阅读说明：本技术 Rna纳米结构，其制备方法和用途 (RNA nanostructures, methods of making and uses thereof ) 是由 郭培宣 M·维威格 X·李 S·郭 H·尹 X·朴 于 2018-11-12 设计创作，主要内容包括：本文公开的是高Tm RNA纳米结构,其可以由用以构建分层或不分层的RNA纳米结构的一个或多个模块或基序组成。所述RNA纳米结构可具有核心结构域和三个或更多个双链臂及其制剂以缀合大量的治疗剂、pH响应或酶可裂解的药物货物。本文还公开用于生成可自组装成高度热稳定的RNA结构的合成RNA寡核苷酸的设计策略。本文还公开本文所述的RNA纳米结构的用途。(Disclosed herein are high Tm RNA nanostructures, which may be composed of one or more modules or motifs used to construct layered or non-layered RNA nanostructures. The RNA nanostructures can have a core domain and three or more double-stranded arms and formulations thereof to conjugate a wide variety of therapeutic agents, pH-responsive or enzymatically cleavable drug cargo. Also disclosed herein are design strategies for generating synthetic RNA oligonucleotides that can self-assemble into highly thermostable RNA structures. Also disclosed herein are uses of the RNA nanostructures described herein.)

RNA纳米结构，其制备方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请主张于2018年2月9日提交的，名称为“具有70℃至100℃Tm的RNA纳米结构用于溶解和携带高拷贝数的紫杉醇或衍生物用于递送至肿瘤”的美国临时申请第62/628,591号的权益，其整体通过引用并入本文。

本申请主张于2018年11月5日提交的，名称为“RNA纳米结构，其制备方法和用途”的美国临时申请第62/755,696号的权益，其整体容通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的CA207946、CA186100、CA151648、CA168505、CA209045和EB019036基金号的政府支持，以及由美国国防部授予的W81XWH-15-1-0052基金号的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

序列表

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背景技术

化疗在癌症治疗中仍起关键作用。然而，最频繁使用的抗癌药物，包括用于多种癌症治疗的活性最强化疗剂之一的紫杉醇，都是疏水性的小分子。这些小分子差的水溶性经常导致严重的副作用、非特异性毒性和低药效。需要一种高效且受控的药物递送和释放平台。

发明内容

在一些方面，本文描述的是可由至少三段合成RNA寡核苷酸组成的RNA基序，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以彼此偶联，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以形成中心核结构域，和围绕所述核结构域排布并且远离所述中心核结构域延伸的至少三个双链臂，其中所述RNA基序的解链温度可以大于65摄氏度。该模块化RNA基序可以包括3至9条合成RNA寡核苷酸链。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段可以包括一个或多个修饰的核苷酸。一个或多个修饰的核苷酸可以是末端核苷酸或非末端核苷酸。所述修饰可以是与一个或多个修饰的核苷酸连接的炔。所述修饰可以是与一个或多个修饰的核苷酸连接的接头。所述模块化RNA基序可以进一步包括与所述至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相连的货物化合物分子。至少3至100个货物化合物分子可与所述合成RNA寡核苷酸相连。所述模块化RNA基序可以进一步包括与所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相连的官能团。所述官能团可以与末端核苷酸相连。所述官能团可以与非末端核苷酸相连。所述模块化RNA基序可以进一步包括与官能团相连的货物化合物。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段都可以包括具有与SEQ ID NOs：1-54中的任一者为大约80-100％同一性的序列的寡核苷酸序列。所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以被配置为自组装以形成所述模块化RNA基序。所述模块化RNA基序的Tm可以大于约70摄氏度。所述模块化RNA基序的Tm可以在约70摄氏度至约100摄氏度的范围。所述模块化RNA基序的Tm可以在约65摄氏度至约100摄氏度的范围。

在一些方面，本文中还描述的是可以由至少四段合成RNA寡核苷酸组成的模块化RNA基序，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以彼此偶联，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以形成中心核结构域，并且至少三个双链臂可以围绕所述核结构域排布并可以远离所述中心核结构域延伸。所述模块化RNA基序可以包括4至9条合成RNA寡核苷酸链。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段可以包括一个或多个修饰的核苷酸。一个或多个修饰的核苷酸可以是末端核苷酸或非末端核苷酸。所述修饰可以是与一个或多个修饰的核苷酸连接的炔。所述修饰可以是与一个或多个修饰的核苷酸连接的接头。所述模块化RNA基序可以进一步包括与所述至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相连的货物化合物分子。在有些方面，至少3至100个货物化合物分子可与所述合成RNA寡核苷酸相连。所述模块化RNA基序可以进一步包括与所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相连的官能团。所述官能团可以与末端核苷酸相连。所述官能团与非末端核苷酸相连。所述模块化RNA基序可以进一步包括与官能团相连的货物化合物。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段可以由具有与SEQ ID NOs：1-54中的任一者为大约70-100％同一性的序列的寡核苷酸序列组成。所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以被配置自组装以形成所述模块化RNA基序。

在一些方面，本文还描述了RNA纳米结构，其可以包括至少两个如本文所述的模块化RNA基序，其中所述至少两个模块化RNA基序可以彼此相连。所述RNA纳米结构可以包括中心核，其中所述中心核可以包括第一模块化RNA基序；第一层，其中所述第一层可以包括至少三个模块化RNA基序，其中所述第一层的所述至少三个模块化RNA基序中的每个模块化RNA基序可以与所述第一模块化RNA基序相连；和第二层，其中所述第二层包含至少三个模块化RNA基序，其中所述第二层的所述至少三个模块化RNA基序中的每一个可以与所述第一层的所述至少三个模块化基序中的模块化RNA基序相连。在一些方面，所述纳米结构中的所有所述模块化RNA基序都可以具有相同数目的双链臂。在一些方面，所述第一层的模块化RNA基序上的双链臂的数目可以不同于所述第一模块化RNA基序上的、所述第二层的模块化RNA基序上的、或所述第一模块化RNA基序和所述第二层的模块化RNA基序两者上的双链臂的数目。在一些方面，所述第二层的模块化RNA基序上的双链臂的数目可以不同于所述第一模块化RNA基序上的、所述第一层的模块化RNA基序上的、或者所述第一模块化RNA基序和所述第一层的模块化RNA基序两者上的双链臂的数目。所述第一模块化RNA基序上的双链臂的数目可以不同于所述第一层的模块化RNA基序上的、所述第二层的模块化RNA基序上的、或者所述第一层和所述第二层的模块化RNA基序两者上的双链臂的数目。所述RNA纳米结构的解链温度(Tm)可以大于70摄氏度。所述RNA纳米结构的Tm可以在70摄氏度至约100摄氏度范围。所述第一模块化RNA基序可以具有比所述第一层的模块化RNA基序和所述第二层的模块化RNA基序更大的Tm。所述第一层的模块化RNA基序可以具有比所述第二层的模块化RNA基序更大的Tm。所述RNA基序中的一个或多个可以与一个或多个货物化合物偶联。所述RNA基序中的一个或多个可以与一个或多个官能团偶联。所述货物化合物可以是抗癌化合物、螯合剂、放射性同位素、荧光团、miRNA、抗miRNA、siRNA、pH响应前药(prodrug)、酶可裂解前药或其任意组合。所述RNA基序中的一个或多个与两个或更多个货物化合物偶联，其中所述两个或更多个货物化合物中的至少两个是不同类型的货物化合物。

在一些方面，本文还描述了可以包括向受试者施用如本文所述的模块化RNA基序或本文所述的RNA纳米结构的步骤的方法。所述受试者可以患有或怀疑患有癌症。

在一些方面，本文还描述在受试者中治疗癌症或疾病的方法，所述方法可包括向所述受试者施用如本文所述的模块化RNA基序或如本文所述的RNA纳米结构的步骤。

在一些方面，本文还描述了如本文所述的RNA纳米结构，其用于制备用于治疗疾病或癌症的药剂。

在一些方面中，本文还描述了可以包括计算设备，以及在所述计算设备上可执行的应用的系统，其中，当被执行时，所述应用被可以使得所述计算设备至少：产生理论双链臂(DA)序列，其可以至少部分地基于所述理论DA序列的GC含量，所述理论DA序列的解链温度(Tm)和自发二聚化的能力；选择对于一组寡聚物的一个或多个DA，其可以至少部分地基于所保存的一组DA的计算的交叉互补性，其中具有最低总体互补性的DA被选择；可以计算寡聚物序列，其可以包括计算DA序列的反向互补序列、计算延伸寡聚物序列和计算终止寡聚物序列；并且可以至少部分地基于寡聚物自发二聚化或形成二聚体的能力来选择寡聚物，其中不自发二聚化并且不形成二聚体的那些寡聚物被选择。

在一些方面，本文还描述了至少包括如下步骤的方法：生成理论双链臂(DA)序列，其至少部分地基于所述理论DA序列的GC含量，所述理论DA序列的解链温度(Tm)，和自发二聚化的能力；至少部分地基于所保存的一组DA的计算的交叉互补性，选择对于一组寡聚物的一个或多个DA，其中具有最低总体互补性的DA被选择；计算寡聚物序列，其可包括计算DA序列的反向互补序列、计算延伸寡聚物序列和计算终止寡聚物序列；和至少部分地基于寡聚物自发二聚化或形成二聚体的能力选择寡聚物，其中不自发二聚化并且不形成二聚体的那些寡聚物被选择。

在一些方面，本文还描述了本文所述的核苷酸、RNA或RNA结构的用途，其用于使疏水性或低可溶性药物变得可溶，从而减少药物剂量，用于降低药物毒性或副作用，或者避免在癌症化疗中使用油或有机溶剂溶解药物。

在一些方面，本文还描述了疏水性材料用于产生RNA微团结构以携带抗癌化合物、治疗剂、miRNA、抗miRNA、siRNA、螯合剂、放射性同位素、荧光团、pH响应前药或酶可裂解前药的用途。

本发明的一个或多个方面的细节在以下的附图和说明中阐述。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1A至1E显示了pRNA-3WJ-PTX微团的结构基础和组装原理。图1A.来源于噬菌体phi29包装RNA的pRNA-3WJ基序。图1B.pRNA-3WJ的成角分支结构。图1C.将pRNA-3WJ与亲脂性模块(胆固醇，蓝色)、治疗模块(PTX，绿色)和报告模块(Alexa染料，红色)缀合。图1D.图解在水溶液中通过缀合的亲脂性模块的疏水相互作用形成pRNA-3WJ。图1E.通过1％TAE琼脂糖凝胶电泳分析pRNA-3WJ微团的组装。上方凝胶：EtBr通道；下方凝胶：Alexa647通道(M:1kb plus DNA分子量标准(DNA ladder))。

图2A至2D显示了pRNA-3WJ微团的特征。图2A.AFM图像。比例尺：200nm。图2B.通过DLS的表观流体动力学直径测量。上图：TMS缓冲液中的3WJ；下图：TMS缓冲液中的pRNA-3WJ-PTX微团。图2C.通过DLS的ζ电位测量。图2D.通过尼罗红结合分析验证pRNA-3WJ微团的组装。

图3A至3D显示了RNA-PTX缀合物。图3A.RNA-PTX缀合物的设计原理。PTX-N3可以通过点击化学与末端炔标记的RNA反应，并且PTX随后可以通过水解从RNA链被释放。图3B.在TBE缓冲液中通过20％8M尿素PAGE分析成功的RNA -PTX缀合。图3C.通过质谱对a3WJ-PTX缀合物的实验质量预测。图3D.随时间的体外PTX释放曲线。

图4A和4B显示通过流式细胞术(图4A)和共聚焦显微镜(图4B)在体外肿瘤细胞结合和内化pRNA -3WJ-PTX微团的分析。显示的是细胞核染色(蓝色)；细胞骨架染色(绿色)；和pRNA-3WJ-PTX微团结合(红色)。

图5A至5D显示了在体外负载PTX的pRNA-3WJ微团的细胞毒性和凋亡作用。图5A.通过MTT分析测定pRNA-3WJ-PTX微团的细胞毒性作用。图5B.通过PI/膜联蛋白V-FITC双重染色和FACS分析测定pRNA-3WJ-PTX微团的凋亡作用。图5C.Caspase-3测定。图5D显示了pRNA-3WJ-PTX微团在小鼠异种移植物中的体内肿瘤靶向。左图：注射后4小时后获得的全身图像。右图：注射后24小时后获得的器官图像。

图6A-6R用于微RNA(micro RNA)递送的RNA微团。图6A-6D.3WJ基序，图解3WJ RNA微团形成、3WJ/FA/抗-miR21微团的2D结构、由2％琼脂糖凝胶分析的RNA微团的组装。(从左到右的泳道：3WJ、3WJ微团、3WJ/抗miR21、3WJ/抗miR21微团、3WJ/FA/抗miR21、3WJ/FA/抗miR21微团)，3WJ/FA/抗-miR21微团的大小分布和ζ电位。图6E-6G.通过尼罗红封装分析测定的CMC，以及RNA微团在不同温度、pH和RNA酶条件下的稳定性研究。图6H-6I显示RNA微团至癌细胞的体外结合和内化。处理1小时后，流式细胞术比较对KB细胞的结合亲和力。共聚焦显微镜显示内化分布。蓝色：细胞核；绿色：细胞骨架；红色：RNA纳米颗粒。图6J-6L显示了携带抗-miR21的RNA微团的体外研究。双萤光素酶测定展示向KB细胞递送抗-miR21。qRT-PCR显示miR21敲除对靶基因PTEN表达的影响。Caspase-3测定显示处理后的细胞凋亡诱导。图6M-6N显示在具有异种移植物的小鼠中体内生物分布研究。全身图像。注射后8hr后的离体器官图像。图6O-6R显示RNA微团在具有异种移植物的小鼠中的体内治疗效果。在5次注射过程中的肿瘤消退曲线(红色箭头显示注射日)。治疗期间小鼠的体重曲线。qRT-PCR和Western印迹显示体内递送抗-miR21后PTEN上调。

图7A和7C显示测定由pRNA-3WJ微团制剂对促炎性细胞因子和趋化因子的诱导。图7A.在将pRNA-3WJ微团与小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞进行孵育之后，通过ELISA分析对TNF-α、IL6和IFN-α产生的体外评估。图7B.在将pRNA-3WJ微团注射到C57BL/6小鼠中之后，通过ELISA分析对TNF-α、IL6和IFN-α产生的体内评估。图7C.对于pRNA-3WJ微团制剂的体内趋化因子诱导图谱。

图8显示了相对于不同的pH和温度的pRNA-3WJ微团制剂稳定性。

图9A至9C显示PTX-N3的合成(图9A)，PTX(图9B)和PTX-N3(图9C)的1H NMR(400MHz)谱。

图10A和10B显示RNA-PTX缀合物。图10A.用未修饰的a3WJ链、5’-炔修饰的a3WJ链和5’-PTX修饰的a3WJ链逐步组装pRNA-3WJ。(M:超低DNA分子量标准)。图10B.1mM游离PTX和RNA-PTX在DEPC水中的溶解度。

图11A-11C显示了可证实微团形成的曲线图和凝胶图像。图11A和11B显示了根据尼罗红结合分析的微团形成浓度。图11C显示1％TAE琼脂糖凝胶电泳(分子量标准：1kbplus DNA分子量标准)。

图12A至12F显示Caspase-3依赖方式的pRNA-3WJ-紫杉醇微团诱导的凋亡的时间过程。

图13显示来自pRNA-3WJ-PTX微团体内肿瘤靶向的时间过程的结果。P：PBS；M-PTX：pRNA-3WJ-PTX微团。

图14显示pRNA-3WJ微团处理的小鼠血清和对照PBS处理的小鼠血清的印迹图像。

图15A至15D显示模块化RNA基序的形状、大小和对于高熔融温度(Tm)的取向。图15A.具有不同的序列和热稳定性的3WJS。图15B.通过TGGE(热梯度凝胶电泳)的Tm分析。图15C.通过qPCR的Tm测定。图15D.改变形状和胆固醇标记策略的示例性RNA设计以优化膜锚定效率。

图16A和16B显示了由多个炔基团修饰的多分支或多臂模块化RNA基序的二级结构。图16A.由18个炔基团修饰的3WJ模块化RNA基序。图16B.由24个炔基团修饰的4WJ模块化RNA基序。

图17显示用于多个紫杉醇有效缀合至RNA链的水/有机介质的最佳比率。

图18显示根据非变性PAGE的分别与18个紫杉醇和24个紫杉醇缀合的3WJ和4WJRNA纳米结构的逐步自组装(分子量标准：超低范围DNA标记)。

图19显示根据TGGE的与18个紫杉醇缀合的3WJ纳米结构的Tm(M：单体)。

图20A和20B显示合成RNA寡核苷酸的序列设计和药物缀合。图20A.有紫杉醇(PTX)缀合的扩展3WJ和4WJ RNA载体的序列设计。将6-PTX缀合至一个4WJ合成RNA寡核苷酸。图20B.有和无6-PTX缀合的纯化4WJ合成RNA寡核苷酸的HPLC色谱图。

图21A至21C显示体外表征。图21A.具有18PTX的3WJ和具有24PTX的4WJ的逐步自组装与(M、D、T分别表示单体、二聚体和三聚体)。图21B.通过DLS测量的4WJ-24PTX的大小分布。图21C.通过缀合至RNA而提高的PTX的溶解度。

图22A和22B显示热稳定性。图22A.4WJ空载体和4WJ-24PTX的TGGE。图22B.4WJ空载体和4WJ-24PTX的qPCR。

图23显示具有多个泰素(Taxol)的4WJ的使用MTT测定的体外细胞毒性。在相同PTX浓度下，具有24PTX的4WJ与单独PTX相比显示更高的细胞毒性。

图24A和24B显示用以检测治疗效果的动物试验的结果。图24A.小鼠肿瘤体积和体重的每日记录。图24B.处死前后肿瘤重量的比较。与阴性对照组相比，4WJ-FA-泰素组显示更慢的肿瘤生长。在治疗后未观察到小鼠体重发生显著降低，这可表明没有显著的毒性。

图25A至25C显示设计和药物缀合。图25A.修饰的寡核苷酸和喜树碱(CPT)前药的点击反应方案。图25B.变性PAGE用以监测缀合(*表示2’-F 4炔；<表示2’-F 4CPT)。图25C.有和无4CPT缀合的纯化3WJ链的HPLC色谱图(黑色：2’-Fb 4炔；红色：2’-Fb 4CPT)。

图26A至26C显示负载有货物化合物的3臂模块化RNA基序的组装和体外表征。图26A.图解3WJ-FA-7CPT。图26B.FA-7CPT-3WJ和3WJ对照的逐步组装的非变性PAGE(泳道1，2’-Fa 3CPT；泳道2，2’-Fa3CPT+2’-Fc叶酸；泳道3，FA-7CPT-3WJ；泳道4，7CPT-3WJ；泳道5，FA-3CPT-3WJ；泳道6，FA-4CPT-3WJ；泳道7，FA-3WJ；泳道8，3WJ)。图26C.FA-7CPT-WJ的温度梯度凝胶电泳。

图27显示具有一个CPT的RNA的KB细胞活力测试。在相同CPT浓度下，观察到具有一个CPT的3WJ与单独的CPT相比，具有稍微更大的细胞毒性。

图28显示3WJ-FA-7CPT和PBS之间肿瘤生长的比较。观察到3WJ-FA-CPT与阴性对照组相比导致更缓慢的肿瘤生长。

图29A至29C显示具有三个不同核心(Phi29、SF5、M2)和四组螺旋(WT、Mod、30、32)的分支3WJ模块化RNA基序的设计和序列。图29A.显示核心和螺旋的不同组合的设计示意图。图29B.七个3WJ模块化RNA基序的序列设计(Phi29-Mod，Phi29-30，SF5-30，M2-30，Phi29-32，SF5-32，M2-32)。图29C.具有同一组螺旋(DA)和在核心中将DA分开的不同突起的分支3WJ模块化RNA基序的比较。

图30A至30C显示分支3WJ模块化RNA基序在TES缓冲液中的热稳定性。图30A.qPCR显示退火曲线。图30B.TGGE显示解链曲线。图30C.针对分支3WJ模块化RNA基序退火和解链所测量的Tm的比较。

图31A和31B显示分支3WJ模块化RNA基序的酶解稳定性。图31A.血清降解曲线。图31B.3WJ在50％血清中的半衰期。

图32A至32D显示由分支3WJ模块化RNA基序制成的分支3WJRNA纳米结构的设计和构造。图32A.具有不同热稳定性的三种3WJ模块化RNA基序，其用作分支3WJ RNA纳米结构的结构元件。图32B.具有不同分层的分支3WJ RNA纳米结构的2D示意图。图32C.具有不同分层的分支3WJ RNA纳米结构的3D示意图。图32D.各分支3WJ模块化RNA基序组成和偶联以形成3层分支纳米结构。

图33A至33D显示分支3WJ RNA纳米结构的热稳定性。图33A.qPCR显示退火曲线。图33B.TGGE显示解链曲线。图33C.退火和解链Tm的比较。图33D.TGGE显示分支3WJ RNA模块的热力学堆叠层释放曲线。

图34A和34B显示分支3WJ RNA纳米结构的体外表征。图34A.大小比较凝胶显示2层和3层3WJ RNA纳米结构的组装。图34B.通过动态光散射(DLS)测量的2层和3层3WJ RNA纳米结构的大小分布。

图35A至35C显示分支3WJ RNA纳米结构的酶解稳定性。图35A.血清稳定性凝胶。图35B.血清降解曲线。图35C.3WJ RNA纳米结构在50％血清中的半衰期。

图36A和图36B显示通过流式细胞术(图36A)和共聚焦显微镜(图36B)的在体外3L-无FA、3L-核心FA和3L-外部FA的细胞结合比较。

图37A至37C显示基于分支3WJ的模块化RNA基序和具有不同臂数量的变体的设计和构造。图37A .不同的高阶接合(核心)用作模块化RNA基序的结构元件。图37B.合成的模块化RNA基序的核苷酸序列。图37C.使用6WJ作为核心且4WJ作为臂(或分支)的一个模块化RNA基序的3D结构。

图38A至38G显示3WJ(图38A)、4WJ(图38B)、5WJ(图38C)、6WJ(图38D)、7WJ(图38E)、8WJ(图38F)和9WJ(图38G)模块化RNA基序的2D结构，显示了示例的合成的RNA寡核苷酸序列。

图39A至39C显示各种模块化RNA基序的热稳定性。图39A.qPCR显示退火曲线。图39B.TGGE显示解链曲线。图39C.针对模块化RNA基序退火和解链的Tm比较。

图40A和图40B显示基于分支3WJ的模块化RNA基序的体外表征。图40A.大小比较凝胶：2％琼脂糖凝胶显示4-6WJ的组装(从左到右：分子量标准、phi29-3WJ、单体、二聚体、三聚体、4WJ、5WJ、6WJ)。图40B.通过动态光散射(DLS)测量的4-6WJ的大小分布。

图41A至41G显示模块化RNA基序的方面。黑色区域识别双链臂(DA)，且灰色区域指示模块化RNA基序的核心结构域。核心结构域也被指定为包含在虚线框内的模块化RNA基序区域。

图42A至42G显示各包含单一类型的模块化RNA基序的RNA纳米结构的方面。黑色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块RNA基序。深灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的二级水平或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的末端或最外侧水平的模块化RNA基序。

图43显示含有不同类型的模块化RNA基序的RNA纳米结构的一个方面。黑色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块化RNA基序。深灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的二级水平或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的末端或最外侧水平的模块化RNA基序。

