子离子。根据子离子的信号强度来进行定量。

基于尿液上述两种蛋白的定量检测方法，可以结合标准品用其进行人群中这两种蛋白基线的建立，可以基于正常对照组的含量范围，对低级别胶质瘤患者进行早期诊断。

附图说明

图1A和图1B数据非依赖采集模式下蛋白组区分低级别胶质瘤和正常对照组的PCA图(图1A)和OPLS-DA图(图1B)。

图2A和图2B显示数据非依赖检测胞外基质蛋白4(图2A)、透明质酸酶1(图2B)蛋白的含量变化。

图3A为：胞外基质蛋白4标签肽段LEDLENQLANQK(SEQ ID No.1)的含量变化。

图3B为：透明质酸酶1标签肽段ALYPSIYMPAVLEGTGK(SEQ ID No.2)的含量变化。

图4：两种蛋白的组合预测低级别胶质瘤的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本申请，但不作为对本申请的限制。以下提供了本申请实施方案中所使用的具体材料及其来源。然而，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本申请，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：尿液中低级别胶质瘤相关蛋白质检测

发明人用数据非依赖性采集方法(Data independent acquisition，DIA)在尿液中筛选低级别胶质瘤相关蛋白质。

1.材料与试剂

1)仪器：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪(Thermo Scientific公司)。

2)主要试剂：胰蛋白酶(Promega公司)；C18固相萃取小柱(3CC，60mg，Waters公司)；C18反相色谱柱(4.6mm×250mm，C18，3μm，Waters公司)。

3)样本：59例低级别胶质瘤(少枝，星形)患者的尿液和66例正常对照组的尿液，来自北京天坛医院。

2.人尿液样品的收集及尿蛋白的富集

收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。上清用乙醇沉淀，4度过夜以析出蛋白质。将蛋白沉淀用裂解液复溶。采用Bradford方法测量收集到的人尿蛋白的浓度。蛋白样品用SDS-PAGE分析。

3.蛋白酶解

用膜上酶切方法进行蛋白酶解。蛋白样品先用20mM DTT还原95度5min，再用50mMIAA烷基化(室温45min)，并上样到30KD滤膜上，离心弃掉下层废液。膜上蛋白样品用UA溶液(含8M尿素)清洗两次，并用25mM碳酸氢铵溶液清洗两次。膜上蛋白样品用1：50胰酶37℃过夜酶解，离心收集酶解后多肽。酶切后多肽用C18萃取柱萃取，真空抽干。抽干后多肽用BCA法进行多肽定量。

4.构建文库

为了构建谱图库，将所有尿液样品(疾病组及对照组)等量混合。并进行离线高pH高效液相色谱分离，收集的洗脱液置于旋转真空干燥仪中，真空抽干后复溶于1‰甲酸中进行LC-MS/MS分析。每一个组分的样品用数据依赖性采集方法(DDA，Data dependentacquisition)方式采集，采集到的原始数据用Proteome Discoverer(Thermo Scientific)软件检索。

搜索参数如下：

数据库SwissProt human(下载于Uniprot网站)

酶切方式：胰蛋白酶；容许两个误切位点；

固定修饰：半胱氨酸烷基化，TMT标记分子；可变修饰：天冬氨酸和谷氨酰胺脱氨化，甲硫氨酸氧化；赖氨酸和多肽N端氨甲酰化；

母离子质量误差：20ppm；

子离子质量误差：0.05Da。

蛋白水平FDR<1％，每个蛋白至少含有一个独特肽。检索结果导入SpectronautPulsar(Biognosys，Switzerland)软件产生数据库。

5.DIA分析实验数据

125例样品分别用1D-LC-MS/MS分析。每个样品DIA方式进行数据采集。DIA采集的数据用Spectronaut Pulsar软件处理。检索上述构建的谱图库，搜索参数同上。导出数据结果。以1.5倍以上变化和p<0.05作为筛选条件。