图44A至44B显示负载单一类型的货物化合物或官能团的RNA纳米结构的方面。黑色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块化RNA基序。深灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的二级水平或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的末端或最外侧水平的模块化RNA基序。

图45A至45B显示负载多种类型的货物化合物和/或官能团(包括但不限于活性剂)的RNA纳米结构的方面。黑色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块化RNA基序。深灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的二级水平或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序标示包含在RNA纳米结构中的末端或最外侧水平的模块化RNA基序。

图46A至46B显示负载多种类型的货物化合物和/或官能团(包括但不限于紫杉醇)的RNA纳米结构的方面。图46A.具有模块化RNA基序的纳米结构，所述模块化RNA基序包含具有内部修饰的延长的核心，所述内部修饰允许活性剂特异性连接至纳米结构的核心。图46B.具有不同官能团的纳米结构，所述官能团连接至每一层中的寡核苷酸的5’端或3’端。

图47A至47D显示计算机衍生的RNA纳米结构的设计概念。图47A.显示3-6分支的RNA纳米结构的2D和3D代表图。图47B显示3-6分支RNA纳米结构的寡聚物序列和互锁结构域的设计。图47C显示单独RNA纳米结构低聚物的构成。

图48显示用于计算机设计RNA纳米结构低聚物序列的计算算法的流程图。

图49A至49C.将荧光团缀合至核酸纳米颗粒，用于体内癌症成像。图49A.PAGE分析，证明RNA寡聚物和纳米颗粒能携带多色荧光材料。图49B.组装凝胶，证明低聚物在经荧光团修饰后能高效组装。图49C.与ICG荧光团偶联的Phi29 3WJ纳米颗粒的生物分布。

图50A至50C.DOTA螯合剂高密度缀合至RNA寡聚物和纳米颗粒。图50A至50B.将经胺修饰和与DOTA缀合的低聚物组装至RNA纳米颗粒中。图50B至50C.具有不同密度的DOTA缀合物的RNA纳米颗粒的比较，所述DOTA缀合物含有和不含有螯合的Gd³⁺。

图51A至51C.NOTA螯合剂高密度缀合至低聚物和纳米颗粒。图51A.NOTA螯合Cu64至RNA纳米颗粒用于PET成像的示意图。图51B至51C.缀合NOTA的RNA纳米颗粒的组装凝胶和反相HPLC纯化。

图52A至52E显示具有多个用以缀合药物的醛基以用于pH响应性药物释放的pRNA链的设计和合成。图52A.在3WJ核心上缀合多个药物的示意图。图52B含有用于亚胺键结合的游离胺基的药物实例。图52C.含有用于缩醛键的羟基的药物实例。图52D.应用肼键的pH敏感性接头设计的实例。图52E.将PI103前药偶联至核酸低聚物的酸不稳定接头的实例。

图53A至53H显示递送用于癌症治疗的厄洛替尼的基于RNA的热稳定微团的设计和制备。图53A.具有可调节的疏水修饰的两亲性RNA链，用于形成RNA微团。图53B.图解与功能性配基缀合的RNA-生育酚微团。图53C至53H.具有可调节的疏水修饰的5个两亲性RNA链的临界微团浓度测定。

图54A至54P显示用于抑制KB肿瘤异种移植物生长的CPT-RNA缀合物的设计和制备。图54A至54C.CPT-RNA缀合。图54B-54D.通过缀合至RNA溶解药物。图54C至54H.携带RNA纳米颗粒的CPT的组装、热力学稳定性和大小分布。图54D至54I.CPT自RNA纳米颗粒的释放曲线。图54J至54K.CPT-RNA纳米颗粒的细胞结合和内化。图54L至54M.CPT RNA纳米颗粒的细胞毒性和凋亡作用。图54N至54P.CPT RNA NP在KB肿瘤异种移植小鼠模型中的肿瘤抑制。

具体实施方式

在更详细地描述本申请之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定方面，并且因此理所应当可以改变。还应当理解的是，本文中使用的术语仅出于描述特定方面的目的，且不意在限制。

除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语都具有如本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管类似或等同于本文描述的任何方法和材料也可以用于实践或测试本公开，但在目前只描述了优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利都被引用，以公开和描述所引用的出版物与之相关的方法和/或材料。所有这样的出版物和专利通过引用并入本文，相当于具体和单独地指定每个单独的出版物或专利通过引用被并入。这种通过引用的并入明确限于在所引用的出版物和专利中描述的方法和/或材料，并且不延伸至来源于所引用的出版物和专利的任何词典定义。没有在本申请中明确地重复的所引用出版物和专利中的任何词典定义不应被视为如此，并且不应被理解为定义在所附权利要求中出现的任何术语。对于任何出版物的引用均针对其在申请日之前的公开内容，并且不应当被解释为承认本申请由于在先公开而无权先于这些出版物。此外，所提供的公开日期可能不同于也许需要独立确认的实际公开日期。

在阅读本申请之后，对于本领域技术人员将显而易见的是，本文所描述和阐明的各个方面中的每一方面具有独立的元件和特征，这些元件和特征可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，容易地与任何其他若干方面的特征分离或组合。任何所述的方法可以所述的事件的次序或以逻辑上可行的任何其它次序执行。

应当注意，比率、浓度、量和其它数值数据在本文中可以范围的形式表达。还应当理解，每个范围的端点既与另一个端点显著相关，又与另一个端点显著独立。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中还被描述为除了所述值本身以外的“大约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，那么“约10”也被公开。在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解，所示特定值形成进一步的方面。例如，如果公开了值“约10”，则“10”也被公开。

在表述范围的情况下，进一步的方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。提供了值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间以下限单位的十分之一为基准的每个中间值(除非上下文另有明确说明)和在该陈述范围中的任何其他陈述的值或中间值均包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本申请内，受限于所述范围中任何特别排除的界限。当陈述范围包括一个或两个所述界限时，排除任一个或两个那些所包括的界限的范围也包括在本公开内。例如，当陈述范围包括一个或两个界限时，排除那些所包括界限的任一个或两个界限的范围也包括在本申请内，例如短语“x至y”包括从“x”至“y”的范围，以及大于“x”和小于“y”的范围。该范围还可以被表达为上限，例如，“约x、y、z或更小”，并且应当被解释为包括“约x”、“约y”和“约z”的特定范围，以及“小于x”、“小于y”和“小于z”的范围。同样地，短语“约x、y、z或更大”应当被解释为包括“约x”、“约y”和“约z”的特定范围，以及“大于x”、“大于y”和“大于z”的范围。此外，短语“约‘x’至‘y’”，其中‘x’和‘y’为数值，包括“约‘x’至约‘y’”。

应当理解，使用这样的范围形式是为了方便和简洁，因此，应当以灵活的方式被解释为不仅包括明确地记载为该范围的界限的数值，而且也包括包含在该范围内的所有个别数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确记载。为了说明，“约0.1％至5％”的数值范围应当被解释为不仅包括明确记载约0.1％至约5％的值，而且还包括在所指示范围内的单独的值(例如，约1％、约2％、约3％和约4％)和子范围(例如，约0.5％至约1.1％；约5％至约2.4％；约0.5％至约3.2％，和约0.5％至约4.4％，以及其他可能的子范围)。

除非上下文另有明确指示，否则在说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数指示物。

如本文所使用的“约”、“大约”、“基本上”等诸如此类，当与数值变量结合使用时，通常可以指所述变量的值和在实验误差内的所述变量的所有值(例如，在针对平均值的95％置信区间内)或在所指示值的±10％内，以较大者为准。如本文所使用的术语“约”、“大约”、“为或约”以及“基本上”可以表示所讨论的量或值可以是精确值，或者是提供如权利要求中所述的或本文教导的等同结果或等同效果的数值。也就是说，应当理解，量、大小、配方、参数和其它数量和特性不是并且不必是精确的，而是可以根据需要近似的和/或更大或更小的，反映容差、换算因子、舍入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，从而获得等同的结果或效果。在一些情况下，提供等同的结果或效果的值不能被合理地确定。通常，无论是否被明确地陈述为此，量、大小、配方、参数或其它数量或特性是“约”、“大约”、或“为或约”。应当理解，在定量值之前使用“约”、“大约”、或“为或约”的情况下，除非另外特别声明，否则该参数也包括特定的定量值本身。

除非另外指明，否则本公开的方面将采用分子生物学、微生物学、有机化学、生物化学、生理学、细胞生物学、癌症生物学、物理学等诸如此类的技术，其在本领域的技能范围内。文献中对这些技术进行了充分的解释。

在详细描述本公开的各方面之前，应当理解，除非另有说明，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造方法等，因为这些可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，且并不意在限制。除非上下文另有明确指示，在逻辑上是可能的情况下，在本申请中还有可能步骤以不同的顺序执行。

定义

如本文所用，“活性剂”或“活性成分”是指组合物的全部或部分效应归因于的组合物的组分。活性剂可以是药物活性化合物、分子(包括但不限于化学分子和生物分子)或其他物质，当其与RNA纳米结构接触和/或当其与RNA纳米结构不接触时，能在施用其的受试者中引发效应(例如药物效应和/或生物效应)。

如本文所使用的，术语“施用”是指向受试者提供组合物的任何一种方法。这样的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于心内给药、口服给药、经皮给药、吸入给药、经鼻给药，局部给药、***内给药、眼部给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药、舌下给药、口腔给药和肠胃外给药，包括注射给药例如静脉内给药、动脉内给药给药、肌内给药和皮下给药。施用可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地施用制品；也就是说，施用以治疗现有疾病或病症。在进一步的各个方面中，可以预防性地施用制品；也就是说，施用用于预防疾病或病症而施用。

如本文所用，“抗感染剂”可包括但不限于抗生素、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗原生动物剂。

如本文所用，“适体”可以指单链DNA或RNA分子，其可以以高亲和力和特异性结合预选的包括蛋白质的靶标。它们的特异性和特性不是直接由它们的一级序列，而是由它们的三级结构决定的。

如本文所使用的，“连接的”、“连接”等诸如此类可以指在两个或更多个分子之间形成共价或非共价结合(例如键)，或两个或更多个分子的缀合。如本文中所使用的，“连接的”、“连接”等诸如此类可以指两个或更多个分子直接结合在一起，在连接在一起的那些分子之间没有中间分子，或者是指经一个或多个接头介导的两个或更多个分子间接连接在一起。在结合是非共价的情况下，这可以涵盖电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主-客相互作用，疏水相互作用、TT堆叠相互作用、氢键结合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用和/或它们的组合。在结合是共价的情况下，这可以涵盖在所涉及的每个分子中在一个或多个原子之间共享一对电子的键。

如本文所用，术语“接触”是指将所公开的组合物或肽或药物制品与细胞、靶受体或其它生物实体以这样的方式集合在一起，以使得所述化合物能直接(即通过与靶标本身相互作用)，或者间接(即通过与靶标活性所依赖的另一个分子、辅因子、因子或蛋白质相互作用)影响靶标(例如，受体、转录因子、细胞等)的活性。

如本文中所使用的，“对照”是在实验中用于比较目的而使用的替代受试者或样本，并且其被包括以最小化或区分除了自变量之外的变量的影响。“对照”可以是阳性对照或阴性对照。

如本文所使用的，“偶联”或“偶联至”是指更大结构或系统的两个或更多个组份的直接或间接的连接或结合或其他接合。

如本文中所使用的，“缀合”具有与“连接”相同的含义。

如本文所用，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常可以指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA。RNA可以是非编码RNA或编码mRNA(信使RNA)的形式，非编码RNA例如tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)、微RNA(miRNA)或核酶，适体，指导RNA(gRNA)。

如本文所用，“剂量”、“单位剂量”、或“用量”是指适用于受试者中的物理离散单元，每个单元含有预定量的纳米颗粒组合物或制剂，其经计算以产生与其施用相关的期望响应。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的结果或对不期望的状态有效果的量。例如，在一个方面，有效量的聚合纳米颗粒是杀死和/或抑制细胞生长而对周围的非癌细胞不引起额外损害的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗结果或对不期望的症状有效果、但通常不足以引起不利副作用的量。针对任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；所使用的具体化合物的***率；治疗的持续时间；与使用的具体化合物和药学领域中熟知的类似因素组合使用或同时使用的药物。

如本文所使用的，“同一性”、“同一”等诸如此类可以指如通过比较序列所确定的两个或更多个核苷酸或多肽序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指如通过这样的序列串之间的匹配所确定的核苷酸或多肽之间的序列相关性程度。可以通过已知方法容易地计算“同一性”，所述已知方法包括但不限于在(计算分子生物学，Lesk，A.M.编辑，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组计划，Smith，D.W.编辑，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，胡玛纳出版社，新泽西州，1994；分子生物学中的序列分析，Von Heinje，G.，学术出版社，1987；和序列分析入门，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，斯托克顿出版社，纽约，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.应用数学，1988，48：1073)中记载的那些。确定同一性的优选方法被设计为在所测试序列之间给出最大匹配。用于确定同一性的方法被编码在公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用合并了Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.，1970，48：443-453)算法(例如，NBLAST和XBLAST)的分析软件(例如美国威斯康星麦迪逊的遗传学计算机小组的序列分析软件包)来确定。除非另有说明，否则使用默认参数确定本公开的多肽的同一性。

如本文所使用的，“免疫调节剂”可以指能够调控或调节一种或多种免疫功能或应答的试剂，诸如治疗剂。

如本文所使用的，关于纳米颗粒阶段的术语“基序”旨在指代双链或单链核糖核酸或其类似物。通过彼此连接，各个基序接合在一起成为较大的颗粒。连接可以通过非共价结合而发生。

本文使用的术语“纳米颗粒”旨在指代直径从1nm至高达1,000nm的颗粒。所述纳米颗粒可以为5nm至30nm、10nm至50nm，10nm至40nm，10nm至30nm，10nm至20nm，以及10nm至15nm。RNA可以从任何来源获得，例如噬菌体phi 29、HIV、果蝇、核糖体或可以是合成RNA。

如本文所使用的术语“纳米结构”旨在指代在任何方向沿着其最大尺寸测量时1nm至高达1,000nm的结构。如在任何方向沿着其最大尺寸测量，纳米结构可以为5nm至30nm、10nm至50nm，10nm至40nm，10nm至30nm，10nm至20nm，以及10nm至15nm。

如本文所使用的术语“核酸”和“多聚核苷酸”通常是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的序列串，并且尤其指代单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA、和单链和双链区域混合的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，所述DNA和RNA可以是单链的，或更典型的是双链的，或者是单链和双链区域的混合。此外，如本文所使用的，多聚核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。在这样的区域中的链可以来源于相同的分子或来源于不同的分子。该区域可以包括全部的一种或多种所述分子，但更典型的是仅涉及一些所述分子的区域。具有三螺旋区域的分子之一通常是寡核苷酸。“多聚核苷酸”和“核酸”也包含这样的化学修饰、酶促修饰或代谢修饰的多聚核苷酸形式，以及病毒和细胞特征的DNA和RNA的化学形式，尤其包括简单的细胞和复杂的细胞。例如，术语多聚核苷酸包括如上所述的包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，包括诸如肌苷的不常见碱基，或者诸如三苯甲基化碱基的修饰碱基(仅举两个实例)的DNA或RNA就是如本文所使用的多聚核苷酸。“多聚核苷酸核酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸酯骨架的其它变体。天然核酸具有磷酸酯骨架，人工核酸可含有其它类型的骨架，但含有相同的碱基。因此，具有为稳定性或其它原因而经修饰的骨架的DNA或RNA是如本文中那个术语所意指的“核酸”或“多聚核苷酸”。特别地，“多聚核苷酸”和“核酸”还包括天然核酸的核糖(糖)部分的2’氟代，2’O-甲基化，LNA(锁核酸)，以及2’修饰的其它变体。天然核酸(DNA和RNA分别)在2’核糖位置具有质子或羟基，人工核酸可能含有其它形式的2’修饰，以增加热力学和酶稳定性。因此，具有为稳定性或其它原因而经修饰的2’核糖位置的DNA或RNA是如本文中那个术语所意指的“核酸”或“多聚核苷酸”。如本文所使用的，“核酸序列”和“寡核苷酸”还涵盖如上文所定义的核酸和多聚核苷酸。

术语“药学上可接受的”描述不是生物学上或以其他方式不期望的材料，也就是说，不引起不可接受的水平的不期望的生物效应或不以有害方式相互影响。

如本文所使用的，“药学上可接受的载体或赋形剂”是指可用于制备药物制剂的载体或赋形剂，所述药物制剂通常是安全的、无毒的，并且不是生物学上或以其他方式不希望的，且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的载体或赋形剂。如说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的载体或赋形剂”包括一种和多于一种这样的载体或赋形剂。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在即用前重构为无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等诸如此类)、羧甲基纤维素和其合适的混合物,植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情况下通过维持所需要的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等诸如此类，可以确保防止微生物的作用。还希望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠和类似物。通过包含诸如单硬脂酸铝和明胶的试剂(其延迟吸收)会引起可注射的药物形式的延长吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)的生物可降解聚合物中形成药物微囊基质，制备可注射的贮库型。依赖药物与聚合物的比例和所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。还通过将药物截留在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中而制备可注射贮库制剂。可注射制剂可例如通过细菌截留过滤器过滤或通过加入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在即用之前被溶解或分散于无菌水或其它可注射无菌介质中。合适的惰性载体可以包括诸如乳糖的糖。在一些方面，活性组分颗粒的至少95重量％具有在0.01至10微米范围的有效粒度。

如本文所使用的，术语“预防”是指排除、避免、消除、预防、停止或阻碍某些事情(例如疾病或其症状)发生，特别是通过提前作用。应当理解，除非另外特别指出，否则在本文中使用“减少”、“抑制”或“防止”的情况下，另外两个词的应用也被明确公开。例如，在一个方面，“预防”可以指预防癌细胞的复制或预防癌细胞的转移。术语“预防”包括维持或限制在亚临床状态下的疾病。

如本文所使用的，“自组装”是指核酸(以及在一些情况下是预先形成的核酸纳米结构(例如，晶体))以序列-特异性的方式、以预测的方式，并且在没有外部控制的情况下彼此退火的能力。在一些方面，核酸纳米结构自组装方法包括在单个容器中组合核酸(例如单链核酸或寡核苷酸)并允许核酸基于序列互补性彼此退火。在一些方面，这一退火过程涉及将核酸置于高温下，然后逐渐降低温度以利于序列特异性结合。各种核酸纳米结构或自组装方法是已知的并在本文中记载。

如本文所使用，术语“受试者”是指施用的靶标，例如，动物、人、细胞或细胞群。因此，本文公开的方法的受试者可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。本文公开的方法的受试者可以是人、非人灵长类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不指定特定年龄或性别。因此，意图涵盖成年的和新生的受试者，以及胚胎，且无论雄性或雌性。在一个方面，所示受试者是患者。患者是指患有疾病或病症(诸如例如癌症和/或异常细胞生长)的受试者。术语患者包括人类和兽医受试者。在一个方面，受试者已经被诊断为需要治疗癌症和/或异常细胞生长。

讨论

RNA纳米技术为治疗包括但不限于癌症的疾病提供了巨大的前景。RNA纳米颗粒可用作各种活性剂的载体。然而，当前的RNA纳米颗粒无法基于RNA纳米技术递送。例如，当前的RNA纳米颗粒局限在它们仅能够以RNA纳米颗粒的每条RNA链与一种活性剂缀合。由于RNA纳米颗粒与缀合的活性剂相比尺寸较大，由RNA纳米颗粒携带的活性剂的摩尔浓度低。换句话说，RNA纳米颗粒的负载效率低。这导致通过这些RNA颗粒递送到受试者的活性剂是低量和无效量的，从而使得当前的RNA纳米颗粒不是用于递送活性剂以治疗和/或预防疾病的合适的载体。

虽然解决该问题的直接方法是将更多的活性剂分子缀合至每个RNA纳米颗粒，但是试图以这种方式解决负载效率低的问题的尝试失败。这一失败可至少部分地归因于RNA的折叠能量和解链温度(Tm)。通过共价结合使每个RNA纳米颗粒缀合多个活性剂分子导致RNA纳米颗粒的解离。

除了当前的RNA纳米颗粒负载效率低以外，当前的RNA纳米颗粒还会在全身注射后发生解离。这可能是由于当前的RNA纳米颗粒的物理阻碍、低Tm和/或低热稳定性。

考虑到当前的RNA纳米颗粒的缺陷，本文描述的是可以由一个或多个模块化RNA基序组成的RNA纳米结构。该RNA纳米结构可以负载一种或多种活性剂并且可以具有超高的热稳定性、超高的解链温度和有助于增加负载效率和/或容量的其它物理性质。本文中所描述的含有或不含有活性剂的RNA纳米结构可以施用给受试者。通过审阅下文的附图、具体实施方式和实施例，本公开的其它组合物、化合物、方法、特征和优点对于本领域普通技术人员而言将是显而易见或变得显而易见。所有这些额外的组合物、化合物、方法、特征和优点旨在包括在本说明书内，并且在本公开的范围内。

RNA纳米结构

本文描述的是可以由一个或多个模块化RNA基序组成的RNA纳米结构。所述模块化RNA基序可以各自由3-9条被设计(或配置)以自组装为高度有序的模块化RNA基序的单独的合成RNA寡核苷酸组成。组装时，所述模块化RNA基序可以由可以排布在核心结构域周围的多条双链臂(DA)组成。多个模块化RNA基序可以彼此连接以形成RNA纳米结构。图41A-45B显示模块化RNA基序和RNA纳米结构的各方面。在脑海中形成对于RNA纳米结构的总体理解后，现在更详细地描述模块化RNA基序和RNA纳米结构的各方面。

模块化RNA基序

如上所述，RNA纳米结构可包括一个或多个模块化RNA基序。图41A-41G显示模块化RNA基序的各方面。如图41A-41G所示，模块化RNA基序可以由3、4、5、6、7、8或9条合成的单链RNA寡核苷酸组成，所述合成的单链RNA寡核苷酸能够通过杂交自组装为模块化RNA基序。每条合成的单链RNA寡核苷酸的长度可以为约16至约120个碱基。可以设计每个模块化RNA基序中每条合成的单链RNA寡核苷酸的确切序列，以使得它们在与2个或更多个其它的合成单链RNA寡核苷酸组装时获得特异性的物理特性。RNA基序可以由3、4、5、6、7、8或9个合成RNA寡核苷酸组成。可以设计合成RNA寡核苷酸，以使得它们在自组装后形成高度有序的2-D和/或3-D结构。自组装时，合成RNA寡核苷酸形成高度有序的结构，其在本文中称为模块化RNA基序。例如，如图41A-41G所示，2-D结构可以至少部分地取决于合成RNA寡核苷酸的数目。RNA纳米结构可具有来自核心结构域的3、4、5、6、7、8或9条双链臂(DA)。DA可以对称或非对称地排布在核心结构域周围。

核心结构域可以具有0-4个对称或不对称的突起核苷酸，将各DA分隔，这可以允许优化各环的热力学稳定性、空间限制和/或结构排布。双链序列(DA)和未配对核心核苷酸数量的变化都可以影响模块化RNA基序和/或RNA纳米结构的热力学稳定性。因此，可以通过改变形成模块化RNA基序的合成RNA寡核苷酸的序列而优化物理性质和功能特性。例如，图1B显示模块化RNA基序，其具有3条DA，和在H2和H3DA之间的不对称突起(5’UUU3’)和在H1和H2DA之间的不对称突起(5’U3’)。在另一个实例中，图29C显示含有三条DA的模块化RNA基序，所述三条DA具有不同的不对称突起但相同的DA(在它们的H1|H2|H3DA之间分别是U|UUU|-、-|GG|-和-|C|CU)，从而产生不同的退火Tm值(图30A)。另外，图38A至38G显示具有3-9条DA的模块化RNA基序，在各DA之间具有对称的突起(5’UG3’)。

如41A至41G所示，RNA寡核苷酸自组装，以使得模块化RNA基序包含含有3、4、5、6、7、8或9条DA(图41A至41B中显示的黑色部分)的核心域(图41A至41G中虚线框内部的浅灰色区域)。DA可以排布在核心区域周围，以使得在任何两个相邻DA之间形成角度(θ)。例如，在图41A中，模块化RNA基序包含3段合成RNA寡核苷酸，其自组装形成具有3条DA的模块化RNA基序。在DA₁和DA₂之间形成的角度被记录为θ²，在DA₁和DA₃之间形成的角度被记录为θ³，以及在DA₃和DA₂之间形成的角度被记录为θ¹。图41B至41G关于每幅图中显示的模块化RNA基序具有类似的符号标记。DA可以基本上对称地定位在核心结构域周围。在其它方面，DA不是对称地定位在核心结构域周围。表1显示了图41A至41G中引用的每个模块化RNA基序的角度范围。

表1.模块化RNA基序的角度。

模块化RNA基序的解链温度(Tm)可为约65℃或更高。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可大于65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃。在有些方面，模块化RNA基序的Tm可以是65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从65℃至66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从66至67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从67至68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从68至69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从69至70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从70至71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从71至72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从72至73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从73至74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从74至75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从75至76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从76至77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从77至78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从78至79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从79至80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从80至81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从81至82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从82至83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从83至84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从84至85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从85至86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从86至87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从87至88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从88至89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从89至90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从90至91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从91至92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从92至93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从93至94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从94至95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从95至96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从96至97、98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从97至98、99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从98至99或100℃的范围。在有些方面，模块化RNA基序的解链温度可以在从99至100℃的范围。

合成RNA寡核苷酸

如前文所述，模块化RNA基序可以由3-9段单独的合成RNA寡核苷酸组成，所述合成RNA寡核苷酸可以自组装以形成模块化RNA基序。合成RNA寡核苷酸可以是单链。每段单独的合成RNA寡核苷酸可以由16-120个核苷酸组成。核苷酸可以是天然核糖核苷酸或可以被修饰。在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以是2’修饰的。2’修饰或其它修饰可以2’氟代-、2’O-甲基化-、LNA-或任何其它骨架、糖或碱基修饰的核糖核苷酸，或者天然核糖核苷酸、骨架、糖和碱基修饰的核糖核苷酸的任何组合。修饰在本文的其它部分进一步讨论。每段合成RNA寡核苷酸可以由16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个核苷酸或其中任何范围的核苷酸组成。可以设计和配置每段合成RNA寡核苷酸，以使得它能够与2、3、4、5、6、7或8个其它的合成RNA寡核苷酸一起自组装成如本文其它部分所述的模块化RNA基序。合成RNA寡核苷酸的合理设计在本文其它部分描述。

核苷酸可以是未修饰的核苷酸或修饰的核苷酸。所述修饰可以是5’-末端修饰和/或3’-末端修饰和/或2’-内部糖修饰和/或碱基内部修饰。典型的5’末端修饰包括氨基、羧基、磷酸酯、硫醇、马来酰亚胺、炔、胆固醇、醛、碳间隔区、PEG-间隔区、二重区(doubler)、三重区(trebler)、可光解氨基、可光解间隔区、荧光团(例如，花青素3、3.5、5、5.5、7，荧光素等)、生物素、脱硫生物素，地高辛、猝灭剂(dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等)或本领域有经验的使用者已知的其它5’修饰。典型的3’末端修饰包括氨基、羧基、磷酸酯、硫醇、炔、胆固醇、碳间隔区、PEG-间隔区、荧光团(例如，花青素3、3.5、5、5.5、7，荧光素等)、生物素、脱硫生物素、地高辛、猝灭剂(dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等)或本领域有经验的使用者已知的其它3’修饰。典型的内部修饰包括氨基-dA、氨基-dC、氨基-dT、羧基-dT、2’O-炔丙基、2’-氨基、2’-氟代、2’-甲氧基、5-乙炔基-dU、C8-炔-dC、C8-炔-dT、碳间隔区、PEG-间隔区、荧光团(例如花青素3、3.5、5、5.5、7，荧光素等)、生物素、脱硫生物素、地高辛、猝灭剂(dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等)或本领域有经验的使用者已知的其它5’修饰。修饰可以是与核苷酸连接的炔基。修饰可以是与核苷酸连接的官能团。合适的官能团在本文其它部分描述。存在于每段合成RNA寡核苷酸中的炔基或官能团能够促进货物化合物在包含炔基的位点经由例如点击化学缀合。参见例如图3A。在合成RNA寡核苷酸中，一个或多个末端(例如，5’末端和/或3’末端)核苷酸可以被修饰。合成RNA寡核苷酸的一个或两个末端可以被修饰。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个核苷酸可以被修饰。在有些方面，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个核苷酸可以未被修饰。如果从5’末端至3’末端按顺序地考虑合成RNA寡核苷酸中的每个核苷酸，修饰的核苷酸可以是核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120或其任何组合。在存在多个修饰的核苷酸的情况下，修饰的核苷酸可以彼此相邻，或者可以由一个或多个未修饰的核苷酸间隔开。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个未修饰的核苷酸可以介于两个修饰的核苷酸之间。

在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以具有根据SEQ ID NOs：1-54中的任一个的序列。在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以具有与SEQ ID NOs：1-54中的任一个百分之80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或约99一致的序列。

制备合成RNA寡核苷酸的方法

可以使用标准的分子生物和生物化学技术来合成所述合成RNA寡核苷酸、多聚核苷酸官能团和多聚核苷酸货物化合物。换句话说，可形成RNA纳米颗粒的各种核酸可以根据需要从头合成或由各种核酸表达载体产生或体外转录。这样的合成技术对于本领域技术人员来说是已知的。

RNA纳米结构

在有些方面，单个模块化RNA基序可以是RNA纳米结构。本文还描述了可包括两个或更多个模块化RNA基序的RNA纳米结构。例如，如图42A至42G所示，RNA纳米结构可以是有序的。一级模块化RNA基序(例如图42A 至42G中的黑色模块化RNA基序)可以连接或以其它方式偶联到3-9个额外的模块化RNA基序上以形成中间层(例如图42A至42G中的深灰色模块化RNA基序)。中间层中的每个模块化RNA基序可以连接或以其它方式偶联到3-9个额外的模块化RNA基序上。在有些方面，连接或以其它方式偶联到RNA纳米结构的中间层上的模块化RNA基序可以形成RNA纳米结构的末端层或外层(例如图42A至42G中浅灰色的模块化RNA基序)。在其它实施方案中，连接或以其它方式偶联到RNA纳米结构的中间层上的模块化RNA基序可以形成另一个中间层。在有些方面，RNA纳米结构可具有模块化RNA基序的1个中间层。将理解的是，可以连接或以其它方式偶联到其上的模块化RNA基序的总数仅受模块化RNA基序中DA的数量的限制。连接或偶联可以在构成模块化RNA基序的合成的寡核苷酸的3’端和/或5’端发生。

在有些方面，RNA纳米结构可以是均质的(例如，包含在RNA纳米结构中的所有模块化RNA基序可以是相同的)。在有些方面，RNA纳米结构可以是异质的(例如，包含在RNA纳米结构中至少两个模块化RNA基序在一个或多个以下特征中彼此不同：DA的数目、寡核苷酸序列的长度和/或寡核苷酸序列)。RNA纳米结构的层可以是均质的(例如，给定层中的每个模块化RNA基序可以是相同的)。RNA纳米结构的层可以是异质的(例如，包含在层中的至少两个模块化RNA基序在以下特征中的至少一个中彼此不同：DA的数目、寡核苷酸序列的长度，和/或寡核苷酸序列)。在有些方面，RNA纳米结构的一个或多个层可以各自是均质的，但RNA纳米结构可以是异质的，因为RNA纳米结构中的两个或更多个模块化RNA基序关于以下特征中的一个或多个彼此不同：DA的数目、寡核苷酸序列的长度，和/或寡核苷酸序列。图42A至42G显示包含均质的层的均质RNA纳米结构的方面。图43显示包含均质的层的异质RNA纳米结构的一个方面。如图43中所示，在有些方面，每个层可以由具有不同数目的DA的模块化RNA基序组成。在有些方面，异质RNA纳米结构可含有均质的层和至少一个异质的层。在有些方面，如果RNA纳米结构在基序中、层中或跨过一个或多个层加载一种或多种不同的货物化合物，则所述RNA纳米结构可以被认为是异质的。

本文所述的RNA纳米结构可具有高热稳定性或超高热稳定性，如在本文中经由在qPCR中的颗粒退火或在热梯度凝胶分析(TGGE)中的颗粒解离进行Tm测量而定义。本文所述的RNA纳米结构可具有高解链温度或超高解链温度(Tm)。RNA寡核苷酸通常表现长度依赖的的解链温度，其对于长的杂交双链在70-75℃达到稳定。所述双链的修饰和疏水分子缀合降低RNA双链的稳定性并因此导致较低的解链温度和解离形成单独的链，从而导致体内酶解消化。适于携带高密度官能团的RNA纳米结构具有约70℃或更高的Tm。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可高于65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以是65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从65℃至66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从66至67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从67至68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从68至69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从69至70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从70至71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从71至72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从72至73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从73至74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从74至75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从75至76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从76至77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从77至78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从78至79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从79至80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从80至81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从81至82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从82至83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从83至84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从84至85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从85至86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从86至87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从87至88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从88至89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从89至90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从90至91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从91至92、93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从92至93、94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从93至94、95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从94至95、96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从95至96、97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从96至97、98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从97至98、99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从98至99或100℃的范围。在有些方面，RNA纳米结构的解链温度可以在从99至100℃的范围。

在有些方面，核心模块化RNA基序的Tm可以大于形成中间层的模块化RNA基序的Tm，其可以大于形成末端层或最外层的模块化RNA基序的Tm。应当理解，在存在多个中间层的情况下，形成最内层中间层的模块化RNA基序的Tm可以大于形成最外层中间层的模块化RNA基序的Tm。位于最内层中间层和最外层中间层之间的任何中间层可具有Tm低于形成最内层中间层的模块化RNA基序的Tm、高于形成最外层中间层的模块化RNA基序的Tm、并且可以随着距最内部层中间层的距离而降低的模块化RNA基序。这一特征可导致可在高于模块化RNA基序的测量的Tm值的温度下发生的热力学驱动的纳米结构组装(图33A)。这进一步通过以与各模块化RNA基序的Tm成比例的速率使每个层脱落而可以允许有效负载释放的热力学机制(图33D)。

当沿着其最长或最大尺寸测量时，RNA纳米结构可具有高达微米的大小。当沿着其最长或最大尺寸测量时，RNA纳米结构的大小可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或约900nm。在有些方面，当沿着其最长或最大尺寸测量时，RNA纳米结构的大小可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100nm或其中的值的任何范围。在有些方面，当沿着其最长或最大尺寸测量时，RNA纳米结构的大小可为约1-30、1-40、1-50、10-50、10-40、10-30、30-50、30-40或40-50nm。在有些方面，RNA纳米结构可以大体上是球形的。在其它方面，RNA纳米结构可以是三角形平面、三角锥体、T形、四面体、方形平面、交互的、三角双锥体、四方锥体、五角平面、八面体、三角棱柱，五角椎体、五角双锥体、四角反棱柱、三帽三角棱柱、单盖四角反棱柱、箭头形、箭尾形、X形，或任何这些形状的变形形式。

负载的和/或功能化的RNA纳米结构

构成本文中所描述的RNA纳米结构的模块化RNA基序可提供各种位点,货物化合物和/或官能团可在这些位点处连接到或以其它方式偶联到模块化RNA基序。通过将货物化合物和/或官能团连接到或以其它方式偶联到模块化RNA基序，RNA纳米结构可以负载一种或多种货物化合物和/或用一种或多种官能团官能化。货物化合物和/或官能团可以在RNA纳米结构被组装之前或之后被连接到或以其它方式被偶联到模块化RNA基序。

货物化合物和/或官能团可以被连接到或以其它方式被偶联到RNA纳米结构中的模块化RNA基序的一个或多个DA的5’末端和/或3’末端(参见例如图1C)。如前文所讨论的，构成模块化RNA基序的合成RNA寡核苷酸的一个或多个核苷酸可以被修饰，以使得官能团或货物化合物的连接或偶联可以发生在该核苷酸上。在有些方面，修饰的核苷酸在RNA寡核苷酸中可以存在于这样的位置，以使得当组装成模块化RNA基序时，修饰的核苷酸存在于DA中(参见例如图16A-16B和图18)。因此，模块化RNA基序可以在模块化RNA基序的DA中的一个或多个核苷酸处负载货物化合物和/或官能团。存在于RNA纳米结构中的模块化RNA基序可以在每个DA的5’末端和/或3’末端和/或每个DA中的一个或多个内部核苷酸(例如，修饰的核苷酸)处被负载。

在有些方面，RNA纳米结构中的模块化RNA基序的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、至600或更多个末端可用于连接或偶联至货物化合物或官能团。在有些方面，RNA纳米结构中的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950至1000或更多个核苷酸可用于修饰和/或连接或偶联至货物化合物或官能团。因此，只要RNA纳米结构在被负载时是稳定的并且负载不违反化学或物理限制(例如，位阻)，则可以连接到或以其它方式偶联到RNA纳米结构的货物化合物和/或官能团的数目可以与那些可用于负载的位点的数目相同。

RNA纳米结构可以负载单一类型的货物化合物。RNA纳米结构可以负载单一类型的官能团。RNA纳米结构可以负载2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多类型的货物化合物。RNA纳米结构可以负载2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多类型的官能团。

在包含多层的RNA纳米结构中，所有层可以负载相同的货物化合物和/或官能团类型。在有些方面中，在包含多层的RNA纳米结构中，两层或更多层可以负载不同的货物化合物和/或官能团类型。在一个非限制性实例中，三层RNA纳米结构可以在核心层中负载一种或多种类型的货物化合物(例如一种或多种类型的货物化合物的20至100个分子)，由可负载内体逃逸和/或放射-MRI-荧光成像形态的第二层(或中间层)屏蔽，并且最终由末端层或最外层进行保护，其在末端层暴露于溶剂的端部负载靶标和/或增强生物分布的官能团(图46B)。如图32D所示，两层通过将内层的合成寡核苷酸与外层的合成寡核苷酸之一偶联而连接。因此，层的结合由组成颗粒的层的Tm控制，然后其可以用于确定特定官能团层的释放曲线。或者，层可通过pH、光或酶敏感的化学基团偶联，以在一旦满足期望的环境条件，诸如细胞摄入低pH的内体或溶酶体时，诱导释放。

图44A至44B显示负载单一类型的货物化合物或官能团的RNA纳米结构的方面。黑色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块化RNA基序。深灰色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的二级或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的末端或最外层水平的模块化RNA基序。

图45A至45B显示负载多种类型的货物化合物和/或官能团(包括但不限于活性剂)的RNA纳米结构的方面。黑色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的核心或一级模块化RNA基序。深灰色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的二级或中间水平的模块化RNA基序。浅灰色的模块化RNA基序指示包含在RNA纳米结构中的末端或最外层水平的模块化RNA基序。

图46A至46B显示负载多种类型的货物化合物和/或官能团(包括但不限于紫杉醇)的RNA纳米结构的方面。图46A.具有模块化RNA基序的纳米结构，所述模块化RNA基序包含具有内部修饰的延长的核心，所述内部修饰允许活性剂特异性连接至纳米结构的核心。图46B.具有不同官能团的纳米结构，所述官能团连接至每一层中的寡核苷酸的5’末端或3’末端。

货物化合物和官能团

如前文所述，RNA纳米结构可以包含一种或多种货物化合物和/或一个或多个官能团。在有些方面，可以被连接或以其它方式被偶联至RNA纳米结构的单个化合物或分子可以是货物化合物和官能团。如本文上下文中所使用的，术语“货物化合物”是指可以如本文所述被负载到RNA纳米结构上并且可以被递送至受试者(例如，通过从RNA纳米结构释放，或甚至当被连接或以其它方式偶联至RNA纳米结构时在与受试者接触时在受试者中引发生理反应)的任何分子、化合物或组合物。如本文上下文中使用的术语“官能团”是指将功能性加入到RNA纳米结构中的化合物。货物化合物或官能团可以是任何生物分子、化学分子、合成分子或任何其它分子，其可以如本文所述由本文所述的RNA纳米结构封装，连接至和/或结合至如本文所述的RNA纳米结构。货物化合物和/或官能团可以是活性剂。在有些方面，货物化合物可以由RNA纳米结构或其组分封装，连接至和/或结合至RNA纳米结构或其组分。

在有些方面，货物化合物和/或官能团可以是DNA、RNA、修饰的核糖核苷酸、氨基酸、肽、多肽、抗体、适体、适体酶、核糖开关、核糖酶、抑制必需肿瘤蛋白质和基因的翻译或转录的核糖酶的引导序列、激素、免疫调节剂、退热剂、镇静剂，抗精神病药、镇痛剂、解痉剂、抗炎药、抗组胺剂、抗感染剂和化学治疗剂(抗癌药)。其它合适的货物化合物包括可使细胞或受试者对治疗或预防和成像或其它诊断剂更响应(或敏感)的敏化剂(例如，辐射敏化剂)。RNA纳米结构可以被用作单药治疗或与其它活性剂组合用于治疗或预防疾病或病症。

合适的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺素释放激素、抗利尿激素、胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素，和促甲状腺激素)、类花生酸(例如花生四烯酸、脂氧素和***素)，和类固醇激素(例如***、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。

合适的免疫调节剂包括但不限于强的松、咪唑硫嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、氨甲蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子，和咪喹莫特)、趋化因子(例如，CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体，和适体)。

合适的退热剂包括但不限于非类固醇抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬，和尼美舒利)、阿司匹林和相关的的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁，和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/醋氨酚、安乃近、纳布美通、安替比林，和奎宁。

合适的镇静剂包括，但不限于，苯二氮卓类(例如，阿普***、溴西泮、氯氮卓、氯硝西泮、氯拉酸、***、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮，***仑，和托非索泮)、血清素能(serotenergic)的抗抑郁药(例如，选择性血清素再摄取抑制剂，三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)，mebicar、afobazole、selank、溴曼特(bromantane)、美昔得乐(emoxypine)、阿扎哌隆、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多和β-受体阻滞剂。

合适的抗精神病药包括，但不限于，苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆(pipaperone)、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、地西拉嗪(dizyrazine)、氟非那嗪、左美丙嗪、美索达嗪、丙拉嗪、哌氰嗪、羟哌氯丙嗪、哌普嗪、普鲁氯嗪、普马嗪、异丙嗪、氮丙嗪、硫丙拉嗪、硫醚嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨、珠氯噻醇、氯噻平、克噻平、氮丙嗪、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、维拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、鲁拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奥氮平，帕潘立酮、哌罗匹隆、喹硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、三甲丙咪嗪、齐拉西酮、佐替平、alstonie、联苯芦诺、生物蝶呤、依匹哌唑、***二酚、卡利拉嗪、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、诺美林，和齐洛那平(zicronapine)。

合适的镇痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非类固醇抗炎药(例如，布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如，罗非昔布、塞来昔布，和依托昔布)、阿片样物质(例如，***、可待因、氧可酮、氢可酮、二氢***、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵、去甲肾上腺素、氟西汀、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、***、凯托米酮、哌腈米特,和阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如，水杨酸胆碱，水杨酸镁，和水杨酸钠)。

合适的解痉剂包括，但不限于，美贝维林(mebeverine)、罂粟碱(paverine)、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林。

合适的抗炎药包括但不限于强的松、非胆固醇抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如，罗非昔布、塞来昔布和依托昔布)，和免疫选择性抗炎性衍生物(例如，颌下肽-T及其衍生物)。

合适的抗组胺剂包括，但不限于，H₁-受体拮抗剂(例如，阿伐斯汀、氮卓斯汀，比拉斯汀、溴苯那敏、布克利嗪、溴马嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、氯马斯汀、赛庚啶、地氯雷他定、右旋溴苯那敏、右旋氯苯那敏、茶苯海明(dimenhydrinate)、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羟嗪、左西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、嘧啶胺、喹硫平，卢帕他定、曲吡那敏和曲普利啶)、H₂-受体拮抗剂(例如，西咪替丁、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁)、曲托喹啉、儿茶素、色甘酸盐(Cromoglicate)、奈多罗米、和β2-肾上腺素能激动剂。

合适的抗感染剂包括，但不限于，抗阿米巴药(例如，硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、磺甲硝咪唑(tnidazole)、氯喹，和双碘喹啉)、氨基糖苷类(例如，巴龙霉素，妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素，和新霉素)、驱肠虫药(例如，噻嘧啶、甲苯咪唑、伊维菌素、吡喹酮、阿苯达唑、米替福辛、噻苯达唑、奥氨尼喹)、抗真菌剂(例如，氮杂茂抗真菌剂(例如，伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑，和伏立康唑)、棘白菌素(例如，卡泊芬净、阿尼芬净，和米卡芬净)，灰黄霉素、特比萘芬、氟胞嘧啶，和多烯类(例如，制霉菌素和两性霉素b)、抗疟药(例如，乙胺嘧啶/磺胺多辛、青蒿素甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍，奎宁、羟基氯喹、甲氟喹、氯喹、强力霉素、乙胺嘧啶，和卤泛曲林)、抗结核剂(例如，氨基水杨酸盐(例如，氨基水杨酸)、异烟肼/利福平、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素，和环丝氨酸)、抗病毒剂(例如，金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦/拉米夫定、恩曲他滨/替诺福韦、可比司他/elvitegravir/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/洛匹那韦/利托那韦/替诺福韦，干扰素α-2v/利巴韦林、PEG干扰素α-2b、马拉韦罗、雷替格韦、度鲁特韦、恩夫韦地、膦甲酸、福米韦生、奥司他韦、扎那米韦、奈韦拉平、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉韦定、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、阿巴卡韦(avacivr)、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨(xalcitabin)、替比夫定、西咪匹韦、波普瑞韦、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、福沙那韦、地瑞那韦、利托那韦、替拉那韦、阿扎那韦、奈非那韦、安普那韦、茚地那韦、沙奎那韦(sawuinavir)、利巴韦林、伐昔洛韦(valcyclovir)、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦，和缬更昔洛韦)、碳青霉烯类(例如，多利培南、美罗培南、厄他培南，和西司他丁/亚胺培南)、头孢菌素(例如，头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑林、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林(ceflaroline)、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁，头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松钠、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢去甲噻肟(cefizoxime)，和头孢他啶)、糖肽抗生素(例如，万古霉素、达巴万星、奥利万星，和特拉万星(telvancin))，甘氨环素类(例如，替加环素)、抗麻风药(例如，氯法齐明和沙利度胺)、林可霉素及其衍生物(例如，克林霉素和林可霉素)、大环内酯类及其衍生物(例如，泰利霉素、非达霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素，和醋竹桃霉素)、利奈唑胺、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、利福昔明、氯霉素、磷霉素，甲硝唑、氨曲南、杆菌肽、β-内酰胺抗生素(苄星青霉素(苯乍生和苄基青霉素)、苯氧甲基青霉素、氯洒西林、氟氯西林(flucoxacillin)、甲氧西林、替莫西林、美西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林，阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素、苯唑西林、双氯西林、奈夫西林、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢菌素C、先锋霉素、头孢克洛，头孢羟唑、头孢呋辛、头孢替坦、头孢西丁、头孢克肟(cefiximine)、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢吡肟、头孢匹罗、头孢洛林、比阿培南、多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、沙纳霉素、氨曲南(azrewonam)、替吉莫南、诺卡霉素A、taboxinine，和β-内酰胺)、喹诺酮(例如，洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星，和司帕沙星)、磺胺类(例如，磺胺甲恶唑/甲氧苄啶，柳氮磺吡啶，和磺胺异噁唑)、四环素类(例如，强力霉素、地美环素、米诺环素、强力霉素/水杨酸、强力霉素/ω-3多不饱和脂肪酸，和四环素)，和***抗感染剂(例如，呋喃妥因、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄啶，和亚甲基蓝)。