实施例2：尿液蛋白质胞外基质蛋白4、透明质酸酶1的质谱检测

为后面更好地对这些差异蛋白质组学分析结果在进一步更大规模临床样本中的应用检测，对于鉴定到的差异蛋白质，采用靶向质谱分析方法对差异蛋白质进行监控。平行反应监测是一种基于二级质谱信号的靶标质谱定量分析技术，能够同时进行相对和绝对定量。

1.材料与试剂

1)仪器：Triple TOF5600质谱仪(AB Sciex公司)。

2)主要试剂：胰蛋白酶(Promega公司)；C18固相萃取小柱(3CC，60mg，Waters公司)。

3)样本：38例低级别胶质瘤(少枝，星形)患者的尿液和35例正常对照组的尿液，来自北京天坛医院。

2.样品制备

38例低级别胶质瘤(少枝，星形)患者的尿液和35例正常对照组的尿液，分别取4ml尿液进行胰蛋白酶酶解。酶解后样本用BCA法进行多肽浓度测定。每个样品取10.5ug(0.5ug/uL)加入1.5uL iRT标准肽。并取等量样本制备混合样。

3.PRM多肽筛选

选取待验证的差异蛋白62个，进行PRM验证。用Skyline 3.6软件进行PRM多肽筛选。先用混合多肽进行筛选。每个差异蛋白选用3个左右多肽进行筛选，选择在尿液蛋白质组数据库中有较好谱图的，且在混合样品中能够鉴定到的或具有较高信噪比峰的多肽进行后续验证。

4.PRM验证

对筛选到的可用于PRM验证的多肽进行PRM分析。对上述73例样本分别验证，每个样本用schedule模式对待验证的多肽进行分析。为保证数据质量，在所有样品上样之前和上样之后，以及每8-10个样品之间，各进行一次混合样品的分析作为质量控制，观察整个分析过程中，仪器信号的稳定性。为保证数据质量，每个样品中加入iRT标准肽分析，观察分析过程中，色谱保留时间的稳定性。每个样品进行两次技术重复分析。不同组样品打乱顺序穿插进行质谱分析，以减少系统误差。

5.PRM数据分析

用Skyline 3.6软件进行PRM数据分析。所有结果导入到Skyline软件中，人工挑选正确的峰，将所有样品的所有多肽结果导出。用Progenesis软件提取每个样品的+2～+5电荷的总离子流强度(TIC)。将每个样品的每个多肽的质谱结果用该样品的总离子流强度均一化，校正上样量和质谱信号强度的误差。对每个多肽结果进行定量分析，筛选不同组之间的差异蛋白，并与数据非依赖检测结果进行比较。用Metaboanalyst进行ROC曲线分析，筛选出能够具有高灵敏度和特异性的标志物或其组合。

结果表明，两种蛋白的定量结果与数据非依赖检测结果一致，其特征多肽的列表及含量信息如下(表1)

表1.尿液中2种蛋白质特征肽段列表

进而，我们对其进行进一步受试者操作特征曲线(receiver operatingcharacteristic，ROC)分析，从而判断这两种蛋白质区分低级别胶质瘤(少枝，星形)的能力。

结果显示，这两种蛋白单独使用的ROC曲线下面积AUC均大于0.7(表1)。我们将这两种蛋白的结果进行整合分析，结果显示AUC分析结果为0.90(图4)。

参考文献

[1]Q.T.Ostrom等人CBTRUS Statistical Report:Primary Brain and OtherCentral Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2011-2015.Neuro Oncol 20(2018)iv1-iv86；

[2]R.Stupp等人Mirimanoff，Radiotherapy plus concomitant and adjuvanttemozolomide for glioblastoma.N Engl J Med 352(2005)987-996；

[3]M.Touat等人Emerging circulating biomarkers in glioblastoma:promises and challenges.Expert Rev Mol Diagn 15(2015)1311-1323。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京天坛医院

<120> 尿液中低级别胶质瘤的蛋白标志物及其在早期诊断中的用途

<130> 390135CG

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Glu Asp Leu Glu Asn Gln Leu Ala Asn Gln Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly

1 5 10 15

Lys