合适的化学治疗剂包括，但不限于，紫杉醇、喜树碱、本托昔单抗(brentuximabvedotin)、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸盐、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨，奥法木单抗、贝伐单抗、贝利司他、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、道诺霉素、氯法拉滨、卡博替尼、放线菌素D，雷莫芦单抗、阿糖胞苷、环磷酰胺、环磷酰氮芥、地西他滨、***、多西他赛、羟基脲、氮烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、氨磷汀、依托泊苷、氟他米特、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、氨甲蝶呤、氟尿苷、阿托珠单抗、吉西他滨，阿法替尼、甲磺酸伊马替尼、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索替尼、卡巴他赛、ado-曲妥珠单抗美坦新偶联物、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司钠、氯化锶-89、二氯甲基二乙胺、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭、PEG非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素(deneukin diftitox)、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来膦酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽、达沙替尼、瑞戈非尼、组胺瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗、高三尖杉酯碱、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤(tioguanine))、达拉非尼、厄洛替尼、贝沙罗丁、替莫唑胺、噻替派、沙利度胺、BCG、替西罗莫司、苯达莫司汀盐酸盐、曲普瑞林、三氧化二砷(aresnictrioxide)、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维甲酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、易普利姆玛、戈舍瑞林、伏立诺他、艾代拉里斯、色瑞替尼、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷(tafluposide)、咪唑硫嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛、全反式维甲酸，和本文其它处列出的其它抗癌剂。

合适的敏化剂可包括但不限于放射敏化剂、胰岛素敏化剂(例如，二甲双胍、噻唑烷二酮、)和用于光动力疗法的光敏剂(例如，氨基乙酰丙酸(ALA)、硅酞菁Pc4、m-四羟基苯基二氢卟酚(mTHPC)，和单-L-天冬氨酰二氢卟吩e6(NPe6)。

合适的显像剂包括但不限于荧光分子(例如，Cy3、Cy5、ICG，和其它可商购的荧光团)、顺磁性离子、可含有顺磁性离子的纳米颗粒、超顺磁性的氧化铁分子及其纳米颗粒，18F-氟脱氧葡萄糖和其它PET显像剂、含有钆的造影剂、放射性核素和其组合物。

在有些方面，官能团可以是靶向部分。如在这一语境中所使用的，短语“靶向部分”是指在递送至受试者后可导致RNA纳米结构被特异性地定向至受试者中的位置、细胞类型、器官，或结构的化合物、分子或任何其它组合物。靶向部分可以包括化合物和分子，诸如抗体、适体和受体配体。

合适的靶向部分包括但不限于与下列结合的适体和配体：表皮生长因子受体(EGFR)、***特异性膜抗原受体(PSMA)、上皮细胞粘附分子(EpCam)、血管内皮生长因子(VEGF)、半乳糖受体、叶酸受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、CD受体、整联蛋白、转铁蛋白受体、成纤维细胞生长因子(FGFR)、σ受体(SR)，和/或表皮生长因子受体(EGFR)，或化学配体诸如叶酸、半乳糖和GalNAc。

在有些方面，官能团/货物化合物可以是螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于NOTA、DOTA、EDTA、恩瑞格(Exjade)、二巯基丁二酸、甲磺酸去铁胺、去铁酮、Jadenu，和***恩汀(Syprine)。

在有些方面，官能团/货物化合物可以是疏水的。在有些方面，官能团和/或货物化合物可以是亲水的。在有些方面，官能团和/或货物化合物可以带正电荷。在有些方面，官能团和/或货物化合物可以带负电荷。在有些方面，官能团和/或货物化合物可以是电中性的。在有些方面，官能团和/或货物化合物可以是不带电荷。

在有些方面，靶向部分特异性靶向癌细胞。在有些方面，靶向部分是EGFR、HER2，和/或EP-CAM适体或PSM抗原，或叶酸。在有些方面，靶向部分是EGFR的配体。在其它方面，靶向部分靶向血液、肺、肾、脑组织、神经元、肌肉、心脏、腱、韧带、肝、胰腺，或其它特定的组织。

在有些方面，官能团可以促进货物分子的连接。如本文其它部分所述，构成合成RNA寡核苷酸的核苷酸可以被修饰。除了炔之外，合成RNA寡核苷酸可以被诸如接头的官能团修饰。使用用于定时的触发式释放的热力学、酸不稳定、光敏，或酶不稳定的化学基团，个别的官能团可以被连接或以其它方式偶联至合成RNA寡核苷酸和/或货物化合物或额外的官能团。在有些方面，官能团可以是刺激响应接头，诸如可光解接头、pH响应接头，或酶可切割的接头。可光解接头是含有可由特定波长的光裂解的光不稳定基团的分子。所述可光解接头可以可裂解地将货物分子或其它功能部分(例如，靶向部分)连接至RNA纳米颗粒。这是其中货物分子从RNA纳米颗粒释放可以被调节和控制的另一种机制。所述可光解接头可通过电磁辐射源(包括但不限于可见光、红外辐射、紫外辐射)被激活(例如，裂解)。使用可光解接头可允许对货物分子从RNA纳米颗粒的释放进行时间控制和空间控制。示例性的可光解接头可包括但不限于亚磷酰胺(参见例如，Olejnik et al.,Nucleic Acids Res.(1998)；26:3572-3576；Olejnik et al.Nucleic Acid Res.(1999),27:4626-4631；和Tanget al.,Nucleic Acid Res(2002),38:3848-3855,Gene Link目录号26-6888)、可光解的生物素(参见例如，Olejnik et al.,Nucleic Acids Res.(1998)；26:3572-3576；Olejnik etal.Nucleic Acid Res.(1999),27:4626-4631；和Tang et al.,Nucleic Acid Res(2002),38:3848-3855,Gene Link目录号26-6691)、可光解的氨基C6(参见例如，Olejnik et al.,Nucleic Acids Res.(1998)；26:3572-3576；Olejnik et al.Nucleic Acid Res.(1999),27:4626-4631；和Tang et al.,Nucleic Acid Res(2002),38:3848-3855,Gene Link目录号26-6890)、可光解的间隔区(参见例如，参见例如，Olejnik et al.,Nucleic Acids Res.(1998)；26:3572-3576；Olejnik et al.Nucleic Acid Res.(1999),27:4626-4631；和Tanget al.,Nucleic Acid Res(2002),38:3848-3855,Gene Link目录号26-6889)；2-硝基苄基接头(参见例如，Bai et al.,(2003)PNAS,100:409-413)。本领域普通技术人员将理解其它合适的可光解接头。

在有些方面，所述接头可以是pH响应接头。pH响应接头可以是能在一定的定pH降解(例如水解)的任何化合物。因此，pH响应接头可以是酸响应的或碱性响应的。所述pH响应接头可以是聚合物。合适的pH响应接头在本领域中通常是已知的，并且包括但不限于在以下中所描述的那些：Choy et al.(Bioconjugate.Chem.(2016)27:824-830；Schmaljohann(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.(2006)58:1655-1670,Balamuralidhara et al.(2011)Am.J.Drug Disc.Devel.1:24-48；Biomedical Nanomaterials,ed.Zhao and Shen(2016),第6章；Masson et al.(2004)J.Control Release.99:423-434；Karimi et al.,Nanomed.and Nanobiotech.(2016)8:696-716；国际专利申请公开WO2016/028700；和Patilet al.,2012.Int.J.Mol.Sci.13:11681-11693。

在有些方面，所述接头可以是酶可切割接头。酶可切割接头是含有酶的切割位点的接头。在有些方面，所述接头可以是含有针对核酸内切酶的序列的核酸。本领域普通技术人员将理解核酸内切酶切割位点和如何产生含有它们的核酸分子。可以包含的其它切割位点可以是RNA酶或DNA酶切割位点。在有些方面，酶可切割位点可以是针对对靶细胞特异的酶的切割位点。因此，以这种方式，释放可以被控制，以使得其通过与靶细胞特异性酶的相互作用而仅在靶细胞处发生。在有些方面，所述接头可以是化学基团，其可以由诸如酯酶的酶裂解或水解。本领域技术人员将立即理解可加入所述酶可切割接头中的其它切割位点。

模块化RNA基序和RNA纳米结构的合理设计

设计自组装核酸纳米结构的原理是编码核酸链中的序列互补性，以使得所述核酸链在适当的物理条件下通过配对互补片段而自组织为预定的纳米结构。根据这一基本原理(参见例如，Seeman N.C.J.Theor.Biol.99:237,1982，通过引用并入本文)，研究人员已经创造了各种各样的合成核酸纳米结构(参见例如，Seeman N.C.Nature 421:427,2003；ShihW.M.et al.Curr.Opin.Struct.Biol.20:276,2010，其每一篇通过引用并入本文)。根据本公开可使用的核酸(例如，DNA)纳米结构和产生这样的结构的方法的实例是已知的并且包括，但不限于，网格(参见例如，Winfree E.et al.Nature 394:539,1998；Yan H.etal.Science 301:1882,2003；Yan H.et al.Proc.Natl.Acad.ofSci.USA 100；8103,2003；Liu D.et al.J.Am.Chem.Soc.126:2324,2004；Rothemund P.W.K.et al.PLoS Biology 2:2041,2004，其每一篇通过引用并入本文)，带状(参见例如，Park S.H.et al.Nano Lett.5:729,2005；Yin P.et al.Science 321:824,2008,其每一篇通过引用并入本文)、管状(参见例如，Yan H.Science,2003；P.Yin,2008其每一篇通过引用并入本文)、具有限定形状的有限二维和三维物体(参见例如，Chen J.et al.Nature 350:631,1991；Rothemund P.W.K.,Nature,2006；He Y.et al.Nature 452:198,2008；Ke Y.et al.Nano.Lett.9:2445,2009；Douglas S.M.et al.Nature 459:414,2009；Dietz H.et al.Science 325:725,2009；Andersen E.S.et al.Nature 459:73,2009；Liedl T.et al.Nature Nanotech.5:520,2010；Han D.et al.Science 332:342,2011，其每一篇通过引用并入本文)，和宏观晶体(参见例如，Meng J.P.et al.Nature 461:74,2009，通过引用并入本文)。合成RNA寡核苷酸可以是单链核酸、双链核酸或单链和双链核酸的组合。

RNA纳米结构组分(合成RNA寡核苷酸和模块化RNA基序可以使用本文所述的计算机辅助设计方法来设计。尽管使用特定的RNA纳米结构演示了计算机设计，但是应当理解，本领域技术人员能够将其中教导的原理外推至任何希望的RNA纳米结构。

每个合成RNA寡核苷酸可以被设计成使得当其与2个或更多个额外的合成RNA寡核苷酸组合时，发生碱基配对以产生具有围绕核心结构域的3个或更多个DA的高度有序的2-D和3-D结构，所述核心结构域可以包含或不包含链之间的碱基配对，并且可以包括在DA之间形成对称或不对称突起的0-4个核苷酸。每个合成RNA寡核苷酸可以被设计成包括16-120个核苷酸。每个合成RNA寡核苷酸可以被设计成包括1个或更多个修饰的核苷酸。核苷酸修饰在本文其他地方描述。设计成包括多于一个修饰的合成RNA寡核苷酸可以被设计成使得修饰的核苷酸被一个或多个未修饰的核苷酸分隔。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个未修饰的核苷酸可以分隔两个修饰的核苷酸。

本文所述的合成RNA寡核苷酸和/或RNA纳米结构的合理设计可以在计算环境中进行。所述计算环境可以包括一个或多个计算设备，所述计算设备可以包括至少一个处理器电路，例如，其可以具有处理器和存储器。根据本公开的各方面，各种应用和/或其他功能可以在所述计算环境中被执行。而且，各种数据可以被存储在可由计算环境访问的一个或多个数据存储中。

在计算环境中被执行的组件例如可以包括合理的RNA设计系统和本文未详细讨论的其他应用、服务、过程、系统、引擎，或功能。所述合理的RNA设计系统可以被执行以促进如本文所述的合成RNA寡核苷酸和/或RNA纳米结构的设计。合理的RNA设计系统也可执行可与RNA寡核苷酸的设计(诸如本文所述的那些合成RNA寡核苷酸和/或RNA纳米结构)相关的各种后端功能。

如图48中所示，合理的RNA设计系统可以被执行以动态地创造可以被用于产生如本文所述的RNA纳米结构的合成RNA寡核苷酸序列。所述合理的RNA设计系统可产生、鉴定和/或选择可与一种或多种其它合成RNA寡核苷酸序列(其也可通过合理的RNA设计系统产生)相容并自组装以形成如本文所述的RNA纳米结构的合成RNA寡核苷酸序列。所述合理的RNA设计系统还能够鉴定不能与一种或多种其它的合成RNA寡核苷酸序列相容以形成如本文所述的RNA纳米结构的合成RNA寡核苷酸序列。

所述合理的RNA设计系统可以应用一种或多种优化算法以确定可相容并形成如本文所述的RNA纳米结构的合适或最佳的合成RNA寡核苷酸序列，所述算法至少部分基于RNA寡核苷酸和/或RNA纳米结构的GC含量、两段或更多段RNA寡核苷酸和/或RNA纳米结构的Tm、RNA寡核苷酸自发二聚化的概率和/或能力、合成RNA寡核苷酸的交叉互补性、RNA和包含修饰的核酸的寡核苷酸之间的转化，和/或合成RNA寡核苷酸的其它数据或属性。

如图48中所示，合理的RNA设计系统可产生如本文其它地方所述的各种理论双链臂(DA)(在图48中产生DA序列)。所述合理的RNA设计系统在被执行时可以接着确定所形成的理论DA的GC含量是否在希望的GC范围内。可以由用户设置希望的GC范围。在有些方面中，所述GC范围可从约50％至51、52、53、54、55、56、57、58、59，或约60％。在有些方面，所述GC范围可为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59，或约60％。如果所形成的理论DA不在希望的GC范围内，希望的Tm范围内和/或可以自发二聚化，则所述理论DA被舍弃。如果理论DA在期望的GC范围内，在期望的Tm内，并且不自发二聚化，则理论DA可以被保存。然后，被接受的DA可以被所述合理的RNA设计系统用于选择可以形成被接受的DA的一组寡聚物。

如图48中所示，所述合理的RNA设计系统可以选择用于一组寡聚物的DA。所述合理的RNA设计系统可以计算被保存的一组(两个或更多个)DA的交叉互补性。具有最高的交叉互补性的DA可以被丢弃，且具有最低的总体交叉互补性的DA可以被保存。

如图48中所示，所述合理的RNA设计系统可以使用具有最低的总体交叉互补性的DA来计算寡聚物序列。所述合理的RNA设计系统可计算DA序列的反向补序列，计算延伸RNA寡聚物序列，和可以计算终止寡聚物序列。通过确定所计算的RNA寡聚物序列是否自发二聚化和/或可形成二聚体，所述合理的RNA设计系统可以从各种所计算的RNA寡聚物序列中确定合适的寡聚物序列。所述合理的RNA设计系统可以保存不自发二聚化并且不形成二聚体的那些计算的RNA寡聚物序列，并且可以丢弃确实自发二聚化或形成二聚体的那些计算的RNA寡聚物序列。如果被保存的计算的RNA寡聚物序列是使用DNA序列(例如cDNA)产生的，则所述合理的RNA设计系统可转换为RNA序列。被转换的序列可以被保存。

接下来，提供对计算环境的技术设备的讨论。存储在存储器中的是数据和可由处理器执行的若干组件。存储在存储器中的也可以是数据存储和其他数据。许多软件组件被存储在存储器中并且可由处理器执行。在这方面，术语“可执行的”意指以最终可由处理器运行的形式存在的程序文件。可执行程序的实例可以是，例如，可以被翻译为机器代码(其为可以被加载到一个或多个存储器设备的随机存取部分并由处理器运行的格式)的编译程序、可以以诸如目标代码(其能够被加载到一个或多个存储器设备的随机存取部分并由处理器运行)的格式被表达的代码，或者可以被另一个可执行程序解读以在存储器设备的随机存取部分产生待由处理器执行的指令的代码。可执行程序可以被存储在存储器设备的任何部分或组件中，所述存储器设备包括例如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器、固态驱动器、USB闪存驱动器、存储卡、诸如高密度光盘(CD)或数字多功能光盘(DVD)的光盘、软盘、磁带，或其他存储器组件。

存储器可以包括易失性和非易失性存储器和数据存储组件两种。此外，处理器可以表示多个处理器和/或多个处理器核，并且一个或多个存储器设备可以表示在并行处理电路中分别操作的多个存储器。存储器设备也可以表示各种类型存储设备的组合，诸如RAM、大容量存储设备、闪存，或硬盘存储器。在这种情况下，局部接口可以是有助于在多个处理器中的任意两个之间或者在任何处理器和任何存储器设备之间进行通信的适当网络。局部接口可以包括附加系统，其被设计以协调这一通信，包括，例如，执行负载平衡。处理器可以具有电构造或一些其他可用的构造。

虽然本文所述的合理的RNA设计系统和其它各种系统可以体现在由如上文所讨论的通用硬件所执行的软件或代码中，作为替代，其还可以体现在专用硬件中或软件/通用硬件和专用硬件的组合中。如果被呈现在专用硬件中，则每个可以被实现为采用许多技术中的任何一种或组合的电路或状态机。这些技术可以包括具有用于在应用一个或多个数据信号时实现各种逻辑功能的逻辑门的分立逻辑电路、具有适当逻辑门的专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)，或其它组件。

流程图显示了本文中所描述的组件的部分的实施的功能性和操作的实例。如果被体现在软件中，则每个框可以表示代码的模块、片段或部分，所述代码可以包括实施规定的逻辑功能的程序指令。所述程序指令可以体现为源代码的形式，所述源代码可以包括以编程语言编写的人可读语句或者机器代码，所述机器代码可以包括诸如计算机系统或其他系统中的处理器的适当执行系统可识别的数字指令。所述机器代码可以从源代码转换。如果被体现在硬件中，则每个框可以代表电路或多个互连电路以实施规定的逻辑功能。

尽管流程图展示了特定的执行顺序，但应理解，执行顺序可不同于所描述的顺序。例如，两个或更多个框的执行顺序相对于所显示的顺序可以被打乱。此外，连续显示的两个或更多个框可以同时执行或者部分同时执行。进一步，在一些实例中，附图中显示的一个或多个框可以被跳过或省略。

此外，本文中所描述的包括软件或代码的任何逻辑或应用可呈现在任何非暂时性的计算机可读介质中以供指令执行系统(诸如，例如，计算机统或其他系统中的处理器)使用或与其结合使用。在这个意义上，所述逻辑可以包括，例如，包括可以从计算机可读介质获取并由指令执行系统执行的程序代码、指令和声明的语句。在本申请的上下文中，“计算机可读介质”可以是可以包含、存储或维护本文中所描述的逻辑或应用的任何介质，其由指令执行系统使用或与指令执行系统结合使用。

RNA纳米结构制剂

本文还提供药物制剂，其可以包括一定量本文所述的RNA纳米结构和适于向需要其的个体施用的药物载体。所述需要其的个体可以患有或可以被怀疑患有癌症，遗传疾病或病症，病毒、细菌、真菌和/或寄生虫感染，或需要治疗或预防的其它疾病或病症。在有些方面，需要其的受试者需要诊断程序，例如成像程序。所述药物配方可以包括一定量本文所述的RNA纳米结构，其可有效治疗或预防癌症，遗传疾病或病症，病毒、细菌、真菌和/或寄生虫感染，或其它疾病或病症，或对受试者或其部分的成像是有效的。

制剂可以通过任何合适的施用途径施用。例如，制剂(和/或组合物)可以口服、静脉内、眼部、眼内、肌内、***内、腹膜内、直肠、肠胃外、局部、鼻内或皮下施用至需要其的受试者。本文描述了其他合适的途径。在有些方面，所述RNA纳米结构包含有效量的货物分子。

肠胃外制剂

RNA纳米结构可以被配制为用于肠胃外递送，例如注射或输注，以溶液或悬浮液形式。所述制剂可通过任何途径施用，例如血流或直接至待治疗的器官或组织。

肠胃外制剂可使用本领域已知的技术被制备为水性组合物。通常，这样的组合物可以被制备为可注射制剂，例如，溶液或悬浮液；固体形式，适合用于在注射前在添加重构介质时制备溶液或悬浮液；乳剂，诸如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂，及其微乳剂、脂质体或乳脂体。

所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、诸如植物油(例如，花生油、玉米油、芝麻油等)的油，及其组合。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣(诸如卵磷脂)，在分散剂的情况下通过维持所需粒径和/或通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

如本文所描述的RNA纳米结构的溶液和分散剂可在与一种或多种药学上可接受的赋形剂适当混合的水或另一种溶剂或分散介质中被制备，所述赋形剂包括，但不限于，表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。合适的阴离子表面活性剂包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐的钠、钾、铵盐，诸如十二烷基苯磺酸钠；磺基琥珀酸二烷基钠，诸如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐，诸如月桂基硫酸钠。合适的阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，诸如氯化苯甲烃铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰二甲基苄基氯化铵，聚氧乙烯和椰油胺。合适的非离子表面活性剂包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、酰化山梨醇酯、酰化蔗糖、PEG-150月桂酸酯，PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙烯乙二醇丁醚、401、硬脂酰单异丙醇胺，和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

所述制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，和硫柳汞。所述制剂也可以包含抗氧化剂以防止RNA纳米结构的降解。

所述制剂可以被缓冲至pH 3-8，在重构后用于肠胃外施用。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂，和柠檬酸盐缓冲剂。

水溶性聚合物可用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羧甲基纤维素，和聚氧乙烯。无菌可注射溶液可通过根据需要将所需量的RNA纳米结构加入具有一种或多种上文所列的赋形剂的合适的溶剂或分散介质中，接着过滤杀菌来制备。分散液可以通过将各种灭菌的RNA纳米结构加入无菌载体中而制备，所述无菌载体含有基本分散介质和所需的来自上文列出的那些的其他成分。用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末可通过真空干燥和冷冻干燥技术制备，其产生RNA纳米结构加上来自先前灭菌过滤的溶液的任何额外的所希望成分的粉末。所述粉末可以这样的方式制备，以使得颗粒本质上是多孔的，这可以增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域公知的。

用于肠胃外施用的药物制剂可以是由一种或多种RNA纳米结构形成的无菌水溶液或颗粒悬浮液的形式。可接受的溶剂包括例如水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和等渗氯化钠溶液。所述制剂也可以是无菌溶液、悬浮液或乳液，在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇)中。

在有些情况下，所述制剂可以以液体形式分散或包装。在其它方面，用于肠胃外施用的制剂可包装为固体，例如，通过冷冻干燥合适的液体制剂而获得。所述固体可在施用之前用合适的载体或稀释剂重构。

用于肠胃外施用的溶液、悬浮液或乳液可以用维持适于眼部施用的pH所必需的有效量的缓冲剂缓冲。合适的缓冲剂包括但不限于乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐，和磷酸盐缓冲剂。

用于肠胃外施用的溶液、悬浮液或乳液也可以含有一种或多种张力剂，以调节所述制剂的等渗范围。合适的张力剂包括但不限于甘油、甘露醇、山梨醇、氯化钠，和其它电解质。

用于肠胃外施用的溶液、悬浮液或乳液也可以含有一种或多种防腐剂以防止眼科制品的细菌污染。合适的防腐剂包括，但不限于，聚六亚甲基双胍盐酸盐(PHMB)、氯化苯甲烃铵(BAK)、稳定的氯氧复合物(也被称为)、醋酸苯汞，氯丁醇、山梨酸、氯己定、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞，及其混合物。

用于纳米技术的溶液、悬浮液，或乳液(包括用于肠胃外施用的纳米制剂)也可以含有一种或多种赋形剂，诸如分散剂、润湿剂，和悬浮剂。

局部制剂

如本文所述的RNA纳米结构可以配制为用于局部施用。用于局部施用的合适剂型包括霜剂、软膏剂、药膏、喷雾剂、凝胶、洗剂、乳剂、液体，和透皮贴剂。所述制剂可配制用于透粘膜、经上皮、经内皮，或经皮施用。所述局部制剂可包含一种或多种化学渗透增强剂、膜通透剂、膜输送剂、润肤剂、表面活性剂、稳定剂，和其组合。

在有些方面，所述RNA纳米结构可以以液体制剂(诸如溶液或悬浮液)、半固体制剂(诸如洗剂或软膏剂)，或固体制剂施用。在有些方面，所述RNA纳米结构可配制为液体，包括溶液和悬浮液，诸如滴眼剂，或为半固体制剂，诸如用于局部施用至皮肤、至粘膜(诸如眼)、至***，或至直肠的软膏剂或洗剂。

所述制剂可以包含一种或多种赋形剂，例如软化剂、表面活性剂、乳化剂、渗透增强剂，诸如此类。

合适的软化剂包括且不限于，杏仁油、蓖麻油、长角豆提取物、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲硅油、乙二醇棕榈硬脂酸酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷脂、轻质矿物油、中链甘油三酯，矿物油和羊毛脂醇、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、大豆油、淀粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇及其组合。在有些方面，所述软化剂可以是乙基己基硬脂酸酯和棕榈酸乙基己酯。

合适的表面活性剂包括但不限于乳化蜡、甘油基单油酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、苯甲醇，苯甲酸苄酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮及其组合。在有些方面，所述表面活性剂可以是硬脂醇。

合适的乳化剂包括但不限于***胶、金属皂、某些动物和植物油，和各种极性化合物、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、鲸蜡硬脂醇，鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、棕榈酸硬脂酸乙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、甘油基单油酸酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羊毛脂、水合的，羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠，单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、多种泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、藻酸丙二醇酯、自乳化的单硬脂酸甘油酯、柠檬酸钠脱水合物、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花油、黄芪胶、三乙醇胺、黄原胶及其组合。在有些方面，所述乳化剂可以是硬脂酸甘油酯。

合适类别的渗透增强剂包括但不限于脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸、脂肪醇醚、氨基酸、磷脂、卵磷脂、胆酸盐、酶、胺和酰胺、络合剂(脂质体、环糊精、修饰的纤维素，和二酰亚胺)、大环化合物(诸如大环内酯、酮，和酸酐以及环状脲)、表面活性剂、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、DMSO和相关化合物、离子化合物、氮酮和相关化合物，以及溶剂(诸如醇、酮、酰胺、多元醇(例如，二醇)。

合适的乳液包括但不限于水包油乳液和油包水乳液。乳液的任一个或两个相可以包括表面活性剂、乳化剂，和/或液体非挥发性非水性材料。在有些方面，所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂。在其它方面，所述乳化剂是乳化蜡。在进一步的方面，所述液体非挥发性非水性材料是二醇。在有些方面，所述二醇是丙二醇。所述油相可以含有其它合适的油性的药学上可接受的赋形剂。合适的油性的药学上可接受的赋形剂包括但不限于羟基化蓖麻油或芝麻油，可以作为表面活性剂或乳化剂用于油相中。

也提供了包含如本文所述的RNA纳米结构的洗剂。在有些方面，所述洗剂为具有100厘沲至1000厘沲的粘度的乳液形式。洗剂的流动性可以允许在宽泛的表面积上快速且均匀的应用。洗剂可配制为在皮肤上干燥，在皮肤表面上留下其药用组分的薄涂层。

也提供了含有如本文所述的RNA纳米结构的霜剂。所述霜剂可含有乳化剂和/或其它稳定剂。在有些方面，所述霜剂是具有大于1000厘沲的粘度(通常在20,000-50,000厘沲的范围)的霜的形式。与软膏剂相比，霜剂更易于铺展和更易于除去。

霜剂和洗剂之间的一个区别是粘度，其取决于各种油的量/使用和用于制备制剂的水的百分比。霜剂可比洗剂粘稠，可具有各种用途，并且可具有更多不同的油/黄油，这取决于在皮肤上所需的效果。在霜剂制剂的有些方面，水基百分比可以是总量的约60％至约75％，并且油基可以是总量的约20％至约30％，其中其它百分比为乳化剂、防腐剂和添加剂，达到总量为100％。

也提供了含有如本文所述的RNA纳米结构和合适的软膏基质的软膏剂。合适的软膏基质包括烃基质(例如，凡士林、白凡士林、黄色软膏剂，和矿物油)；吸收基质(亲水性凡士林、无水羊毛脂、羊毛脂，和冷霜)；水可移除性基质(例如，亲水性软膏剂)和水溶性基质(例如，聚乙二醇软膏剂)。糊剂通常不同于软膏剂，因为它们含有较大百分比的固体。糊剂通常比用相同组分制备的软膏剂更具有吸收性且更不油腻。

本文也描述了包含如本文所述的RNA纳米结构的凝胶、胶凝剂和液体载体。合适的胶凝剂包括但不限于修饰的纤维素，诸如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素；卡波姆均聚物和共聚物；热可逆凝胶和其组合。液体载体中合适的溶剂包括但不限于：二甘醇单***；亚烷基二醇，诸如丙二醇；异山梨醇二甲基；醇，诸如异丙醇和乙醇。所述溶剂可以根据它们溶解药物的能力被选择。可改善制剂的皮肤触感和/或软化作用(emolliency)的其它添加剂也可以被加入。此类添加剂包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、C₁₂-C₁₅烷基苯甲酸酯、矿物油、角鲨烷、环甲硅油、癸酸/辛酸甘油三酯，及其组合。

本文也描述了可包括如本文所述的RNA纳米结构的泡沫。泡沫可以是与气体推进剂组合的乳液。所述气体推进剂可包括氢氟烷烃(HFA)。合适的推进剂包括HFA，诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227)，但是当前被批准或可被批准用于医疗用途的这些和其它HFA的混合物和添加物是合适的。所述推进剂可以缺乏烃推进剂气体，其在喷雾过程中可以产生易燃或***性蒸气。此外，所述泡沫可以不包含挥发性醇，其在使用期间可产生易燃或***性蒸气。

缓冲剂可被用于控制组合物的pH。所述缓冲剂可将组合物如下缓冲：从pH约4至pH约7.5、从pH约4至pH约7、或从pH约5至pH约7。在有些方面，所述缓冲剂可以是三乙醇胺。

可以包括防腐剂以防止真菌和微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵，苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙基醇，和硫柳汞。

在某些方面，可以通过向有需要的患者连续递送一种或多种制剂来提供所述制剂。对于局部应用，可以进行重复应用，或者可以使用贴片以在延长的时间段内提供诺司卡品类似物的连续施用。

肠内制剂

本文所述的RNA纳米结构可以被制备于肠内制剂中，诸如用于口服施用。合适的口服剂型包括片剂、胶囊剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和锭剂。片剂可以使用本领域公知的压制或模制技术制备。明胶或非明胶胶囊可以被制备为硬胶囊壳或软胶囊壳，使用本领域公知的技术，其可以包封液体、固体和半固体填充材料。

含有如本文所述的RNA纳米结构的制剂可以使用药学上可接受的载体制备。如本文中通常使用的“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填料、稳定剂，及其组合。用于剂型中的聚合物包括，但不限于，合适的疏水性或亲水性聚合物和合适的pH依赖性或非依赖性聚合物。合适的疏水性和亲水性聚合物包括但不限于羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧基甲基纤维素、聚乙二醇、乙基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯，和离子交换树脂。“载体”也包括包衣组合物的所有组分，其可包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂，和助流剂。

含有如本文所述的RNA纳米结构的制剂可以使用一种或多种药学上可接受的赋形剂被制备，包括稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填料、稳定剂，及其组合。

含有如本文所述的RNA纳米结构的延迟释放剂量制剂可如标准参考文献中所述被制备，诸如“Pharmaceutical dosage form tablets”,eds.Liberman et.al.(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989),“Remington–The science and practice of pharmacy”,20th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,和“Pharmaceuticaldosage forms and drug delivery systems”,6th Edition,Ansel et al.,(Media,PA:Williams and Wilkins,1995).这些参考文献提供关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒的延迟释放剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。这些参考文献提供关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒的延迟释放剂型的载体、材料、设备和方法的信息。

包含如本文所述的RNA纳米结构的制剂可被涂覆合适的包衣材料，例如，以在颗粒一旦穿过胃的酸性环境时延迟释放。合适的包衣材料包括但不限于纤维素聚合物诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及可以商品名(罗斯制药公司(Roth Pharma),魏特尔斯塔特(Westerstadt),德国)商购的甲基丙烯酸树脂、玉米胶蛋白、虫胶，和多糖。

包衣可以不同比例的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依赖性聚合物形成，可以具有或不具有水不溶性/水溶性非聚合物赋形剂，以产生所希望的释放曲线。所述包衣可以在(骨架或简单)剂型上进行，所述剂型包括，但不限于，片剂(用或不用包衣丸被压制)、胶囊(用或不用包衣丸)、丸，颗粒组合物，“成分原样”被配制为，但不限于，悬浮液形式或为喷剂剂型。

此外，包衣材料可以包含常规的载体，诸如增塑剂、颜料、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。任选的药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂，和表面活性剂。

稀释剂，也被称为“填料”，可以用于增加固体剂型的体积，以提供用于压制片剂或形成丸和颗粒的实用性尺寸。合适的稀释剂包括，但不限于，二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉，水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅胶、氧化钛、硅酸镁铝和糖粉。常见的稀释剂包括惰性粉状物质(诸如淀粉)、粉状纤维素(特别是结晶和微晶纤维素)、糖(诸如果糖、甘露醇和蔗糖)、谷物粉和类似的可食用粉末。典型的稀释剂包括，例如，各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸盐、无机盐诸如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是有用的。

粘合剂可赋予固体剂型以凝聚性质，并因此可以确保片剂或丸或颗粒在形成剂型后保持完整。合适的粘合剂材料包括，但不限于，淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶诸如***胶、黄芪胶、藻酸钠、纤维素，包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素，和硅酸镁铝(veegum)，以及合成聚合物诸如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物，甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。典型的片剂粘合剂包括诸如淀粉、明胶和糖(诸如乳糖、果糖和葡萄糖)的物质。天然树胶和合成树胶，包括***胶、藻酸盐、甲基纤维素，和聚乙烯吡咯烷酮也可以被使用。聚乙二醇、亲水性聚合物、乙基纤维素和蜡也可作为粘合剂。

可以包括润滑剂以促进片剂制造。合适的润滑剂包括，但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石，和矿物油。在片剂制剂中可以包括润滑剂以防止片剂和冲头在冲模中被粘住。所述润滑剂可以选自例如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油的光滑固体。

崩解剂可以被用于促进剂型在施用之后崩解或“解体”，并且通常包括，但不限于，淀粉、羟乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻酸盐(alginine)、树胶或交联聚合物，诸如交联的PVP(来自GAF化学品公司的XL)。

稳定剂可以被用于抑制或延迟药物分解反应，举例而言，所述分解反应包括氧化反应。合适的稳定剂包括，但不限于，抗氧化剂、丁羟甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐和酯；维生素E、生育酚及其盐；亚硫酸盐诸如偏亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯，和丁羟茴香醚(BHA)。

额外的活性剂

在有些方面，一定量的一种或多种额外的活性剂被包括在含有RNA纳米结构的药物制剂中。合适的额外的活性剂包括，但不限于，DNA、RNA、修饰的核糖核苷酸、氨基酸、肽、多肽、抗体、适体、核糖酶、抑制必需肿瘤蛋白质和基因的翻译或转录的核糖酶的引导序列、激素、免疫调节剂、退热剂、镇静剂，抗精神病药、镇痛剂、解痉剂、抗炎药、抗组胺剂、抗感染剂和化学治疗剂(抗癌药)。其它合适的额外的活性剂包括，敏化剂(诸如辐射敏化剂)。RNA纳米结构可以被用作单药治疗或与其它活性剂组合用于治疗或预防疾病或病症。

合适的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺素释放激素、抗利尿激素、胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素，和促甲状腺激素)、类花生酸(例如花生四烯酸、脂氧素和***素)，和类固醇激素(例如***、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。

合适的免疫调节剂包括但不限于强的松、咪唑硫嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、氨甲蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子，和咪喹莫特)、趋化因子(例如，CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体，和适体)。

合适的退热剂包括但不限于非类固醇抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬，和尼美舒利)、阿司匹林和相关的的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁，和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/醋氨酚、安乃近、纳布美通、安替比林，和奎宁。

合适的镇静剂包括，但不限于，苯二氮卓类(例如，阿普***、溴西泮、氯氮卓、氯硝西泮、氯拉酸、***、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮，***仑，和托非索泮)、血清素能的抗抑郁药(例如，选择性血清素再摄取抑制剂，三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)，mebicar、afobazole、selank、溴曼特(bromantane)、美昔得乐(emoxypine)、阿扎哌隆、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多和β-受体阻滞剂。

合适的抗精神病药包括，但不限于，苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆(pipaperone)、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、地西拉嗪(dizyrazine)、氟非那嗪、左美丙嗪、美索达嗪、丙拉嗪、哌氰嗪、羟哌氯丙嗪、哌普嗪、普鲁氯嗪、普马嗪、异丙嗪、氮丙嗪、硫丙拉嗪、硫醚嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨、珠氯噻醇、氯噻平、克噻平、氮丙嗪、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、维拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、鲁拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奥氮平，帕潘立酮、哌罗匹隆、喹硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、三甲丙咪嗪、齐拉西酮、佐替平、alstonie、联苯芦诺、生物蝶呤、依匹哌唑、***二酚、卡利拉嗪、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、诺美林，和齐洛那平(zicronapine)。

合适的镇痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非类固醇抗炎药(例如，布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如，罗非昔布、塞来昔布，和依托昔布)、阿片样物质(例如，***、可待因、氧可酮、氢可酮、二氢***、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵、去甲肾上腺素、氟西汀、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、***、凯托米酮、哌腈米特,和阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如，水杨酸胆碱，水杨酸镁，和水杨酸钠)。

合适的解痉剂包括，但不限于，美贝维林(mebeverine)、罂粟碱(paverine)、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林。

合适的抗炎药包括但不限于强的松、非胆固醇抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如，罗非昔布、塞来昔布和依托昔布)，和免疫选择性抗炎性衍生物(例如，颌下肽-T及其衍生物)。

合适的抗组胺剂包括，但不限于，H₁-受体拮抗剂(例如，阿伐斯汀、氮卓斯汀，比拉斯汀、溴苯那敏、布克利嗪、溴马嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、氯马斯汀、赛庚啶、地氯雷他定、右旋溴苯那敏、右旋氯苯那敏、茶苯海明(dimenhydrinate)、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羟嗪、左西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、嘧啶胺、喹硫平，卢帕他定、曲吡那敏和曲普利啶)、H₂-受体拮抗剂(例如，西咪替丁、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁)、曲托喹啉、儿茶素、色甘酸盐(Cromoglicate)、奈多罗米、和β2-肾上腺素能激动剂。

合适的抗感染剂包括，但不限于，抗阿米巴药(例如，硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、磺甲硝咪唑(tnidazole)、氯喹，和双碘喹啉)、氨基糖苷类(例如，巴龙霉素，妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素，和新霉素)、驱肠虫药(例如，噻嘧啶、甲苯咪唑、伊维菌素、吡喹酮、阿苯达唑、米替福辛、噻苯达唑、奥氨尼喹)、抗真菌剂(例如，氮杂茂抗真菌剂(例如，伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑，和伏立康唑)、棘白菌素(例如，卡泊芬净、阿尼芬净，和米卡芬净)，灰黄霉素、特比萘芬、氟胞嘧啶，和多烯类(例如，制霉菌素和两性霉素b)、抗疟药(例如，乙胺嘧啶/磺胺多辛、青蒿素甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍，奎宁、羟基氯喹、甲氟喹、氯喹、强力霉素、乙胺嘧啶，和卤泛曲林)、抗结核剂(例如，氨基水杨酸盐(例如，氨基水杨酸)、异烟肼/利福平、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素，和环丝氨酸)、抗病毒剂(例如，金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦/拉米夫定、恩曲他滨/替诺福韦、可比司他/elvitegravir/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/洛匹那韦/利托那韦/替诺福韦，干扰素α-2v/利巴韦林、PEG干扰素α-2b、马拉韦罗、雷替格韦、度鲁特韦、恩夫韦地、膦甲酸、福米韦生、奥司他韦、扎那米韦、奈韦拉平、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉夫定、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、阿巴卡韦(avacivr)、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨(xalcitabin)、替比夫定、西咪匹韦、波普瑞韦、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、福沙那韦、地瑞那韦、利托那韦、替拉那韦、阿扎那韦、奈非那韦、安普那韦、茚地那韦、沙奎那韦(sawuinavir)、利巴韦林、伐昔洛韦(valcyclovir)、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦，和缬更昔洛韦)、碳青霉烯类(例如，多利培南、美罗培南、厄他培南，和西司他丁/亚胺培南)、头孢菌素(例如，头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑林、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林(ceflaroline)、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁，头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松钠、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢去甲噻肟(cefizoxime)，和头孢他啶)、糖肽抗生素(例如，万古霉素、达巴万星、奥利万星，和特拉万星(telvancin))，甘氨环素类(例如，替加环素)、抗麻风药(例如，氯法齐明和沙利度胺)、林可霉素及其衍生物(例如，克林霉素和林可霉素)、大环内酯类及其衍生物(例如，泰利霉素、非达霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素，和醋竹桃霉素)、利奈唑胺、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、利福昔明、氯霉素、磷霉素，甲硝唑、氨曲南、杆菌肽、β-内酰胺抗生素(苄星青霉素(苯乍生和苄基青霉素)、苯氧甲基青霉素、氯洒西林、氟氯西林(flucoxacillin)、甲氧西林、替莫西林、美西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林，阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素、苯唑西林、双氯西林、奈夫西林、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢菌素C、先锋霉素、头孢克洛，头孢羟唑、头孢呋辛、头孢替坦、头孢西丁、头孢克肟(cefiximine)、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢吡肟、头孢匹罗、头孢洛林、比阿培南、多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、沙纳霉素、氨曲南(azrewonam)、替吉莫南、诺卡霉素A、taboxinine，和β-内酰胺)、喹诺酮(例如，洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星，和司帕沙星)、磺胺类(例如，磺胺甲恶唑/甲氧苄啶，柳氮磺吡啶，和磺胺异噁唑)、四环素类(例如，强力霉素、地美环素、米诺环素、强力霉素/水杨酸、强力霉素/ω-3多不饱和脂肪酸，和四环素)，和***抗感染剂(例如，呋喃妥因、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄啶，和亚甲基蓝)。

合适的化学治疗剂包括，但不限于，紫杉醇、本托昔单抗(brentuximabvedotin)、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸盐、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨，奥法木单抗、贝伐单抗、贝利司他、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、道诺霉素、氯法拉滨、卡博替尼、放线菌素D，雷莫芦单抗、阿糖胞苷、环磷酰胺、环磷酰氮芥、地西他滨、***、多西他赛、羟基脲、氮烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、氨磷汀、依托泊苷、氟他米特、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、氨甲蝶呤、氟尿苷、阿托珠单抗、吉西他滨，阿法替尼、甲磺酸伊马替尼、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索替尼、卡巴他赛、ado-曲妥珠单抗美坦新偶联物、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司钠、氯化锶-89、二氯甲基二乙胺、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭、PEG非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素(deneukin diftitox)、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来膦酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽、达沙替尼、瑞戈非尼、组胺瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗、高三尖杉酯碱、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤(tioguanine))、达拉非尼、厄洛替尼、贝沙罗丁、替莫唑胺、噻替派、沙利度胺、BCG、替西罗莫司、苯达莫司汀盐酸盐、曲普瑞林、三氧化二砷(aresnic trioxide)、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维甲酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、易普利姆玛、戈舍瑞林、伏立诺他、艾代拉里斯、色瑞替尼、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷(tafluposide)、咪唑硫嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛、全反式维甲酸，和本文其它处列出的其它抗癌剂。

使用RNA纳米结构及其制剂的方法

RNA纳米结构及其制剂可以被用于向需要其的受试者或细胞递送一种或多种货物化合物。在有些方面，所述RNA纳米结构可以用于递送RNA或DNA分子以用于置换基因/转录本治疗，向受试者递送RNAi或类似的RNA(例如微RNA)以特异性地抑制RNA转录本以减少特定基因或多个基因的基因表达，递送显像剂，递送小分子药物，和/或递送可包封在本文提供的RNA纳米结构中的任何其它货物化合物。因此，所述RNA纳米结构可被用于向需要其的受试者递送治疗、预防和/或诊断化合物。

在有些方面，本文所述的RNA纳米结构可与细胞或其群体接触。在有些方面，所述细胞或其群体针对由所述RNA纳米结构递送的治疗或预防被敏化。在有些方面，所述RNA纳米结构正在递送敏化剂。在有些方面，被递送的货物化合物不是敏化剂。在一个方面，在施用RNA纳米结构之后，受试者可以针对治疗被敏化。在一个方面，可以根据本领域已知的用于特定治疗的一种或多种方法来测量针对治疗诸如治疗剂治疗(诸如由被所述RNA纳米结构递送的货物化合物所提供)的增加的敏感性或降低的敏感性。在一个方面，测量针对治疗的敏感性的方法包括，但不限于，细胞增殖测定和细胞死亡测定。在一个方面，细胞或受试者对治疗的敏感性可以通过将施用所公开的治疗剂组合物之后的细胞或受试者的敏感性与尚未被施用所公开治疗剂组合物的细胞或受试者的敏感性进行比较而被测量或确定。

例如，在一个方面，在施用敏化剂和/或所述RNA纳米结构(诸如携带敏化剂的RNA纳米结构)之后，细胞对治疗的敏感性比未施用敏化剂的细胞可以更敏感2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍，14-倍、15-倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍或更多。在一个方面，在施用所公开治疗剂组合物之后，细胞对治疗的抗性比未施用敏化剂(诸如由本文所述的RNA纳米结构递送的敏化剂)的细胞可以更低2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍，14-倍、15-倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍或更多。确定细胞或受试者的敏感性或抗性在本领域中可以是常规的并且在普通临床医生和/或研究者的技能范围内。

在一个方面中，确定细胞或受试者对治疗的敏感性或抗性可以被监测。例如，在一个方面，关于敏感性和抗性的数据可以周期性地被获取，诸如针对受试者(例如，人类受试者或患有癌症和/或异常细胞生长的患者)的寿命每周、每隔一周、每月、每隔一个月、每3个月、6个月、9个月，或每年、每隔一年，每5年，每10年。在一个方面，关于敏感性和抗性的数据可以在不同时间而不是在周期性的时间被获取。在一个方面，可以基于关于细胞或受试者对治疗的敏感性或抗性的数据来改变受试者的治疗。例如，在一方面中，可通过改变所公开组合物的剂量、所公开组合物的施用途径、所公开组合物的施用频率等来改变治疗。

在有些方面，在所述RNA纳米结构包括连接靶向部分和/或货物化合物的可光解接头的情况下，所述RNA纳米结构可以被施用于受试者或细胞群体。在施用后，可将光应用至需要其的受试者中需要治疗或预防的细胞区域和/或群体，以引起所述RNA纳米结构和/或货物分子的释放。

如本文提供的RNA纳米结构可以被施用至需要其的受试者、细胞或其群体。所述需要其的受试者可以患有癌症、遗传疾病或病症、病毒、细菌、寄生虫和/或真菌感染，或将受益于被递送的有效试剂(诸如本文所述的货物化合物)的任何其它疾病或病症。所递送的量可以是本文提供的RNA纳米结构的有效量。需要其的受试者可以是有症状的或无症状的。在有些方面，本文提供的RNA纳米结构可以与另一种活性剂共同施用。将理解，共同施用可以指包含在制剂中或提供在与RNA纳米结构或其制剂分开的剂型中的额外的化合物。RNA纳米结构或其制剂(诸如本文所公开的那些)的有效量可以在约0.1mg/kg至约500mg/kg范围。在有些方面，所述有效量在约0.1mg/kg至10mg/kg范围。在另外的方面，所述有效量在约0.1mg/kg至100mg/kg范围。如果进一步的方面，所述有效量在约0.1mg至约1000mg范围。在有些方面，所述有效量可以是约500mg至约1000mg。

所述RNA纳米结构和其制剂的施用可以是全身的或局部的。本文所述的化合物和制剂可以每日一次或多次向需要其的受试者施用。在一个方面，所述化合物和/或其制剂可以每天施用一次。在有些方面，所述化合物和/或其制剂可以每天施用给定的一次。在另一个方面，所述化合物和/或其制剂可以每天施用两次。在有些方面，当施用时，有效量的所述化合物和/或制剂被施用给需要其的受试者。所述化合物和/或其制剂可以每周施用一次或多次。在有些方面，所述化合物和/或其制剂可以每周施用1天。在其它方面，所述化合物和/或其制剂可以每周施用2至7天。

在有些方面，所述RNA纳米结构和/或其制剂可以以剂型施用。所述化合物和/或其制剂的量或有效量可划分为多种剂型。例如，有效量可以被分为两种剂型，并且第一剂型可，例如，在早晨被施用，并且第二剂型可以在晚上被施用。虽然有效量在一天中是通过两份剂量给予，但是受试者接受了有效量。在有些方面，所述有效量为约0.1至约1000mg每天。剂型中的有效量可以在约0.1mg/kg至约1000mg/kg的范围。所述剂型可被配制成用于口服、***、静脉内、经皮、皮下、腹膜内，或肌肉内施用。用于各种施用途径的剂型的制备描述于本文其它地方。

本文所述的模块化RNA基序和本文所述的RNA纳米结构可用于制备治疗疾病或癌症的药物。

已经描述了本发明的许多方面。然而，将理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其它方面在所附权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：基于RNA的微团：用于化疗药物负载和递送的平台。

RNA可以用作用于自下而上制造用于生物技术和生物医学应用的纳米结构的强大建筑模块。除了当前利用碱基配对、基序堆积和三级相互作用的自组装策略之外，我们首次报道构建基于RNA的微团纳米结构，其具有缀合至分支的pRNA 3-向接合(3WJ)基序的一个螺旋末端上的胆固醇分子。所获得的两亲性RNA微团由亲水性RNA头部和共价连接的疏水性脂质尾部组成，所述尾部可通过疏水相互作用在水溶液中自发地组装。利用pRNA 3WJ分支结构的特征，组装的RNA微团能够护送多种功能性模块。作为治疗剂递送的概念证明，紫杉醇被负载到具有显著提高的水溶性的所述RNA微团上。负载药物的RNA微团的成功构建通过琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)和尼罗红荧光包封测定来确认和表征。临界微团形成浓度低至约100nM。加载紫杉醇的RNA微团可以内化至癌细胞中并抑制它们的增殖。进一步的研究显示，负载紫杉醇的RNA微团以Caspase-3依赖性的方式诱导癌细胞凋亡，但单独的RNA微团表现出低细胞毒性。最后，负载紫杉醇的RNA微团在体内靶向肿瘤，而不在健康组织和器官中积聚。也没有或有非常低的促炎性反应诱导。因此，多价、癌细胞渗透性，结合可控的组装、低毒性或无毒性，以及肿瘤靶向，全部是使得我们的pRNA微团成为用于潜在药物递送的合适平台的有前景的特征。

简介

通过分子自组装制备的功能性纳米颗粒在生物技术和生物医学方面的具有重大应用前景[1-4]。在这些当中，RNA已被用作独特的生物材料以通过自组装构建多种多样的纳米颗粒[Li,H.et al.Adv.Mater.28(2016)7501-7507；Guo,P.Nature Nanotechnology 5(2010)833-842；Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667；Shu,Y.etal.Methods 54(2011)204-214；Haque,F.et al.Nano Today 7(2012)245-257；Afonin,K.A.et al.Nano.Lett.12(2012)5192-5195；Shu,Y.et al.Nat.Protoc.8(2013)1635-1659；Khisamutdinov,E.et al.Nucleic Acids Res.42(2014)9996-10004；Jasinski,D.etal.ACS Nano 8(2014)7620-7629；Khisamutdinov,E.F.et al.Advanced Materials 28(2016)100079-100087；Afonin,K.A.et al.Nano Lett.14(2014)5662-5671；Dibrov,S.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108(2011)6405-6408；Afonin,K.A.etal.Nat.Nanotechnol.5(2010)676-682]。已证明这些RNA纳米颗粒进一步功能化用于生物医学应用[Lee,J.B.et al.Nat.Mater.11(2012)316-322；Lee,T.J.et al.Oncotarget 6(2015)14766-14776；Cui,D.et al.Scientific reports5(2015)10726；Shu,D.et al.ACSNano 9(2015)9731-9740；Rychahou,P.et al.ACS Nano 9(2015)1108-1116；Binzel,D.etal.Molecular Therapy 24(2016)1267-1277；Afonin,K.A.et al.Nat.Protoc.6(2011)2022-2034]。先前报道了RNA纳米颗粒自组装的策略。利用RNA碱基配对和三级相互作用，为多功能的RNA组装体在纳米级上提供了针对他们的组成、结构和功能的精确控制[Shu,Y.etal.Nat.Protoc.8(2013)1635-1659；Khisamutdinov,E.F.et al.Methods Mol Biol 1316(2015)181-193]。在本研究中，检查了通过分子间疏水性相互作用制造具有微团性质的RNA自组装体的策略。

本文描述的是稳定的phi29pRNA 3-向接合(3WJ)基序的设计和制造，所述3-向接合基序可被用作用以构建具有高化学和热力学稳定性的多价RNA纳米颗粒的骨架[Guo,P.Nature Nanotechnology 5(2010)833-842；Haque,F.et al.Nano Today 7(2012)245-257]。所获得的分支的的RNA纳米颗粒的尺寸和形状是均匀的。它们可以发挥不同的功能，同时在体外和体内都保持它们的三级折叠和独立的功能[Haque,F.et al.Nano Today 7(2012)245-257；Jasinski,D.et al.ACS Nano 8(2014)7620-7629；Shu,D.et al.ACS Nano9(2015)9731-9740；Binzel,D.et al.Molecular Therapy 24(2016)1267-1277；Shu,Y.etal.RNA 19(2013)766-777；Khisamutdinov,E.F.et al.ACS Nano.8(2014)4771-4781；Li,H.et al.Nucleic Acid Ther.(2015)25(4):188-97；Lee,T.J.et al.Mol Ther.(2017)25(7):1544-1555；Shu,D.et al.Nucleic Acids Res.(2014)42(2):e10]。也显示了荧光染料分子[Shu,D.et al.EMBO J.26(2007)527-537]和具体的细胞靶向配体[Shu,D.et al.ACSNano 9(2015)9731-9740；Rychahou,P.et al.ACS Nano 9(2015)1108-1116；Binzel,D.etal.Molecular Therapy 24(2016)1267-1277；Lee,T.J.et al.Mol Ther.(2017)25(7):1544-1555；Pi,F.et al.Nat Nanotechnol.(2018)13(1):82-89]可以通过RNA固相合成或通过转录后化学缀合而共价连接到RNA链上[Shu,Y.et al.Methods 54(2011)204-214；Shu,Y.et al.Nat.Protoc.8(2013)1635-1659；Raouane,M.et al.Bioconjug.Chem 23(2012)1091-1104]。由不同的化学和功能部分修饰的RNA分子的可行性证明RNA纳米颗粒作为多功能药物递送平台的潜力。

已经描述了DNA微团构建体[Gosse,C.et al.J Phys Chem B 108(2004)6485-6497；Wu,Y.et al.Proc Natl Acad Sci U.S A 107(2010)5-10；Liu,H.et al.Chemistry16(2010)3791-3797；Chen,T.et al.Angew.Chem Int.Ed Engl.52(2013)2012-2016；Jeong,J.H.et al.Bioconjug.Chem 12(2001)917-923；Dentinger,P.M.et al.Langmuir22(2006)2935-2937；Alemdaroglu,F.E.et al.Angew.Chem Int.Ed Engl.45(2006)4206-4210；Trinh,T.et al.Chem Commun.(Camb.)52(2016)10914-10917；Li,Z.et al.NanoLetters 4(2004)1055-1058；Alemdaroglu,F.E.et al.Adv.Mater.20(2008)899-902]。通过将亲脂性部分熔合到pRNA-3WJ分支的螺旋末端之一上，可以将亲水性RNA分子转化为两亲性构建体。这一两亲性构建体表现类似于磷脂，同时其自发地自组装成单分散的三维微团纳米结构，所述三维的微团纳米结构具有脂质内核和分支的RNA外冠，作为水溶液中分子间疏水相互作用的结果。与当前的DNA微团系统(其应用受限于它们单一的功能性)[Wu,Y.et al.Proc Natl Acad Sci U.S A 107(2010)5-10；Jeong,J.H.et al.Bioconjug.Chem12(2001)917-923]不同，pRNA微团能够将不同类型的功能部分共价连接至单个颗粒，包括用于癌症治疗的化学药物、用于纳米颗粒跟踪的成像部分和用于组合治疗的共同递送的RNAi组分。

分离自短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮的紫杉醇(PTX)[Wani,M.C.etal.J Am.Chem Soc 93(1971)2325-2327]是用于多种癌症类型的最有效的化疗药物之一[Spencer,C.M.et al.Drugs 48(1994)794-847；Rowinsky,E.K.et al.N.Engl.J Med.332(1995)1004-1014；Jordan,M.A.et al.Nat Rev.Cancer 4(2004)253-265]。紫杉醇用于癌症治疗的机制是促进和稳定微管并且进一步抑制细胞周期的G2或M期，然后细胞死亡[Horwitz,S.B.et al.Trends Pharmacol.Sci 13(1992)134-136]。然而，根据生物制药分类系统(BCS)，紫杉醇已经被分类为IV型化学药物，因为它具有低水溶性(～0.4μg/mL)和低渗透性。被使用的第一个紫杉醇的配方在Cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)和脱水乙醇的1∶1(v:v)混合物中，由0.9％氯化钠或5％右旋糖溶液稀释5～20倍用于静脉注射施用[Singla,A.K.et al.Int.J Pharm 235(2002)179-192]。然而，已经观察到含有Cremophor油的配方导致严重的副作用[Gelderblom,H.et al.Eur.J Cancer 37(2001)1590-1598]以及不可预期的非线性血浆药动学[Sparreboom,A..et al.Cancer Res 56(1996)2112-2115]。因此，已经广泛地探究了替代的紫杉醇配方，特别是用基于纳米颗粒的递送系统[Kim,S.C.et al.J Control Release 72(2001)191-202]。利用纳米级的尺寸、肿瘤靶向递送和生物相容性，在纳米递送系统中包封紫杉醇可增加药物循环半衰期、降低其全身毒性、减少副作用、改善药代动力学和药效学特性，并展示更好的患者配合度。紫杉醇白蛋白结合的纳米颗粒在2005年已由FDA批准。紫杉醇脂质体聚合物微团(Genexol)和具有多聚谷氨酸盐的聚合缀合物是目前可商购的紫杉醇配方。此外，还有各种类型的紫杉醇纳米颗粒配方或者正在开发或者正在临床试验，诸如基于聚合物的纳米颗粒[Hamaguchi,T.et al.Br.J Cancer 97(2007)170-176；Dong,Y.etal.Biomaterials 25(2004)2843-2849；Kim,K.et al.J Control Release 146(2010)219-227]、基于脂质的纳米颗粒[Yoshizawa,Y.et al.Int.J Pharm 412(2011)132-141；Yuan,H.et al.Int.J Pharm 348(2008)137-145]、聚合物-药物缀合物[Khandare,J.J.etal.Bioconjug.Chem 17(2006)1464-1472；Bedikian,A.Y.et al.Melanoma Res14(2004)63-66]、无机纳米颗粒[Hwu,J.R.et al.J Am.Chem Soc 131(2009)66-68]、碳纳米管[Lay,C.L.et al.nanotechnology 21(2010)065101]、纳米晶体[Deng,J.et al.Int.J Pharm390(2010)242-249]等。然而，还从未报道过将紫杉醇配制到基于RNA的纳米递送平台。

这一实施例尤其描述了用以通过与pRNA-3WJ-脂质缀合来包封紫杉醇的定义明确的RNA-微团体系的设计和构造。这也是首次报道具有显著增强的紫杉醇水溶性和肿瘤渗透性的RNA-紫杉醇微团。所获得的RNA微团显示低临界微团形成浓度(CMC)、优异的细胞结合和渗透性，以及通过体外诱导Caspase-3依赖性细胞凋亡而对癌细胞增殖的有效抑制。最后，证明了这些负载药物的RNA微团可以以有利的肿瘤靶向全身递送至肿瘤，从而使药物在健康组织和关键器官中的滞留最小化。也没有或有非常低的促炎性反应的诱导。所有这些发现表明RNA-微团体系作为用于癌症治疗的合适的药物递送平台的强大潜力。这些RNA微团可以被用于肿瘤特异性靶向，降低药物有效剂量和进一步减少化疗的副作用。本文所述的RNA微团可以是坚固和安全的纳米递送系统，以携带用于特异性肿瘤靶向和治疗、具有最小的副作用的抗癌药物，以对抗癌症并改善患者的生活质量。

材料和方法

通过“点击化学”合成缀合紫杉醇的RNA链

为了合成PTX-叠氮化物，将1∶2∶2∶1当量的紫杉醇(阿法埃莎(Alfa Aesar))、6-叠氮基己酸(叠氮基-HA)(Chem-IMPEX国际公司)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(AcrosOrganics)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))称重至双颈圆底烧瓶中。反应混合物被溶解在约20mL干燥的二氯甲烷(DCM)中并在室温下反应，同时在氮气气氛下搅拌24小时。在旋转式气化器上将反应溶液过滤并浓缩。通过二氧化硅凝胶色谱法在用n-己烷：乙酸乙酯的系列溶剂清洗下进一步纯化浓缩的反应液。合并并干燥含有纯化产物的级份。纯化的终产物PTX-叠氮化物由核磁共振(NMR)光谱表征。

通过标准RNA固相化学合成法使用5’-己炔基亚磷酰胺(Glen Research公司)合成5’-炔-RNA。被标记的RNA链的理论产率为约68％(0.9819＝0.68)，具有98％的平均偶联效率。

向5μL的2mM RNA-炔水溶液添加2μL的PTX-叠氮化物(50mM，5当量，于3∶1(v/v)的DMSO(二甲基亚砜，极干燥，Acros Organics)/tBuOH(叔丁醇，无水，西格玛奥德里奇))、3μL新鲜制备的“点击溶液”，所述“点击溶液”其在3∶1的DMSO/tBuOH中含有1：2摩尔比的0.1MCuBr(溴化铜(I)，西格玛奥德里奇)和0.1M TBTA(三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺，西格玛奥德里奇)。将反应混合物充分混合并在室温下反应3小时。反应的成功通过20％的8M尿素PAGE在TBE(89mM Tris碱-硼酸盐，2mM EDTA)缓冲液中确定。随后用100μL 0.3MNaOAc(乙酸钠)和1mL 100％乙醇稀释反应液，用于RNA沉淀。将沉淀物溶于水中，用于在Agilent PLRP-S 4.6x 250mm 柱上使用离子对反相HPLC纯化。在乙腈梯度(ramp)中使PTX标记的RNA与未反应的RNA-炔分离。1.5mL/min的流速在95％溶剂A(0.1MTEAA，HPLC级H₂O)和5％溶剂B(0.1M TEAA，75％乙腈，25％HPLC级H₂O)中平衡柱。将样品通过0.2μm的旋转过滤器过滤，加载到柱上，然后在30分钟的过程中由从5％至100％B的梯度洗脱。收集馏分，合并并交换缓冲液。最终的RNA-PTX缀合物通过质谱分析法表征。

2’-F修饰的pRNA-3WJ-PTX微团的设计和构建

使用自下而向上的方法构建RNA微团[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667]。由三个片段，a3WJ、b3WJ和c3WJ组成的pRNA-3WJ-PTX微团被以下功能化：在a3WJ的5’-端上的紫杉醇(阿法埃莎)(a3WJ-5’PTX)，作为治疗模块；在b3WJ的3’-端(b3WJ-3’chol)的胆固醇，作为亲脂性模块；和在c3WJ的3’-端的Alexa647(Alexa647，英杰(Invitrogen))(c3WJ-3’Alexa647)，作为近红外(NIR)成像模块。对照RNA纳米颗粒是没有被称为pRNA-3WJ微团的治疗模块、没有被称为pRNA-3WJ-PTX的亲脂性模块、并且没有被称为pRNA-3WJ的亲脂性模块和治疗模块二者的颗粒。

使用以下的pRNA-3WJ支架[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667]序列：a3WJ 5’-UUgCCaUgUgUaUgUggg-3’(SEQ ID NO:16)；b3WJ 5’-CCCaCaUaCUUUgUUgaUCC-3’(SEQ ID NO:17)；c3WJ5’-ggaUCaaUCaUggCaa-3’(SEQ ID NO:18)(大写字母指示2’氟代(2’-F)修饰的核苷酸)。使用可商购的2’-TBDMS腺苷(n-bz)CED、2’-TBDMS鸟苷(n-ibu)CED、2’-氟胞苷(n-ac)CED和2’-氟尿苷CED的磷酰胺单体，通过标准的固相化学合成法[Lay,C.L.et al.nanotechnology 21(2010)065101]合成RNA片段，随后根据制造商(Azco Biotech)提供的实验方案脱保护。通过化学选择性Cu(I)-催化的Huisgen 1,3-偶极环加成反应(“点击化学”)将紫杉醇(PTX)缀合至a3WJ 5’-末端，并通过如上所述的反相HPLC纯化。遵循制造商的说明，通过使用3’-胆甾醇基-TEG CPG载体(GlenResearch公司)将胆固醇连接至b3WJ链的3’-末端。b3WJ-3’chol的理论产率为～68％(0.9819＝0.68)，具有98％的平均偶联效率。使用离子对反向相柱从终止的链中纯化合成的RNA，这通常在固相合成期间产生胆固醇的完全标记。Alexa647标记的RNA链购自Trilink生物技术有限公司(Trilink Bio Technologies，LLC)。

通过在TMS缓冲液(50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，10mM MgCl₂)或PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄和2mM KH₂PO₄,pH 7.4)中以等摩尔浓度混合3WJ链(a3WJ、b3WJ和c3WJ)来组装pRNA-3WJ-PTX微团，随后加热至80℃持续5分钟，并在40分钟的过程中缓慢冷却至37℃，随后在37℃温育1小时。

被组装的pRNA-3WJ微团的表征

官能化的3WJ纳米颗粒的组装通过在TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)缓冲液中进行1％(w/v)琼脂糖凝胶迁移测定来表征。电泳之后，将凝胶用溴化乙锭染色，并由Typhoon FLA 7000(GE healthcare)可视化。

由Zetasizer nano-ZS(马尔文仪器有限公司(Malvern Instrument，Ltd))在25℃下分别测量预组装的pRNA-3WJ-PTX(20μM于PBS缓冲液中)和pRNA-3WJ-PTX微团(10μM于PBS缓冲液)的表观流体动力学直径。数据来自于三次独立的测量值。还由Zetasizer nano-ZS(马尔文仪器有限公司)在25℃下测量pRNA-3WJ-PTX微团(1μM于PBS缓冲液中)的ζ电位。

RNA微团的大小和形状也通过原子力显微镜(AFM)测定。对于AFM，将10μM溶于TMS缓冲液中的pRNA-3WJ-PTX微团溶液沉积到新鲜切割的云母上并过夜干燥。在用HPLC级的水进行两次连续冲洗步骤之后，将云母安装到布鲁克(Bruker)Multimode IV AFM上并以轻敲模式成像。

RNA微团的成功形成也通过如先前报道的尼罗红包封测定来确定[Edwardson,T.G.W.et al.Nature Chemistry 5(2013)868-875；Zhang,A.et al.Soft Matter 9(2013)2224-2233]。丙酮中的5mM尼罗红储液用于所有实验。简言之，将0μM、1μM、5μM和10μM被组装的pRNA-3WJ微团分别与TMS缓冲液中的100μM尼罗红温育。将混合物加热至80℃，持续5分钟，并在40分钟内缓慢冷却至37℃，随后在37℃温育1小时。在Fluorolog分光荧光计(Horiba Jobin Yvon)上以535nm的激发波长和560nm至760nm的发射光谱测量与RNA微团浓度相对的尼罗红荧光强度。pRNA-3WJ被用作对照。

确定临界微团形成浓度(CMC)

pRNA-3WJ微团的CMC通过如先前报道的荧光尼罗红红色包封测定[Zhang,A.etal.Soft Matter 9(2013)2224-2233]和琼脂糖凝胶电泳来确定。简言之，2倍系列稀释的RNA微团样品(在5μM至0.005μM的范围内)与100μM尼罗红在50μL终体积中一起温育。将样品加热至80℃，持续5分钟，并在40分钟内缓慢冷却至37℃，随后在37℃温育1小时。使用Fluorolog分光荧光计(Horiba Jobin Yvon)以535nm的激发波长和560nm至760nm的发射光谱测量与RNA微团浓度相对的尼罗红荧光强度。将2倍系列稀释的RNA微团样品(在2.5nM至0.0390625μM范围内)直接加载到1％(w/v)琼脂糖凝胶上以在120V下在TAE缓冲液中电泳。凝胶用溴化乙锭染色，并由Typhoon FLA 7000可视化。

配方稳定性测定

将pRNA-3WJ微团的2μM溶液在酸性(pH＝4)、中性(pH＝7.4)和碱性(pH＝12)缓冲液中于37℃温育1小时。最后的2μM pRNA-3WJ微团也在不同温度(4℃、37℃和65℃)下温育1小时。将温育后的所有样品都加载到1％(w/v)琼脂糖凝胶上以在120V下在TAE缓冲液中电泳。凝胶用溴化乙锭染色并由Typhoon FLA 7000可视化。

细胞培养

使人KB细胞(美国典型培养物保藏中心，ATCC)在含有10％FBS的RPMI-1640(赛默飞科技(Thermo Scientific))中在37℃培养箱中5％CO₂和湿润气氛下生长和培养。小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞在补充10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)中在37℃下在含有5％CO₂的湿润空气中培养。

使用流式细胞术的体外结合测定

250nM、500nM和1μM Alexa647标记的pRNA-3WJ-PTX微团和不含有亲脂性模块的对照pRNA-3WJ-PTX纳米颗粒各自与2×10⁵KB细胞在37℃温育1小时。用PBS洗涤两次后，将细胞重悬于PBS中。流式细胞术由UK流式细胞术&细胞分选核心设备进行，以观察Alexa647标记的pRNA-3WJ-PTX微团的细胞结合效力。数据通过FlowJo 7.6.1软件进行分析。

使用共聚焦显微镜的体外结合和内化测定

使KB细胞在载玻片上生长过夜。1μM Alexa647标记的pRNA-3WJ-PTX微团和不含有亲脂性模块的对照pRNA-3WJ-PTX纳米颗粒各自与细胞在37℃温育1小时。用PBS洗涤后，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞并用PBS洗涤3次。用PBS中的0.1％Triton-X100处理被固定的细胞的细胞骨架5分钟以提高细胞膜的渗透性，然后在室温下用Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Life Technologies)染色30分钟，然后用PBS冲洗3×10分钟。用含有DAPI(LifeTechnologies)的Gold防淬灭试剂封装细胞，且DAPI被用于细胞核染色。然后通过FluoViewFV1000滤波器共焦显微镜系统(奥林巴斯公司(Olympus Corp.))测定细胞的结合和细胞内化。

pRNA-3WJ-PTX的体外药物释放测定

将10μM的pRNA-3WJ-PTX缀合物与50％FBS在37℃温育并在不同的时间点(1小时、4小时、8小时、12小时、15小时、22小时、28小时，和36小时)收集样品并立即冷冻于-80℃。在通过整个时间过程完成样品收集之后，所有样品在15％非变性PAGE上在TBM缓冲液(89mMTris碱-硼酸盐，5mM MgCl₂)中电泳。由ImageJ量化凝胶条带，并且以完整颗粒％＝[(上部条带的强度)/(上部条带的强度+下部条带的强度)]×100％计算完整颗粒的百分比。上部条带表示完整的RNA-药物缀合物，而较低的条带表示药物释放后的RNA寡聚核苷酸。

MTT测定

为了测定来自pRNA-3WJ-PTX微团治疗的细胞毒性作用，遵循制造商的说明，使用CellTiter 96非放射性细胞增殖测定(普洛麦格(Promega))来测定细胞活力变化。简言之，在测定之前一天将1×10⁴KB细胞接种到96孔板中。在第二天，将1μM、800nM、600nM、400nM和200nM的pRNA-3WJ-PTX微团添加到孔中，重复三次。单独的紫杉醇、pRNA-3WJ微团、pRNA-3WJ-PTX和pRNA-3WJ以相同的测试浓度作为对照。将平板在37℃下在湿润的5％CO₂气氛中温育48小时。温育之后，向每个孔中加入15μl染液并将平板在湿润的5％CO₂气氛中在37℃下温育高达4小时。接着，向每个孔中加入100μL增溶溶液/终止混合物并温育1小时。最后，将孔中的内容物混合以得到均匀着色的溶液并在Synergy 4微孔板检测仪(Bio-Tek)上记录它们在570nm的吸光度。

体外细胞模型中的细胞凋亡研究

如先前报道使用FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen)和Caspase-3测定试剂盒(BD Pharmingen)以研究由pRNA-3WJ-PTX微团治疗诱导的细胞凋亡。对于FITC膜联蛋白V染色测定，将KB细胞接种在12孔板中过夜。然后，用1μM pRNA-3WJ-PTX微团处理细胞(～30％融合)。对照包括紫杉醇、pRNA-3WJ微团和pRNA-3WJ。根据制造商的说明书，在与RNA微团温育48小时之后，将KB细胞用胰蛋白酶消化为单细胞悬液。在两次PBS洗涤后，将细胞重悬于100μL 1×膜联蛋白V-FITC结合缓冲液中。然后在每个样品中加入5μL膜联蛋白V-FITC和5μL碘化丙啶(PI)并在室温下温育25分钟。最后将样品加入包含200μL 1×结合缓冲液的流管中，在1小时内用于FACS分析。

对于Caspase-3测定，将KB细胞接种在24孔板上过夜。然后用1μMpRNA-3WJ-PTX微团处理细胞(约30％融合)。对照包括紫杉醇、pRNA-3WJ微团和pRNA-3WJ。遵循制造商的说明，通过Caspase-3测定试剂盒(BD Pharmingen)测量并比较细胞的Caspase-3活性。简言之，在诱导凋亡后的不同时间点(4小时、8小时、12小时和24小时)使用由试剂盒提供的冷的细胞裂解缓冲液制备细胞裂解液(1-10×10⁶细胞/mL)，并在冰上温育30分钟。对于每个样品，25μL细胞裂解液中添加2μL于80μL 1×HEPES缓冲液中的重构的Ac-DEVD-AMC，并在37℃温育1小时。在Fluorolog荧光光谱仪(Horiba Jobin Yvon)上以380nm的激发波长在400-500nm发射波长的范围内测量从Ac-DEVD-AMC释放的AMC的量。

动物模型

涉及动物的所有实验方案都在肯塔基大学动物保护和利用委员会(IACUC)的监管下实施。为了产生异种移植模型，从Taconic购买4-8周龄的雌性无胸腺nu/nu小鼠。通过将重悬于无菌PBS中的KB细胞以2×10⁶细胞/位点注射到裸鼠的左肩中以建立皮下肿瘤异种移植物。当注射后大约5天肿瘤结节达到50mm³的体积时，将小鼠用于肿瘤靶向研究。

NIR荧光成像以检测RNA微团在体内靶向癌症异种移植物

为了研究pRNA-3WJ-PTX微团在体内的递送，在向负荷KB肿瘤的小鼠中分别尾静脉注射100μL 20μM的Alexa 647标记的pRNA-3WJ-PTX微团和pRNA-3WJ-PTX(估计的血液中终浓度为约1μM)之后进行荧光成像研究。注射PBS的小鼠被用作阴性荧光对照。在30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时拍摄全身图像。在注射后24小时通过吸入CO₂及随后的断颈法处死小鼠，并将来自被处死小鼠的包括心脏、肺、肝、脾、肾的主要内脏器官与肿瘤一起收集起来，并使用IVIS光谱工作站(Caliper Life Science)以640nm激发和680nm发射进行荧光成像以评估生物分布图谱。

评估pRNA-3WJ微团的促炎症诱导

对于促炎性细胞因子诱导的体外评价，在24孔板中每孔接种2.5×10⁵RAW 264.7细胞并培养过夜。将pRNA-3WJ微团(1μM或200nM)以及脂多糖(LPS，3.6μg/mL，与200nMpRNA-3WJ微团等量)在DMEM(生命技术(Life Technologies))中稀释并添加到细胞中温育，重复三次。在温育16小时之后，收集细胞培养上清液并立即储存在-80℃用于进一步分析。遵循制造商的说明，分别使用小鼠ELISA MAX Deluxe套组(BioLegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，USA)检测所收集的上清液中的TNF-α和IL6，同时使用小鼠IFNαELISA试剂盒(PBLAssay Science，皮斯卡塔韦，新泽西州，USA)检测IFN-α。

为了体内评估促炎性细胞因子和趋化因子诱导，将pRNA-3WJ微团(1μM)、LPS(每只小鼠10μg)和DPBS对照经由尾静脉注射到4至6周龄的雄性C57BL/6小鼠中。注射后3小时，通过心脏穿刺从小鼠中收集血液样品，并以12,800×g离心10分钟以收集血清。遵循制造商的说明，如上所述，通过ELISA检测血清中TNF-α、IL6和IFN-α的浓度。遵循制造商的说明，使用小鼠趋化因子芯片试剂盒(R&D Systems，明尼阿波里斯市，明尼苏达州，USA)测定趋化因子诱导。LiCor用于定量印记点。

统计分析

对于所测试的每个样本，

每个实验重复3次。除非另有说明，否则结果以平均值±SD呈现。使用学生T-检验评估统计学差异，并且认为p<0.05是差异显著的。

结果和讨论

pRNA-3WJ微团的构建和表征

pRNA-3WJ-PTX微团利用由来自pRNA 3WJ基序的三段短RNA片段组成的模块化设计[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667](图1A)。通过考虑所述pRNA 3WJ基序的全局折叠结构，将亲脂性模块胆固醇与b3WJ的3’-末端缀合。pRNA3WJ基序的晶体结构显示，跨越pRNA3WJ的三个螺旋(H1、H2和H3)的角度为约60°(H1-H2)、约120°(H2-H3)和约180°(H1-H3)[Zhang,H.et al.RNA19(2013)1226-1237](图1B)。为了避免由于分支的3WJ结构而由空间位阻干扰微团形成，胆固醇分子被放到距离其他两个螺旋H1和H2最远的H3上。我们目前的设计涉及使用治疗模块(紫杉醇)和成像模块(Alexa 647染料)功能化H1，而不干扰微团形成(图1C，图1D)。如以下研究中所示，被缀合的化疗药物和检测染料的功能也被充分保留。未被占用的螺旋H2可以用RNAi模块(诸如siRNA或微RNA)进一步活化，用于联合治疗以产生增强的或协同的治疗效果。

在PBS或TMS缓冲液中将各链以等摩尔比混合后，所述复合物以高效率装配，如在1％琼脂糖凝胶迁移测定中所示(图1E)。Alexa 647标记的RNA微团也显示荧光条带，其对应于指示微团形成成功的条带(图1E)。通过AFM进一步展示RNA微团的组装，AFM显示均匀的球形结构(图2A)。DLS测定显示，与pRNA-3WJ核心骨架的7.466±1.215nm相比，pRNA-3WJ-PTX微团的平均流体动力学直径为118.7±14.50nm(图2B)。所构建的pRNA-3WJ-PTX微团还带负电荷。如图2C所示，ζ电位为-26.1±10.4mV。最后，通过尼罗红包封测定分析RNA微团形成。尼罗红是疏水性染料且在大量水溶液中几乎不发光，但其包含在非极性微环境(诸如微团结构的脂质核心)中导致强烈的荧光增强[Greenspan,P.et al.J Cell Biol 100(1985)965-973]。因此，相关于不同浓度的RNA微团与固定量的尼罗红染料的温育的荧光强度的增加表明在缓冲溶液中形成RNA微团(图2D)。与此相比，在没有脂质核心的对照pRNA-3WJ中未观察到荧光强度的显著增加(图2D)。

为了使pRNA-3WJ微团在体内化学稳定，在RNA链合成期间使用2’-F修饰的U和C核苷酸[Behlke,M.A.Oligonucleotides.18(2008)305-319；Vestweber,H.et al.SyntheticMetals 68(1995)263-268]。所述2’-F修饰的RNA纳米颗粒被证明是化学稳定的并且与其未修饰的RNA对应物相比显示更长的循环半衰期[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology6(2011)658-667；Behlke,M.A.Oligonucleotides.18(2008)305-319]。2’-F核苷酸的存在不仅使RNA纳米颗粒耐受RNA酶降解，而且还增强了pRNA-3WJ的解链温度[Binzel,D.W.etal.Biochemistry 53(2014)2221-2231]，而不损害所述核心和并入的模块的真实折叠和功能性[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667；Liu,J.et al.ACS Nano 5(2011)237-246]。

进一步测定pRNA-3WJ配方相对于pH(酸性pH 4、中性pH 7.4，和碱性pH 12)和温度(4℃、37℃，和65℃)的稳定性。结果表明，pRNA-3WJ微团在宽范围的温度和酸性及中性条件下是稳定的。尽管如图8所报告，pRNA-微团在碱性条件下显示解离，但pRNA-3WJ微团配方在生理条件下(pH 7.4，37℃)是明显化学和热力学稳定的。

通过“点击化学”合成缀合紫杉醇的RNA链

为了给pRNA微团负载治疗模块，首先用-叠氮(-N3)官能化PTX，以便进一步与炔修饰的RNA反应。在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)存在下，在无水二氯甲烷中，使用6-叠氮基己酸接头通过酯化作用将2’-OH上的叠氮基引入PTX，以提供叠氮官能化的PTX(PTX-N3)作为主要产物(图9A)。尽管在PTX的7’和2’位置上的两个羟基都是化学反应性的，但是2’-OH通常显示比7’-OH更高的反应性，因为7’-OH乙酰化在水性介质中非常不稳定，快速丢失C-7取代基[Skwarczynski,M.et al.J Med.Chem 49(2006)7253-7269]。纯化后以73％的产率获得在2’位置具有功能性的PTX-N3。采用¹H NMR质谱以确认CDCl₃中的PTX-N3的化学结构。在PTX-N3的¹H NMR质谱中，7’-CH在4.40ppm处共振，并且在酯化作用之前和之后都没有观察到7-CH-OH信号(在4.4ppm处)发生显著的化学位移变化(图9B)，而2’-CH质子的共振从4.78ppm(在酯化作用之前)位移至5.46ppm(在酯化作用之后)(图9C)。

如图3A所示，通过铜I介导的点击反应，PTX-N3以高于90％的效率与-炔修饰的RNA(a3WJ)反应。通过20％的8M尿素PAGE(图3B)和质谱法确认成功的缀合。通过质谱法测定的a3WJ-PTX的实验质量为6939.2(m/z)，其与基于化学结构(图3C)计算的理论质量(6936.82(m/z))接近。紫杉醇和RNA之间形成的酯键可以在酯酶存在下或在水溶液中水解，这允许如通过体外药物释放测定所指示的那样以可控方式缓慢释放所负载的药物(图3A，3D)。这是用化疗药物紫杉醇“点击”RNA分子的第一次报道。PTX缀合不干扰pRNA-3WJ的逐步组装(图10A)。这也是第一次证明通过融合至RNA寡核苷酸而提高紫杉醇的水不溶性。与在DEPC H₂O中使用等浓度的紫杉醇制备的混浊溶液相比，溶解在DEPC H₂O中的1mM RNA-紫杉醇缀合物显示澄清的溶液(图10B)。在缀合至RNA并组装成微团纳米结构之后紫杉醇显著改善的水溶性允许使用生理盐水溶液用于体内施用而不是用Cremophor EL配方。除了点击化学之外，使用其它化学偶联反应性基团，诸如-NH₂/-NHS-NH₂/-COOH,或者-SH/-马来酰亚胺对RNA寡聚核苷酸和候选药物进行官能化也是可行的RNA-药物缀合方法，其能够被应用于不适合点击化学的药物候选物。

临界微团形成浓度的确定

为了确定pRNA-3WJ-PTX微团的临界微团形成浓度(CMC)，使用如先前所报道的尼罗红测定[Zhang,A.et al.Soft Matter 9(2013)2224-2233]。尼罗红是疏水性染料，其在水和其它极性溶剂中具有低荧光，但在非极性环境(例如微团的脂质核心)中发射强荧光。因此，尼罗红荧光发射强度被用作微团形成的指标。为了测定CMC，尼罗红的荧光强度被绘制成样品浓度的函数。如图11A所示，尼罗红在低于0.078μM的浓度下呈现低荧光强度，表明尼罗红在水中并且存在很少的微团。随着浓度的增加，荧光强度显著增加，表明尼罗红被包封在RNA微团的脂质核心中。CMC可被估算为具有相对恒定值的强度比例的水平线的切线与具有快速增加的强度比例的对角线的交点(图11B)。CMC为约100nM并且1％TAE琼脂糖凝胶由于灵敏度限制进一步确认CMC为约150nM(图11C)。在体外和体内实验中使用的所有pRNA微团浓度均高于CMC以确保微团形成。

pRNA-3WJ-PTX微团结合并内化到KB细胞中

为了体外测定肿瘤细胞靶向，将pRNA-3WJ-PTX微团和不含有亲脂性模块的对照pRNA-3WJ-PTX与KB细胞温育，胰蛋白酶化，洗涤，然后通过荧光激活的细胞分选(FACS)测定进行分析。与pRNA-3WJ-PTX骨架对照(0％结合)相比，观察到pRNA-3WJ-PTX微团具有强结合(几乎100％)(图4A)。共聚焦显微镜成像进一步确认pRNA-3WJ-PTX微团有效结合并和内化至癌细胞中，如荧光RNA纳米颗粒(图4B)和细胞质(图4B)的极好重叠所证明。对于不含有亲脂性模块的对照pRNA-3WJ-PTX，观察到非常低的信号。这些结果表明RNA微团对癌细胞结合具有高亲和力。尽管目前的RNA微团设计不包括肿瘤特异性靶向模块，但是高度带电的RNA微团(因为RNA带负电荷，在ζ电位研究中也显示)能够类似于如先前报道的DNA微团，在与细胞相互作用时自身崩解并***细胞膜中[Liu,H.et al.Chemistry 16(2010)3791-3797]。不受理论的束缚，相信RNA微团的内化可能是通过***细胞膜之后随后的胞吞作用介导。

pRNA-3WJ-PTX微团在对癌细胞生长和凋亡的体外影响

为了测定RNA微团处理的细胞效应，实施MTT测定以分析处理后的细胞活力。与单独RNA微团和不含有紫杉醇缀合物的3WJ对照相比，含有PTX的RNA微团可以在250nM或以上成功地抑制肿瘤细胞生长(图5A)。未评估低于125nM的浓度以保持在CMC以上。由pRNA-3WJ-PTX微团引起的细胞生长抑制表明紫杉醇由于接头酯在水溶液中水解而从RNA链释放。由于所有的RNA-PTX缀合物都经历HPLC纯化，因此游离紫杉醇污染测试构建体的可能性非常小。此外，不含有紫杉醇负载的pRNA-3WJ微团对细胞活力和增殖没有影响，这表明RNA微团骨架的低细胞毒性及其作为安全的药物递送平台的潜力。

如图5B所示，FITC标记的膜联蛋白V染色确认大部分癌细胞死亡是由于细胞凋亡。损失细胞质膜是凋亡细胞中最早的特征之一。膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内层外化至外层使得FITC标记的膜联蛋白V结合PS以检测正在经历凋亡的细胞。FITC膜联蛋白V染色与PI配合使用以鉴定早期凋亡的细胞(Q3：PI阴性，FITC膜联蛋白V阳性)和处于晚期凋亡或已经死亡的细胞(Q2：FITC膜联蛋白V和PI阳性)。在我们的研究中，与不含有PTX的对照微团(4.52％)或不含有PTX的pRNA-3WJ(3.7％)相比，超过30％的细胞在用pRNA-3WJ-PTX微团处理48小时之后经历凋亡，这表明癌症活力变化是由于细胞凋亡的诱导。

Caspase-3是早期细胞凋亡标记。Caspase-3活性的增加与细胞凋亡密切相关。如通过增加的荧光强度所反映的Caspase-3活性的升高，在用pRNA-3WJ-PTX微团处理之后12小时出现(图12A-12F)。发现，与对照纳米颗粒(pRNA-3WJ微团和pRNA-3WJ)相比，pRNA-3WJ-PTX微团处理的细胞裂解物显示出与单独的紫杉醇类似的最高荧光发射，其表明细胞凋亡的诱导是以Caspase-3依赖性方式进行(图5C)。

通过使用NIR荧光pRNA-3WJ-PTX微团成像以特异性靶向异种移植动物模型中的肿瘤

通过在注射后的不同时间点收集裸鼠中的肿瘤异种移植物的原位荧光图像来研究pRNA-3WJ-PTX微团的肿瘤靶向效率。肿瘤区域的图像在注射后4小时变得容易确定(图6A-6D和图13)。从注射RNA微团的小鼠获得的正常组织、器官和肿瘤的离体图像显示注射后24小时拍摄的肿瘤显示最强的信号(图6E-6G)。图6H-6I显示RNA微团在体外结合并内化至癌细胞。流式细胞术比较处理1小时后对KB细胞的结合亲和力。共聚焦显微镜显示内化分布。蓝色：细胞核；绿色：细胞骨架；红色：RNA纳米颗粒。图6J-6L显示携带抗-miR21的RNA微团的体外研究。双-萤光素酶测定证明抗miR21递送到KB细胞。qRT-PCR显示miR21敲低对靶基因PTEN表达的影响。Caspase-3测定显示处理后诱导细胞凋亡。图6M-6N显示在具有异种移植物的小鼠中的体内生物分布研究。全身成像。注射后8小时的离体器官成像。图6O-6R显示RNA微团在具有异种移植物的小鼠中的体内治疗效果。5次注射过程中的肿瘤消退曲线(红色箭头显示注射日)。治疗期间小鼠体重曲线。qRT-PCR和Western印迹显示在体内递送抗miR21之后PTEN上调。在肿瘤积累动力学方面，RNA纳米颗粒在注射后4小时达到其最高积累，并且相比在健康的器官和组织在肿瘤中中保持更长，这表明构建的RNA微团的高的肿瘤靶向效率和肿瘤滞留能力。RNA微团的这种独特的肿瘤滞留行为表明该递送系统鉴于其纳米级的大小和颗粒形状而利用了EPR(增强的渗透性和滞留性)效应的优势。此外，RNA微团构建体显示可能由于其较大粒径的延长的肿瘤滞留。通过在所述RNA微团的空螺旋分支上包括诸如叶酸[Shu,D.et al.Nature Nanotechnology 6(2011)658-667；Lee,T.J.etal.Mol Ther.(2017)25(7):1544-1555；Zhang,H.et al.RNA19(2013)1226-1237；Rychahou,P.et al.Methods Mol Biol 1297(2015)121-135；Guo,S.et al.Gene Ther 13(2006)814-820]和RNA适体[Shu,D.et al.ACS Nano 9(2015)9731-9740；Binzel,D.etal.Molecular Therapy 24(2016)1267-1277；Pi,F.et al.Nanomedicine 13(2016)1183-1193]的肿瘤靶向模块，可以进一步保证RNA微团纳米颗粒的体内肿瘤靶向的特异性。

pRNA-3WJ微团未诱导或低诱导促炎性反应

促炎性反应可能潜在地由pRNA-3WJ微团配方中的RNA组分[Guo,S.et al.MolTher Nucleic Acids.2017 9:399-408]和胆固醇组分[Tall,A.R.et al.NatRev.Immunol.15(2015)104-116]二者诱导。为了解决这个顾虑，在体外和体内二者中评价pRNA-3WJ微团处理后促炎性细胞因子和趋化因子的产生。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是全身性炎症中涉及的细胞因子并且是造成急性期反应的细胞因子之一[Jaffer,U.et al.HSRProc Intensive Care Cardiovasc.Anesth.2(2010)161-175]。白介素6(IL6)是作为促炎性细胞因子和抗炎性肌细胞因子(myokine)二者的白介素。IL6在感染期间被分泌以刺激免疫应答[Scheller,J.et al.Biochim.Biophys Acta 1813(2011)878-888]。IFN-α干扰素(其属于I型干扰素)也是参与响应病毒病原体的存在而释放的促炎性反应的细胞因子。图7A中的结果显示，当与小鼠巨噬细胞样细胞体外温育时，与LPS阳性对照相比，高剂量(1μM)和低剂量(200nM)的pRNA-3WJ微团既不诱导IL6产生也不诱导IFN-α产生。TNF-α的诱导在低剂量的pRNA-3WJ-微团处理下检测不到，但在高剂量的RNA微团处理时略微增加。如图7B所示，与LPS对照相比，将pRNA-3WJ-微团体内注射到免疫活性的C57BL/6小鼠中后，所有三种细胞因子都不被诱导。

趋化因子是主要的促炎性介质[Wang,Z.M.et al.J Biol Chem 275(2000)20260-20267；Turner,M.D.et al.Biochim.Biophys Acta 1843(2014)2563-2582]。在pRNA-微团体内处理后，检测到25个趋化因子产量提高。如图7C所示的可以证明，与PBS组相比，pRNA-3WJ微团并未诱导新的趋化因子。如图14中通过红色框突出显示的，与PBS对照相比存在三种趋化因子(巨噬细胞炎性蛋白-1γ(MIP-1γ)、趋化因子10(C10)和单核细胞趋化蛋白2(MCP2))显示升高的诱导。总之，pRNA-3WJ微团配方未诱导或仅诱导非常低的促炎性应答。

总之，在这一实施例中尤其描述了基于良好定义的pRNA的微团的设计和构建，所述微团由疏水性脂质核心和亲水性pRNA-3WJ外冠(corona)组成。化疗药物紫杉醇已被加载到RNA微团中，具有显著提高的水溶性。也证明，加载紫杉醇的pRNA微团表现优异的肿瘤细胞结合和内化，以及在体外有效诱导对肿瘤的细胞毒性效果。在注射pRNA-微团后，也没有或有非常低的促炎性响应诱导。通过将pRNA微团全身注射到异种移植小鼠模型中实现了肿瘤靶向而不累积到正常的器官和组织中。图13显示pRNA-3WJ-PTX微团体内肿瘤靶向的时间过程。P：PBS；M-PTX：pRNA-3WJ-PTX微团。

分支的pRNA-3WJ外冠赋予无与伦比的多功能性，其可以以任何期望的组合被设计和构建。例如，可以通过在一个纳米颗粒中组合靶向、成像和治疗模块而构建多功能pRNA-3WJ微团。pRNA-3WJ微团还可以针对多个基因或一个基因的不同位置同时递送siRNA或微RNA以产生协同效应。此外，可以将不同类型的抗癌药物加载到一个pRNA-3WJ微团上，以通过组合疗法增强治疗效果或克服抗药性。因此，这一创新的基于RNA的微团纳米递送平台对临床应用具有巨大潜力。

实施例2：RNA纳米颗粒、三向接合、多分支或多臂RNA纳米结构携带多拷贝紫杉醇及其衍生物用于治疗癌症和其它疾病。

图15A至图19显示RNA纳米颗粒、三向接合、多分支或多臂RNA纳米结构以携带多拷贝紫杉醇及其衍生物用于治疗癌症和其它疾病。

实施例3：RNA-药物缀合

图20A至图24B显示RNA-泰素序列设计和药物缀合(图20A至图20C)、体外表征(图21A至21C)、热稳定性(TGGE&qPCR，图22A和22B)、体外毒性(图23)和动物试验中的治疗研究的结果(图24A和24B)。

图25A至图28显示RNA-CPT设计和药物缀合(图25A至图25C)、体外表征(组装凝胶和TGGE，图26A至图26C)，体外毒性(图27)，以及动物试验中的治疗研究的结果(图28)。

实施例4：热力学稳定的多层的分支的RNA纳米结构的计算机设计。

图29A至图31B显示具有不同的核心和螺旋的分支3WJ的设计(图29A和29B)、热稳定性(qPCR&TGGE，图30A至图30C)和酶稳定性(血清稳定性测定，图31A和31B)。

图32A至36B显示分支的3WJ的设计(图32A至图32C)、体外表征(凝胶电泳和DLS，图33A至图33C)、热稳定性(qPCR和TGGE，图34A和图34B)、酶稳定性(血清稳定性测定，图35A至35C)，以及屏蔽性质(细胞结合测定，图36A和图36B)。

设计

天然RNA结构元件(诸如phi29 3WJ基序)已进化几个世纪以服务于特定目的，其可以是用于生物功能的结构骨架或结构动态的元件。为了药物递送，期望这样的纳米级颗粒，其具有可调节尺寸和形状，具有高度的结构/热力学稳定性，以及在机体中携带高密度货物至特定靶标的能力，而不诱导免疫应答或毒性。

为了实现这一目的，设计了允许形成高度稳定的三维RNA纳米结构的平台，所述RNA纳米结构组装自3-9段单独的长度为16-120nt的合成寡核苷酸。可以使用固相合成来合成所述寡聚物，其允许位点特异性修饰并且因此掺入被修饰的核苷酸以1)增加酶稳定性，2)提高热力学稳定性，或者3)增加用于高密度货物连接的位点。每个寡聚物根据其特定的功能要求合成，并使用自组装以等摩尔浓度的所有组分链组装到所希望的纳米结构中。

为了实现从大量单独的链(3-9)高效自组装，寡聚物序列设计需要考虑一些概念：i)互锁域需要具有高度热力学稳定性，ii)序列需要是特异的，iii)寡聚物不应当具有强内部结构，和iv)货物分子与核心且彼此之间应具有足够的间隔。

互锁域的稳定性决定了最终3D结构的稳定性。由于每条链可以包含颗粒的不同模块(治疗、靶向、成像)，所以纳米结构有必要保持完整以递送所有模块。虽然这可以在线性双链寡聚物上实现，但使用更有序的结构提供了益处，诸如控制粒度和形状，其影响生物分布和EPR效应；保护货物在递送期间不被暴露，其允许递送疏水性分子；以及由于空间位阻而降低酶活性。为了实现更有序的结构，将寡聚物分成可以由或不由结构连接间隔开的至少两个互锁域。在我们的分支纳米结构中，通过实施例，每个寡聚物被分成三个结构域：5’DA、核心突起，和3’DA(图47C)。构成纳米结构的链的数量等于结构中DA结构域的数量。此外，DA结构域的数目等于纳米结构中的独立序列的数目。因此，任何3’DA的序列是一个特定的5’DA的反向互补序列，反之亦然。那么，8分支的纳米结构由8个独立的DA结构域限定，所述DA结构域通过合成的寡聚物的特定设计与它们的反向互补物互锁。那么寡聚物被设计为两种类型：延伸寡聚物和终止寡聚物。通过定义DA编号(1、2、…、9)以及序列是正常的还是其反向互补物(rev)，可以充分鉴定寡聚物。延伸寡聚物通常连接连续的DA域，例如12rev、23rev、34rev，而终止寡聚物通过用第一DA的反向互补物(如41rev)连接最后的DA而关闭循环，在这种情况下形成四面体排列的4-DA纳米结构(图47A-B)。类似地，12rev、23rev、34rev、45rev、56rev加上61rev可以形成6-DA纳米结构，与具有相等间距的DA域可围绕纳米颗粒核心组装成八面体排列(图47A)。

球形序列的计算导向的设计：

根据以上实施例，6-DA结构将使用与4-DA结构相同的某些序列(12rev、23rev、34rev)。因此，为了制造一系列3–9DA的纳米结构，需要8段延伸链和7段终止链。在计算方面上，这需要鉴定对于预定义长度(核苷酸数目)的9DA结构域的热力学稳定序列，确定希望的核心突起连接核苷酸，以及优化序列以实现最小的自互补性和交叉互补性，以实现热力学稳定的纳米结构的有效自组装。

在图48中概述了算法的流程。在第一步骤中，用户定义以下输入参数：1)DA域的数目，2)DA域的长度，3)连接域中核苷酸的同一性，4)DA域的解链温度(Tm)的范围，5)允许的GC含量的范围，6)允许的自互补性的百分比，7)允许的交叉互补性的百分比。

然后，该算法使用随机数生成来生成DA序列，并测试该序列是否落入期望的GC含量和TM范围内。如果序列落入范围内，则其被保存，并且重复该过程，直到已经确定25×#的DA序列。一旦已经鉴定了足够#的序列，就测试它们的自互补性。然后基于它们与其它所保存的DA序列的交叉互补性程度，对显示低自互补性的序列进行分类。然后用具有最低总体互补性的序列针对延伸寡核苷酸根据(seq1+UG_连接+seq2_反向互补)和针对终止寡核苷酸根据(seq2+UG_连接+seq1_反向互补)来计算纳米结构链的序列。重新测试全长寡聚物链的自互补性和交叉互补性，以确保反向互补不会不利地影响序列的整体特异性。如果纳米结构序列通过QC测试，则它们被转化为RNA字母代码并保存到文件中，否则重复程序直到找到合适的寡聚物组。

图37A-37C显示基于分支3WJ的模块化RNA基序和具有不同臂数量的变体的设计和构建。图37A.不同的高度有序接合(核心)被用作模块化RNA基序的构建块。图37B.用于合成的模块化RNA基序的核苷酸序列。图37C.使用6WJ作为核心和4WJ作为臂(或分支)的模块化RNA基序之一的3D结构。

图38A至图38G显示3WJ(图38A)、4WJ(图38B)、5WJ(图38C)、6WJ(图38D)、7WJ(图38E)、8WJ(图38F)和9WJ(图38G)模块化RNA基序的2D结构，显示了合成的RNA寡核苷酸序列的实例。

图39A至图39C显示各种模块化RNA基序的热稳定性。图39A.qPCR显示退火曲线。图39B.TGGE显示解链曲线。图39C.模块化RNA基序退火和解链的Tm比较。

图40A和图40B显示基于分支3WJ的模块化RNA基序的体外表征。图40A.大小比较凝胶：2％琼脂糖凝胶，显示4-6WJ(从左到右：分子量标准、phi29-3WJ、单体、二聚体、三聚体、4WJ、5WJ、6WJ)的组装。图40B.通过动态光散射(DLS)测量的4-6WJ的大小分布。

使用本实施例中描述的方法产生的示例性序列。

12REV

GACUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG(SEQ ID NO:1).

23REV

CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC(SEQ ID NO:2).

31REV

GGGAACAGUACCACAACUAGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:3).

34REV

GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA(SEQ ID NO:4).

41REV

UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:5).

45REV

UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCUCCGCAUGAUGAAUACAGC(SEQ ID NO:6).

51REV

GCUGUAUUCAUCAUGCGGAGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:7).

56REV

GCUGUAUUCAUCAUGCGGAGUGGGCAUUGGGAUCGUAUGAGC(SEQ ID NO:8).

61REV

GCUCAUACGAUCCCAAUGCCUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:9).

67REV

GCUCAUACGAUCCCAAUGCCUGAACAAACAGAGCAAGCCUCC(SEQ ID NO:10).

71REV

GGAGGCUUGCUCUGUUUGUUUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:11).

78REV

GGAGGCUUGCUCUGUUUGUUUGCGCGAUUUCCGCGUUACACA(SEQ ID NO:12).

81REV

UGUGUAACGCGGAAAUCGCGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:13).

89REV

UGUGUAACGCGGAAAUCGCGUGCCUGCUCGCGUACGUCUUAC(SEQ ID NO:14).

91REV

GUAAGACGUACGCGACGAGGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC(SEQ ID NO:15).

a3WJ

UUGCCAUGUGUAUGUGGG(SEQ ID NO:16).

b3WJ

CCCACAUACUUUGUUGAUCC(SEQ ID NO:17).

c3WJ

GGAUCAAUCAUGGCAA(SEQ ID NO:18).

aPhi29-Mod

AUUCGCUGUGUGGUAGUG(SEQ ID NO:19)

bPhi29-Mod

CACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ ID NO:20).

cPhi29-Mod

CGUAGGACCAGCGAAU(SEQ ID NO:21).

aPhi29-30

GCGUGCUGUGUGCUACCG(SEQ ID NO:22).

bPhi29-30

CGGUAGCACUUUGCUGUGCG(SEQ ID NO:23).

cPhi29-30

CGCACAGCCAGCACGC(SEQ ID NO:24).

aSF5-30

GCGUGCUGGUGCUACCG(SEQ ID NO:25).

bSF5-30

CGGUAGCACGGGCUGUGCG(SEQ ID NO:26).

cSF5-30

CGCACAGCCAGCACGC(SEQ ID NO:27)

aM2-30

GCGUGCUGGUGCUACCG(SEQ ID NO:28).

bM2-30

CGGUAGCACCGCUGUGCG(SEQ ID NO:29).

cM2-30

CGCACAGCCUCAGCACGC(SEQ ID NO:30).

aPhi29-32

ACGCGACGUGUGCAUGCC(SEQ ID NO:31).

bPhi29-32

GGCAUGCACUUUGCGUUGCG(SEQ ID NO:32).

cPhi29-32

CGCAACGCCGUCGCGU(SEQ ID NO:33).

aSF5-32

ACGCGACGGUGCAUGCC(SEQ ID NO:34)

bSF5-32

GGCAUGCACGGGCGUUGCG(SEQ ID NO:35)

cSF5-32

CGCAACGCCGUCGCGU(SEQ ID NO:36).

aM2-32

ACGCGACGGUGCAUGCC(SEQ ID NO:37)

bM2-32

GGCAUGCACCGCGUUGCG(SEQ ID NO:38)

cM2-32

CGCAACGCCUCGUCGCGU(SEQ ID NO:39)

Mod-a/WT-b

AUUCGCUGUGUGGUAGUGCCCACAUACUUUGUUGAUCC(SEQ ID NO:40)

Mod-b/WT-b

CACUACCACUUUGUCCUACGCCCACAUACUUUGUUGAUCC(SEQ ID NO:41)

Mod-c/WT-b

CGUAGGACCAGCGAAUCCCACAUACUUUGUUGAUCC(SEQ ID NO:42)

30a/Mod-b

GCGUGCUGUGUGCUACCGCACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ ID NO:43)

30b/Mod-b

CGGUAGCACUUUGCUGUGCGCACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ ID NO:44)

30c/Mod-b

CGCACAGCCAGCACGCCACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ ID NO:45)

Ext30-a/Mod-b

CCUAUUCAGGUGCGUGCUGUGUGCUACCGAUGUAAUUCAACACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ IDNO:46)

Ext30-b/Mod-b

UUGAAUUACAUCGGUAGCACUUUGCUGUGCGAGGCUGAACAGCACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ IDNO:47)

Ext30-c/Mod-b

CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGCACUACCACUUUGUCCUACG(SEQ ID NO:48)

WT-b/Mod-a

CCCACAUACUUUGUUGAUCCAUUCGCUGUGUGGUAGUG(SEQ ID NO:49)

WT-b/Mod-c

CCCACAUACUUUGUUGAUCCCGUAGGACCAGCGAAU(SEQ ID NO:50)

SF5-4WJ-a

UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA(SEQ ID NO:51)

SF5-4WJ-b

UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG(SEQ ID NO:52)

SF5-4WJ-c

CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG(SEQ ID NO:53)

SF5-4WJ-d

CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA(SEQ ID NO:54)

实施例5用于成像的纳米结构

图49A-49C.荧光团缀合至核酸纳米结构(在本文中也被称为纳米颗粒)用于体内癌症成像。图49A.PAGE分析证明RNA寡聚物和纳米颗粒可以携带多色荧光材料。图49B.组装凝胶显示寡聚物可以在用荧光团修饰之后高效组装。图49C.与ICG荧光团偶联的Phi29 3WJ纳米颗粒的生物分布。

图50A-50C.DOTA螯合剂高密度缀合至RNA寡聚物和纳米颗粒。图50A-50B.胺修饰的且DOTA缀合的寡聚物组装到RNA纳米颗粒中。图50B-50C.具有和不具有螯合的Gd³⁺的、具有不同密度的DOTA缀合物的RNA纳米颗粒的比较。

图51A-51C.NOTA螯合剂高密度缀合至寡聚物和纳米颗粒。图51A.NOTA螯合Cu64至RNA纳米颗粒用于PET成像的示意图。图51B-51C.NOTA缀合的RNA纳米颗粒的组装凝胶和反相HPLC纯化。

图52A-52E显示具有多个醛基团以缀合用于pH响应药物释放的药物的pRNA链的设计和合成。图52A.多种药物在3WJ核心上缀合的示意图。图52B携带游离胺基基团用于亚胺键连接的药物实例。图52C.携带羟基基团用于缩醛连接的药物实例。图52D.使用肼键的pH敏感性接头设计实例。图52E.将PI103前药缀合至核酸寡聚物的酸不稳定接头实例。

图53A至图53H显示用于递送用于癌症治疗的厄洛替尼的基于RNA的热稳定性微团的设计和制备。图53A.用于形成RNA微团的具有可调节疏水修饰的两亲性RNA链。图53B.与功能部分缀合的RNA-生育酚微团的图示。图53C-53H.具有可调节疏水修饰的5个两亲性RNA链的临界微团浓度测定。

图54A-54Q显示用于抑制KB肿瘤异种移植物生长的CPT-RNA缀合物的设计和制备。图54A-54C.CPT-RNA缀合。

图54B-54D.通过缀合至RNA的药物增溶。图54C-54H.携带CPT的RNA纳米颗粒的组装、热力学稳定性和大小分布。图54D-54I.CPT从RNA纳米颗粒的释放图谱。图54J-54K.CPT-RNA纳米颗粒的细胞结合和内化。图54L-54M.CPT RNA纳米颗粒的细胞毒性和凋亡效应。图54N-54P.CPT RNANP在KB肿瘤异种移植小鼠模型中的肿瘤抑制。

序列表

<110> 俄亥俄州立创新基金会

<120> RNA纳米结构，其制备方法和用途

<130> 321501-2160

<150> US 62/628591

<151> 2018-02-09

<150> US 62/755696

<151> 2018-11-05

<160> 54

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 12rev

<400> 1

gacuauaugu uaggccuggg ugaguccuug cgucuucuac cg 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 23rev

<400> 2

cgguagaaga cgcaaggacu ugcuaguugu gguacuguuc cc 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 31rev

<400> 3

gggaacagua ccacaacuag ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 34rev

<400> 4

gggaacagua ccacaacuag ugucccggga uagggacaua ca 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 41rev

<400> 5

uguauguccc uaucccggga ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 45rev

<400> 6

uguauguccc uaucccggga ugcuccgcau gaugaauaca gc 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 51rev

<400> 7

gcuguauuca ucaugcggag ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 56rev

<400> 8

gcuguauuca ucaugcggag ugggcauugg gaucguauga gc 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 61rev

<400> 9

gcucauacga ucccaaugcc ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 67rev

<400> 10

gcucauacga ucccaaugcc ugaacaaaca gagcaagccu cc 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 71rev

<400> 11

ggaggcuugc ucuguuuguu ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 78rev

<400> 12

ggaggcuugc ucuguuuguu ugcgcgauuu ccgcguuaca ca 42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 81rev

<400> 13

uguguaacgc ggaaaucgcg ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 89rev

<400> 14

uguguaacgc ggaaaucgcg ugccugcucg cguacgucuu ac 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 91rev

<400> 15

guaagacgua cgcgacgagg ugcccaggcc uaacauauac uc 42

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 a3WJ

<400> 16

uugccaugug uauguggg 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 b3WJ

<400> 17

cccacauacu uuguugaucc 20

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 c3WJ

<400> 18

ggaucaauca uggcaa 16

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aPhi29-Mod

<400> 19

auucgcugug ugguagug 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bPhi29-Mod

<400> 20

cacuaccacu uuguccuacg 20

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cPhi29-Mod

<400> 21

cguaggacca gcgaau 16

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aPhi29-30

<400> 22

gcgugcugug ugcuaccg 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bPhi29-30

<400> 23

cgguagcacu uugcugugcg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cPhi29-30

<400> 24

cgguagcacu uugcugugcg 20

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aSF5-30

<400> 25

gcgugcuggu gcuaccg 17

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bSF5-30

<400> 26

cgguagcacg ggcugugcg 19

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cSF5-30

<400> 27

cgcacagcca gcacgc 16

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aM2-30

<400> 28

gcgugcuggu gcuaccg 17

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bM2-30

<400> 29

cgguagcacc gcugugcg 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cM2-30

<400> 30

cgcacagccu cagcacgc 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aPhi29-32

<400> 31

acgcgacgug ugcaugcc 18

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bPhi29-32

<400> 32

ggcaugcacu uugcguugcg 20

<210> 33

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cPhi29-32

<400> 33

cgcaacgccg ucgcgu 16

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aSF5-32

<400> 34

acgcgacggu gcaugcc 17

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bSF5-32

<400> 35

ggcaugcacg ggcguugcg 19

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cSF5-32

<400> 36

cgcaacgccg ucgcgu 16

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 aM2-32

<400> 37

acgcgacggu gcaugcc 17

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 bM2-32

<400> 38

ggcaugcacc gcguugcg 18

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 cM2-32

<400> 39

cgcaacgccu cgucgcgu 18

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Mod-a/WT-b

<400> 40

auucgcugug ugguagugcc cacauacuuu guugaucc 38

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Mod-b/WT-b

<400> 41

cacuaccacu uuguccuacg cccacauacu uuguugaucc 40

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Mod-c/WT-b

<400> 42

cguaggacca gcgaauccca cauacuuugu ugaucc 36

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 30a/Mod-b

<400> 43

gcgugcugug ugcuaccgca cuaccacuuu guccuacg 38

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 30b/Mod-b

<400> 44

cgguagcacu uugcugugcg cacuaccacu uuguccuacg 40

<210> 45

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 30c/Mod-b

<400> 45

cgcacagcca gcacgccacu accacuuugu ccuacg 36

<210> 46

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Ext30-a/Mod-b

<400> 46

ccuauucagg ugcgugcugu gugcuaccga uguaauucaa cacuaccacu uuguccuacg 60

<210> 47

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Ext30-b/Mod-b

<400> 47

uugaauuaca ucgguagcac uuugcugugc gaggcugaac agcacuacca cuuuguccua 60

cg 62

<210> 48

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 Ext30-c/Mod-b

<400> 48

cuguucagcc ucgcacagcc agcacgcacc ugaauaggca cuaccacuuu guccuacg 58

<210> 49

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 WT-b/Mod-a

<400> 49

cccacauacu uuguugaucc auucgcugug ugguagug 38

<210> 50

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 WT-b/Mod-c

<400> 50

cccacauacu uuguugaucc cguaggacca gcgaau 36

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 SF5-4WJ-a

<400> 51

uuagguaaag ccaccugcag gugcuaccga uguaauucaa 40

<210> 52

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 SF5-4WJ-b

<400> 52

uugaauuaca ucgguagcac gggcugugcg aggcugaaca g 41

<210> 53

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 SF5-4WJ-c

<400> 53

cuguucagcc ucgcacagcc agcacgcacc ugaauagg 38

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA寡核苷酸 SF5-4WJ-d

<400> 54

ccuauucagg ugcgugcugg gcugcaggug gcuuuaccua a 41